重组质粒的构建与转化
同源重组构建质粒原理及方法
同源重组构建质粒原理及方法一、引言同源重组构建质粒是基因工程领域的关键技术，它通过将外源基因片段与适当的质粒DNA相连接，实现外源基因的表达和遗传转移。
本文将详细介绍同源重组构建质粒的原理和方法，以及常用的实验步骤和注意事项。
二、原理同源重组构建质粒的原理是通过内切酶在两个同源DNA片段上切割，然后连接起来形成一个新的质粒DNA。
同源DNA片段通常由外源基因和质粒DNA提供，通过互补的粘性末端序列将它们连接起来。
三、方法以下是同源重组构建质粒常用的方法和步骤：1. 选择合适的质粒和酶切位点首先，需要选择一个适合的质粒，根据实验需要选择带有合适酶切位点的质粒。
同时，还需要选择适合的内切酶用于切割质粒和外源基因片段。
2. 切割质粒和外源基因片段将选择好的质粒和外源基因片段与相应的内切酶一起反应，将其切割为互补的粘性末端序列。
切割后的质粒和外源基因片段会留下粘性末端。
3. 进行连接反应将切割好的质粒和外源基因片段加入连接反应中，可以使用DNA连接酶来催化连接。
4. 转化宿主细胞将连接好的质粒转化到宿主细胞中，常用的方法有热擦法、电穿孔法和化学法等。
宿主细胞可以是大肠杆菌等常用的实验宿主细胞。
5. 筛选转化子将转化到宿主细胞中的质粒进行筛选，可以通过选择性培养基或进行基因标记（如荧光蛋白等）来筛选转化子。
四、注意事项在同源重组构建质粒过程中，需要注意以下事项：1. 同源重组效率同源重组的效率是影响质粒构建成功率的关键因素。
需要合理选择酶切位点，确保质粒和外源基因片段有足够的同源性。
2. DNA连接酶的选择DNA连接酶的选择也是非常重要的。
不同的DNA连接酶在连接效率和酶切位点的要求上有所区别，选择适合的连接酶能提高连接效率。
3. 转化宿主细胞选择转化宿主细胞的选择也会影响质粒构建的成功率。
不同的宿主细胞对质粒的转化效率和表达能力有所不同，需要根据实验要求选择合适的宿主细胞。
4. 合理设计实验对照组为确保实验结果的可靠性和准确性，需要设计适当的对照组，验证质粒构建的成功性和外源基因的表达情况。
重组质粒的构建
重组质粒的构建重组质粒的构建是基因工程的核心步骤之一，其目的是将目的基因插入到质粒载体中，以实现目的基因的稳定表达和克隆化。
以下是重组质粒构建的主要步骤：1.目的基因获取首先需要获取目的基因。
目的基因可以从基因文库、PCR、基因组测序等方法中获取。
根据需要选择合适的方法，将目的基因克隆到质粒载体中。
2.载体质粒选择选择适合的质粒载体是重组质粒构建的关键步骤之一。
根据目的基因的特点和表达要求，选择适合的质粒载体。
常见的质粒载体有pET、pUC、pBluescript等。
3.限制性酶切限制性酶切是重组质粒构建的重要步骤之一。
通过限制性酶切，将目的基因和质粒载体分别切开，露出粘性末端，以便于连接反应。
4.连接反应将切好的目的基因和质粒载体的粘性末端连接在一起，形成重组质粒。
连接反应需要使用T4DNA连接酶或其它连接酶进行催化。
连接反应需要在适宜的温度和pH 条件下进行一定时间，以确保重组质粒的正确构建。
5.转化宿主细胞将连接反应得到的重组质粒转化到宿主细胞中。
常见的宿主细胞有细菌、酵母、昆虫等。
转化方法有多种，如电穿孔法、化学转化法等。
转化后需要在适宜的培养条件下进行培养，以获得大量的重组质粒。
6.克隆筛选克隆筛选是重组质粒构建的重要步骤之一。
通过克隆筛选，可以确定重组质粒是否正确构建。
常见的克隆筛选方法有蓝白斑筛选、酶切法等。
7.序列验证最后需要对重组质粒进行序列验证，以确保目的基因的正确插入和序列的准确性。
序列验证可以通过Sanger测序等方法进行。
重组质粒的构建
连接酶催化DNA连接的最佳反应温度是37℃
