实验二 重组质粒的构建

实验二 重组质粒的构建

一、 实验步骤

1. 提取质粒DNA

2. 酶切（EcoRI+SpeI）

注意事项：

① 酶量， 反应时间及体积： One unit of enzyme is defined as

the quantity needed to cut 1μg of DNA in 50ul in one

hour。 反应时间的选择。一般酶切鉴定30分钟就可以了,如果酶减少，可延长反应时间（16h)；反应体系不应太小,常规的酶切一般要维持在10-50ul。酶的体积不要超过总体积的10%（甘油应在5%以下）。

② 酶的使用 ： 酶应永远放冰上，应是最后一个被加入到反应体系 中，用完后及时放回冰箱

③ DNA的制备：待切割的DNA应当已去除酚，氯仿，乙醇，EDTA, 去污剂或过多盐离子等

④ 缓冲液：不同酶需不同离子强度缓冲液， 使用前应将缓冲液完全

溶解并充分混匀。

⑤ 混匀：很重要，注意不可振荡

⑥ 反应温度：通常37 ℃

⑦ 终止反应：终止液，热失活，酚/ 氯仿抽提

⑧ 星号活性：在非理想条件下，内切酶切割与识别位点相似但不完全相同的序列。

3. : 酶切产物纯化 4. 连接

二、实验结果与分析

1.酶切结果检测

图1 EcoRI和SpeI双酶切GST-T及proB载体结果1%琼脂糖凝胶电泳检测图

注：M：DL5000DNAmarker；1号泳道;未酶切proB 质粒DNA；10、11号泳道：EcoRI和SpeI双酶切proB载体结果；16、17泳道：EcoRI和SpeI双酶切GST-T载体结果

分析：①由图1可知，1号泳道的未酶切proB质粒DNA未显示有条带，其原因可能是所点的未酶切proB标准品浓度过低，条带亮度过低难以识别。②10和11泳道中大小约为5000bp的较亮条带是proB载体，但有轻微拖尾现象，条带呈圆弧型，应该是因为点样量较大。经EcoRI和SpeI双酶切后，环状的质粒DNA被分成两个部分，分别为约5000bp和40bp的片段，其中40bp的小片段因分子量小，迁移速度快而跑出了琼脂糖凝胶，在图中无法看到。本次实验回收的是约5000bp的条带。③泳道16和17中约3000bp的较亮较粗条带是T载体，而约650bp的较细条带是被切下的GST，即本次实验回收的片段。

2..质粒DNA的浓度

经测定，本组的质粒DNA浓度如下表：

表1 提取的GST-T及proB质粒DNA浓度 质粒名称 浓度 (ng/μl)

GST-T 0.611

proB 6.175

分析：本次提取的质粒DNA浓度很低，proB质粒的浓度为6.175ng/ul；而GST-T质粒的浓度则低得多，为0.611ng/μl。造成提取的质粒浓度过低的原因可能是：①在进行酶切时所加的质粒DNA样品浓度较低。②在进行切胶回收时，未完全把DNA条带切下来，琼脂糖凝胶中残留了部分DNA条带。③ 加入的Buffer DE-A量过少，凝胶块未完全熔化，影响了DNA片段结合到DNA制备膜上的效率。④DNA 凝胶回收试剂盒的回收率较低，可能是Buffer DE-B（结合液）不能创造高盐低pH的环境，导致硅胶膜选择性地吸附DNA的效果不理想；或者是Buffer W2 concentrate（去盐液）创造的环境未能达到低盐浓度高pH，导致硅胶模释放DNA的效果不好，仍有较多DNA吸附在膜上，影响了DNA的回收率，导致浓度偏低。⑤加ddH2O洗脱时没有紧贴硅胶膜的正中央，膜没有完全被水覆盖，影响了DNA的洗脱效率。