▪ DNA重组技术中的核心是DNA片段之间的体外连接方案
DNA连接酶及连接机制
1 ） ATP 通 过 磷 酸 基 团 与 T4 DNA连接酶中的亮氨酸形成 磷酸-氨基键，从而形成酶ATP复合物；
限制性内切酶
具备多个限制酶的 识别位点（多克隆位 点） ，以便外源DNA的 插入与截取。
多种酶切口 单一酶切口 多克隆位点
或具备特异的重组 位点
11
载体的选择与改造应具备的条件
3.具有合适的筛选标记
具有遗传表型或筛选 标记，以区别阳性重组分子 和阴性重组分子，主要有抗 药性基因、酶基因、营养缺 陷型及形成噬菌斑的能力等。
二、基础知识
2. 重组DNA技术的基本过程
（1）目的基因的获得 （2）载体的选择与制备 （3）目的基因与载体的结合（DNA分子的体外连接） （4）重组DNA导入受体 （5）重组体筛选和鉴定 （6）目的基因表达 （7）基因产物的分离纯化
DNA重组操作过程
ab
剪切
载体
重组
B
引入宿 主细胞
Ab
抗性筛选
T载体
▪ 一般采用的方法是先把载体用某种限制性内切酶消化成平 头，再在70℃或72℃下在只加入dTTP的反应体系中用Taq DNA聚合酶处理半小时（也有人报道处理1～2小时能提高克隆效 率，这样加T反应会更彻底）。也可以用末端转移酶来完成加T 反应。载体自连、PCR产物串连可以忽略。
▪ 如果使用ddTTP，效果会更好。
实验二 重组质粒的构建
一、实验目的
▪通过本实验学会琼脂糖凝胶DNA回收和重组 DNA连接的方法。
重组质粒标记基因筛选的原理
重组质粒标记基因筛选的原理引言：重组质粒标记基因筛选是一种常用的遗传工程技术，可以通过标记基因的引入和筛选，实现对特定基因的研究和应用。
该技术在基因克隆、基因表达、基因功能研究等领域具有广泛的应用价值。
本文将介绍重组质粒标记基因筛选的原理及其在科学研究和应用中的作用。
一、重组质粒构建重组质粒是指将目标基因或DNA片段插入到质粒中形成的一种重组DNA分子。
通常，重组质粒包括一个选择标记基因和目标基因或DNA 片段。
选择标记基因通常是一种能够在特定条件下表达的基因，例如抗生素耐药基因。
目标基因或DNA片段则是研究者所关注的基因或DNA序列。
二、质粒转化质粒转化是指将重组质粒导入到宿主细胞中的过程。
常用的转化方法包括热激转化、电穿孔转化、化学转化等。
转化后的细胞称为转化体。
三、筛选标记基因筛选标记基因的目的是为了筛选成功转化的细胞。
常用的筛选方法是将转化体培养在含有选择标记基因所对应抗生素的培养基中，只有成功转化的细胞才能够存活下来。
通过这种方法，可以获得带有选择标记基因的转化细胞。
四、目标基因筛选通过筛选标记基因，已经获得了转化细胞，但其中是否存在目标基因还需要进一步筛选。
常用的目标基因筛选方法包括PCR筛选、酶切筛选、Southern blotting等。
PCR筛选是一种便捷快速的方法，通过特异性引物扩增目标基因，检测扩增产物的存在与否。
酶切筛选则是利用酶切产物的大小差异来判断目标基因的存在与否。
而Southern blotting是一种较为精确的方法，通过DNA杂交的原理，检测目标基因的存在与否。
五、应用领域重组质粒标记基因筛选技术在科学研究和应用中有着广泛的应用。
在基因克隆中，通过将目标基因插入到质粒中，可以实现对基因的快速扩增和分离纯化。
在基因表达中，可以通过标记基因筛选成功转化的细胞，并进一步表达目标基因。
在基因功能研究中，可以通过标记基因筛选目标基因，进而研究基因的表达、调控和功能等方面。
ti质粒介导基因转移的过程
ti质粒介导基因转移的过程TI质粒介导基因转移是一种常用的植物基因工程技术，主要应用于将外源基因导入植物细胞中。
以下是TI质粒介导基因转移的基本过程：1. 构建重组质粒：首先，需要构建一个包含目标基因的重组质粒。
这个质粒通常由几个重要部分组成：T-DNA区域、选择标记基因和表达载体。
T-DNA区域是质粒中用于转移基因的DNA片段，其中包含目标基因和相关调控序列。
选择标记基因用于筛选成功转化的植株，通常是与抗性或荧光等特征相关的基因。
表达载体则包含启动子、终止子等元件，用于确保目标基因在植物细胞中正确表达。
2. 农杆菌感染：接下来，将构建好的重组质粒导入农杆菌（常用的是农杆菌株Agrobacterium tumefaciens）。
农杆菌具有天然的基因转移能力，可以将质粒中的T-DNA区域转移到植物细胞中。
3. 植物组织处理：将农杆菌含有重组质粒的培养基与目标植物的组织（如叶片、幼苗等）接触，使农杆菌能够感染植物细胞。
通常会在含有适当激素和营养物质的培养基上进行处理，以促进植物细胞的再生和增殖。
4. 选择和筛选：经过一段时间的培养，将植物组织转移到含有选择标记基因所需的选择剂（如抗生素）的培养基上。
只有成功转化的细胞或组织才能在含有选择剂的培养基上存活和生长，从而实现对转化植株的筛选。
5. 植株再生：经过筛选后，成功转化的细胞或组织将进一步培养和培育，以实现植株的再生。
这可以通过体外培养或组织培养技术来实现。
6. 验证和鉴定：最后，对获得的转化植株进行验证和鉴定。
这包括通过PCR、Southern blotting 等分子生物学方法来确认目标基因的存在，并通过表型观察来确定转基因植株是否具有预期的性状和特征。
通过以上步骤，TI质粒介导基因转移可以实现外源基因的导入和表达，从而为植物基因工程研究和应用提供了重要的工具和方法。
构建重组质粒基本方法
构建重组质粒基本方法重组质粒是一种重要的遗传工程工具，用于将外源基因导入到宿主细胞中，从而实现特定基因的表达与功能研究。
构建重组质粒的基本方法可以概括为：选择质粒骨架、引物设计与合成、PCR扩增外源基因片段、DNA连接与重组、质粒扩增与提取、质粒鉴定与筛选，以下分别进行详细介绍。
一、选择质粒骨架在构建重组质粒时，首先需要选择一个合适的质粒骨架。
质粒骨架是指一个可复制的质粒DNA分子，常见的质粒骨架有pUC、pBR322、pET等。
质粒骨架上通常包含有宿主细胞可以识别的起始子和起始子附近的终止子，用于启动和终止转录过程，同时还包含选择标记基因，如抗生素抗性基因，以及其他在分子克隆中常用的诸如多克隆位点、限制酶切位点等。
二、引物设计与合成在构建重组质粒时，需要利用引物来扩增并克隆外源基因片段。
引物一般是两条DNA可控引物，其中一条是正向引物，另一条是反向引物。
引物的设计需要注意以下几点：引物的长度通常为15-30个碱基对，引物应该具有合适的Tm值，并且在引物双链的末端至少有2个碱基对是纯G或纯C。
引物可以使用商业引物合成公司合成。
三、PCR扩增外源基因片段使用引物扩增外源基因片段是构建重组质粒的一个关键步骤。
PCR反应一般包括DNA模板、引物、dNTPs和DNA聚合酶。
根据需要，可以使用特异性引物对目标基因进行PCR扩增，然后通过凝胶电泳检查PCR产物长度和纯度，并使用PCR产物进行下一步处理。
四、DNA连接与重组将PCR扩增得到的外源基因片段与质粒骨架进行连接和重组。
连接通常通过使用限制酶切和连接酶来实现。
限制酶切是利用限制酶切剪切DNA，生成具有互补粘性末端的DNA片段，然后将外源基因片段与质粒骨架进行连接。
连接酶可以使DNA片段之间的末端骨架参与phosphodiester结合反应，从而形成连体分子。
五、质粒扩增与提取将重组质粒转化到宿主细胞中，通过培养和培养基筛选来扩增质粒。
质粒扩增一般在含有抗生素的琼脂糖平板上进行，抗生素可以选择对宿主细胞有毒作用但不对重组质粒有毒的抗生素。
重组质粒的作用
重组质粒的作用质粒是细胞质外发生的一种细小的圆环状DNA分子。
在生物技术领域，重组质粒具有广泛的应用，它们可以作为载体用于植入外源基因，进而导致目的基因表达。
以下是围绕“重组质粒的作用”所写的文章，从分步骤阐述其作用。
第一步：制备重组质粒制备重组质粒的第一步是提取质粒DNA，其中包含了从细胞中复制的DNA序列。
同时，人工设计的DNA片段也会被构建，通过高效的DNA连接技术，将重组的DNA片段连接到质粒DNA上，形成一个新的、带有目的性基因的重组质粒。
这种方法可以为生命科学研究和技术开发提供一个有力的手段。
第二步：克隆重组质粒在制备完重组质粒后，还需要将其克隆到宿主细胞中。
细胞质内的质粒可以自我复制，且重组质粒携带的外源基因可以被细胞读取和表达，并可传递给后代。
克隆过程中，人们通常会选择大肠杆菌作为宿主细胞，因为大肠杆菌是一种常用且广泛研究得到的细菌，可以轻松地转化和繁殖重组质粒。
第三步：表达重组蛋白克隆后的重组质粒需要在宿主细胞中表达，以产生所需的目的性蛋白。
在此过程中，质粒绕着核框蛋白的结构形成一个紧凑的DNA螺旋状物，进而参与到基因的表达中。
在表达基因的过程中，基因序列被转录为RNA，随后转化为相应的蛋白质。
人们可以通过分离和纯化蛋白工艺，获得所需的目的性蛋白，并在生命科学及医学领域中得以进一步应用。
综上所述，重组质粒在生物技术领域中具有非常广泛的应用，可以作为基因转移载体，用于植入外源基因，实现特定蛋白的表达，完成诊断或治疗目标。
同时，人们还可以使用这种技术来开发新药、改良传统药物和治疗疾病。
因此，重组质粒将继续为人类医学和生命科学发展做出重要贡献。
重组质粒的概念
重组质粒的概念重组质粒是指通过DNA技术，将外源基因或DNA片段插入到质粒中，并使其在宿主细胞中复制和表达的过程。
重组质粒常用于基因工程研究、基因克隆及蛋白表达等领域，具有广泛的应用价值。
重组质粒通常由一个或多个外源DNA序列插入到质粒的多个位点上，插入的DNA序列可以来自同一种生物体，也可以来自不同种生物体。
质粒是一种环状的DNA分子，可以自由地在细胞内复制和传递。
在细胞复制过程中，质粒会被复制成多个复制体，并将其传递给子细胞。
质粒通常由多个重要元素组成，其中最重要的是载体序列和选择标记。
载体序列是质粒中的DNA序列，在质粒复制和传递过程中起到重要的作用。
载体序列通常包括起始位点、终止位点和复制起始区域等，这些序列协助控制质粒的复制和分离过程。
选择标记是质粒中的DNA序列，可以帮助鉴别哪些细胞获得了重组质粒。
选择标记常用于筛选具有重组质粒的细胞，例如抗生素抗性基因。
只有带有选择标记的细胞可以生存和繁殖，从而筛选出带有重组质粒的细胞。
重组质粒的构建通常包括以下步骤：1.选择合适的质粒：根据实验需要和目标生物体，选择合适的质粒作为载体。
常用的质粒有pUC19、pBR322等。
2.选择合适的外源DNA序列：根据实验目的，选择合适的外源DNA序列。
这些DNA序列可以来自某个生物体的基因，或者是重组技术合成的特定DNA片段。
3.设计引物和酶切位点：设计引物，可以通过PCR扩增外源DNA序列，并设计酶切位点，以便将外源DNA插入到质粒上。
4.酶切和连接：通过限制性内切酶酶切质粒和外源DNA，生成具有互补末端的DNA片段。
然后使用DNA连接酶将外源DNA和质粒连接起来。
5.转化：将重组质粒转化到宿主细胞中。
常用的宿主细胞有大肠杆菌、酵母菌等。
可以通过热激转化、化学转化或电转化等方法将重组质粒引入到宿主细胞内。
6.筛选：通过选择标记，筛选出带有重组质粒的细胞。
通常使用抗生素筛选法，将带有抗生素抗性基因的重组质粒引入到宿主细胞中，只有带有重组质粒的细胞能够在富含抗生素的培养基中生长。
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实验目的1.学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能用限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。
2.学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。
3.学习利用T4 DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。
4.掌握利用Cacl2制备感受态细胞的方法。
5.学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。
6.学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。
7.学习并掌握使用Omaga试剂盒抽提质粒的方法及进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA片段。
实验原理：（一）限制性核酸内切酶的酶切反应体外构建重组DNA分子，首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能在目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源供体DNA时不能得到完整的目的基因。
其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。
常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。
本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA 片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。
在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。
单酶切法简单易行，但是后期筛选工作比较复杂。
各种限制性内切酶都有其最佳反应条件，最主要的因素是反应温度和缓冲液的组成。
在双酶切体系中，如果两种酶对盐离子的浓度和温度要求一致，原则上可以将这两种酶同时加入一个反应体系中同步酶切；如果不一致，则酶切反应最好分步进行，常用的酶切顺序是：先低盐后高盐，先低温后高温。
酶切与连接是两个密切相关的步骤，要达到高效率的连接，必须酶切完全，酶切的DNA数量要适当。
另外，酶切反应的规模也取决于需要酶切的DNA的量，以及相应的所需酶的量。
一般的，酶切0.2~1.0µg的DNA分子时，反应体积约为15~20µg，DNA的量越大，反应体积可按比例适当放大。
酶的用量参照标准：一个标准单位酶能在指定的缓冲液系统和温度下，1h完全酶解1µg的pBR322 DNA分子。
如果酶活力低，可以适当增加酶的用量，但是最高不能超过反应总体积的10%。
因为限制性核酸内切酶一般是保存在50%甘油的缓冲液中，如果酶切反应体系中甘油的含量超过5%，就会抑制酶的活性。
（二）载体与外源DNA的连接反应连接反应总是紧跟酶切反应，外源DNA片段与载体分子连接的方法即DNA分子体外重组技术主要依赖限制性核酸内切酶和DNA连接酶催化完成的。
DNA连接酶催化两双链DNA片段相邻的5’-磷酸和3’-OH间形成磷酸二酯键。
在分子克隆中最有用的DNA连接酶是来自T4噬菌体的T4 DNA连接酶，它可以连接黏性末端和平末端。
连接反应时，载体DNA和外源DNA的摩尔数之比控制在1:（1~3）之间，可以有效地解决DNA多拷贝插入的现象。
实际操作中，反应温度介于酶作用速率和末端结合速率之间，一般是16℃，平末端适当提高连接反应温度。
反应时间与温度有关，随温度的提高，反应速度增加，所需时间会相应减少，16℃下最常用的连接时间为12-16h。
（三）感受态细胞的制备及质粒转化构建好的重组DNA转入感受态细胞中进行表达的现象就是转化。
能进行转化的受体细胞必须是感受态细胞，即受体细胞最容易接受外源DNA片段实现转化的生理状态，它决定于受体菌的遗传特性，同时与菌龄、外界环境等因素有关。
人工转化是通过人为诱导的方法使细胞具有摄取DNA的能力，或人为地将DNA导入细胞内，该过程与细菌自身的遗传控制无关，常用热击法，电穿孔法等。
能否实现质粒DNA的转化还与受体细胞的遗传特性有关，所用的受体细胞一般是限制修饰系统的缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2法，制备好的感受态细胞可以加入终浓度为15%的无菌甘油，-70℃可保存半年至一年。
经过CaCl2处理的细胞细胞膜通透性增加，允许外源DNA 分子进入。
在低温下，将携带有外源DNA片段的载体与感受态细胞混合，经过热击或电穿孔技术，使载体分子进入细胞。
进入受体细胞的外源DNA分子通过复制、表达，使受体细胞出现新的遗传性状。
将这些转化后的细胞在选择性培养基上培养，即可筛选出重组子。
本实验以E.coli- DH 5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理，使其处于感受态，然后将重组后的pUC19质粒在42℃下热击90s，实现转化。
（四）重组子的鉴定与外源基因的表达重组DNA进入宿主细胞后，必须使用各种筛选与鉴定手段区分转化子（接纳载体或重组DNA 分子的转化细胞）与非转化子（未接纳载体或重组DNA分子的转化细胞）。
而转化子又分为含有重组DNA的转化子（重组子）和仅含有空载体分子的转化子（非重组子）。
重组子含有的重组DNA分子中有期望重组子（含有目的基因的重组子）和非期望重组子（不含有目的基因的重组子）。
本实验中采用的方法是平板筛选法（α互补筛选原理）、电泳筛选法进行初步鉴定，进一步将采用PCR检测以及酶切验证进行较为准确的鉴定。
利用抗药性筛选原理可筛选出转化子。
质粒pUC19携带有氨苄青霉素抗性基因（Amp r）,在含有氨苄青霉素平板上筛选转化子，没有导入质粒pUC19的受体细胞，在含有氨苄青霉素的平板上不生长。
利用α互补筛选原理可筛选出转化子中的重组子与非重组子。
α互补筛选原理是根据菌落颜色筛选含有重组质粒的转化子。
据菌落颜色筛选含有重组质粒的转化子，利用β-半乳糖苷酶筛选系统来选择。
载体上带有一个来自大肠杆菌的lac操纵子的DNA区段，这一区段编码β-半乳糖苷酶氨基端的一个蛋白片段。
IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)可以诱导该片段的合成，而该片段能与宿主细胞所编码的β-半乳糖苷酶羧基端的一个蛋白片段互补(α互补)。
故暴露于诱导物IPTG的细菌含有编码lac Z基因的质粒可同时合成该酶的两种片段，该菌在麦康凯培养基上利用乳糖产酸生成红色菌落。
在外源DNA插人质粒的多克隆位点后，使编码β-半乳糖苷酶氨基端片段的基因失去作用，从而破坏了α互补作用，使重组子菌落显白色。
利用这种筛选方法可方便地将含目的基因的重组子筛选出来。
实验材料1.菌株： E.coli DH 5α2.培养基：LB培养基、麦康凯培养基3.试剂材料：酶切反应：（DNA pUC19 质粒，酶切10×buffer，Hin d Ⅲ,重蒸水，λDNA。
）连接反应：（酶切后的DNA（pUC19 质粒和λDNA），连接10×buffer，T4 连接酶，重蒸水。
）感受态细胞的制备：（0.1M CaCl2 ）转化：（连接液和感受态细胞，0.1M CaCl2，冰块。
）琼脂糖电泳：琼脂糖，TAE缓冲液（50×），上样缓冲液（10×），溴化乙锭（EB）染液。
4. 仪器器材：恒温振荡培养箱，高速冷冻离心机，漩涡振荡器，恒温水浴锅，Eppendorf管，微量移液器，培养皿，三角瓶，酒精灯，量筒，接种环，涂布器，电子天平，微波炉，电泳仪，制胶槽，电泳槽，凝胶成像检测仪，琼脂糖凝胶梳子，手套。
实验步骤（一）载体与外源片段限制性酶切反应1.在1.5ml的Eppendorf管中依次加入酶切反应的各种成分：表1 pUC19质粒及λDNA酶切反应体系试剂（用量单位：µl）pUC19(载体) λDNA（目的基因）pUC19（商品）重蒸水13.0 66.0 37.510×buffer 2.0 10.0 5.0DNA 3.5 15.0 5.0Hin dⅢ(1.5U/µl) 1.5 9.0 2.5总计20.0 100.0 50.0体系混匀后，1000rpm离心1min，37℃水浴2小时2.电泳检测：10.0µl样品+2.0µl loading buffer ，琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果。
（二）载体与外源片段连接反应1.在1.5ml的Eppendorf管中依次加入连接反应的各种成分：表2 连接反应体系编号试剂体积/µl1 ddH2O 3.22 10×Ligase Buffer 1.03 pUC19DNA/Hin dⅢ 1.2（1.0-1.5）4 λDNA/Hin dⅢ 3.8（3.5-4.4）5 T4-DNA连接酶0.8总计连接体系10.0适当离心，16℃水浴12-16小时pUC19/Hin dⅢ先60℃水浴10min，打开自连接，也可使酶备注Hin dⅢ失活，然后冰浴，再配置连接体系（三）感受态细胞的制备1. 甘油管E.coli DH5α（AP S)→接LB平板（过夜）→37℃，12-16小时→接单菌落于LB平板→37℃，过夜→划线于AP平板→37℃，过夜→不生长。
2. LB平板上挑单菌落至20ml LB培养基→37℃250rpm 过夜→取1%转至新20ml LB培养基→37℃180rpm 2-3小时→冰浴10min→收集菌体于两EP管→菌体离心4000rpm 5min→弃上清→再次补加菌液→离心4000rpm 5min→弃上清→涡旋细胞3. 加800µlCaCl2 (0.1M)→颠倒混匀→4000rpm离心5min→弃上清→加100µlCaCl2轻悬细胞（慢慢敲打）→冰浴20min→最终得到2管100µl感受态细胞（四）质粒转化1. 将上述制备好的感受态细胞分为三管，分别为50µl,50µl,100µl，对三管分别进行一下处理：受体菌对照组：50µl感受态细胞pUC质粒对照组：50µl感受态细胞+ pUC19质粒DNA 1.0µl重组质粒转化组：100µl感受态细胞+ 重组质粒5.0µl2. 用枪尖缓慢吹打混匀，三管均于冰上放置10min，在42℃水浴中热击90s，然后迅速置于冰上，质粒已经吸附到感受态细胞的表面，此时不能剧烈振荡，以增加转化效率；3.向上述3管中分别加入450µl(50µl管）和900µl（100µl管）新鲜的LB培养基，混匀后，37℃摇床培养1h，使受体菌恢复正常生长状态。
（五）稀释和涂布平板及重组质粒的初步筛选（AP+抗性筛选与α互补筛选法）1.无菌操作，将转化细胞溶液按以下操作涂布平板：⑴受体菌对照组：取50µl受体菌液分别涂布AP+和AP-的麦康凯培养基，各1个。