重组质粒构建(protocol)
重组质粒的构建经验 [技巧]
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重组质粒的构建经验 [技巧]重组质粒的构建经验~~~昨天我在版中我看很多谷友询问重组质粒的构建问题，有些谷友说构建质粒需要一个月，甚至更长时间，这让我联想我刚做分子生物学时候的曲折。
重组质粒构建是常用的分子生物学手段，其实只是最基本的方法，一般一个星期同时构建三二个组质粒是没有问题的。
在国内先进的实验中，也大都是由实验员搞定。
但是其中还是有些基本的技巧需要掌握。
在这里将我的心得分享于大家，这也是我本人几年来一线工作时的经验积累，以期能为谷友提供借鉴，让大家在实验中少走弯路。
所涉及内容如下: 1) 克隆基因的酶切位点问题 2) 载体酶切的问题 3) 连接片段浓度比的问题在阐明上述问题同时，本人尽可能举些实验中的问题案例予以说明。
一、克隆基因的酶切位点问题 1、克隆位点选择的问题。
首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。
然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。
这是常识，不赘述。
2、保护碱基数目的问题。
在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。
但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。
这种忽视碰可能会大大影响后续的实验进展。
一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行;而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DNA片段上。
如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。
下面是我提供这类酶的列表及其所需最少的保护碱基数，相信下列将有助于大这家的实验设计。
NcoI 4 NdeI 6 NheI 3 NotI 8 PmeI 6SacI 3 SalI 3 SmaI 3 HindIII 3 BstI 8 SphI 4XhoI 3 XbaI 3 SmaI 4 案例分析一:本人最初曾选用NdeI克隆位点，未注意到保护碱基数目的问题，设计PCR引物时，引入NdeI酶切位点后，只加上两个保护碱基，一个月内没有进展，始终不能成功构建重组载体。
同源重组构建质粒原理
同源重组构建质粒原理
同源重组构建质粒原理是广泛应用的一种分子克隆技术，它是通过以一种支配者DNA （终受者）为被复制的物质，把它和稳定地选择自模板DNA（发起者）结构共同复制到新的DNA支配者中去来实现的，从而制备出一条含有模板DNA内容的载体，也就是质粒。
在这种构建质粒原理中，主要涉及到三个部分：基因组工程技术、质粒形成技术和载体技术，所有这些技术合一起来完成目标基因的表达。
在基因组工程技术里，利用保守酶以及脱氧核糖核酸酶将目标基因从来源物种中分离出来，并通过基因改造、基因重组来获得理想基因。
质粒形成技术是一种以DNA结合胞嘧啶为主的构建技术，大体来说，它主要是把所需要的基因引物酶及基因改造材料结合在一起形成质粒。
载体技术则是把质粒转移到另一种有定位作用的目标载体上，这样就可以准确选择和组装基因。
此外，在构建质粒过程中，还会加入一些酶，比如胞嘧啶去氧核糖核酸酶等，来有效促进和加强复制过程中质粒，协助把复制后的DNA片段定位与模板DNA上，形成可合成的质粒。
通过上述步骤，就可以把特定的基因克隆到所需的质粒中，从而完成对基因的表达分析，以及下一步的功能分析。
同源重组构建质粒原理在分子克隆技术中占有不可替代的重要地位，是决定新型载体能否稳定表达基因的关键技术。
重组质粒的构建
连接酶催化DNA连接的最佳反应温度是37℃
▪ DNA重组技术中的核心是DNA片段之间的体外连接方案
DNA连接酶及连接机制
1 ） ATP 通 过 磷 酸 基 团 与 T4 DNA连接酶中的亮氨酸形成 磷酸-氨基键，从而形成酶ATP复合物；
限制性内切酶
具备多个限制酶的 识别位点（多克隆位 点） ，以便外源DNA的 插入与截取。
多种酶切口 单一酶切口 多克隆位点
或具备特异的重组 位点
11
载体的选择与改造应具备的条件
3.具有合适的筛选标记
具有遗传表型或筛选 标记，以区别阳性重组分子 和阴性重组分子，主要有抗 药性基因、酶基因、营养缺 陷型及形成噬菌斑的能力等。
二、基础知识
2. 重组DNA技术的基本过程
（1）目的基因的获得 （2）载体的选择与制备 （3）目的基因与载体的结合（DNA分子的体外连接） （4）重组DNA导入受体 （5）重组体筛选和鉴定 （6）目的基因表达 （7）基因产物的分离纯化
DNA重组操作过程
ab
剪切
载体
重组
B
引入宿 主细胞
Ab
抗性筛选
T载体
▪ 一般采用的方法是先把载体用某种限制性内切酶消化成平 头，再在70℃或72℃下在只加入dTTP的反应体系中用Taq DNA聚合酶处理半小时（也有人报道处理1～2小时能提高克隆效 率，这样加T反应会更彻底）。也可以用末端转移酶来完成加T 反应。载体自连、PCR产物串连可以忽略。
▪ 如果使用ddTTP，效果会更好。
实验二 重组质粒的构建
一、实验目的
▪通过本实验学会琼脂糖凝胶DNA回收和重组 DNA连接的方法。
重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定
转化及转化子的鉴定11243224 周雨一、感受态细胞的制备1、材料：E. coli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA: 购买或实验室自制,eppendorf 管。
2、设备：恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱, 恒温水浴锅, 制冰机, 分光光度计,微量移液枪。
3、试剂：LB固体和液体培养基，Amp母液，含Amp的LB固体培养基，麦康凯培养基(Maconkey Agar)，0.05mol/L CaCl2溶液，含15%甘油的0.05mol/L CaCl2。
4、受体菌的培养：从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。
将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。
5、感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。
弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。
弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。
二、转化1、DNA和感受态细胞都置于37度恒温水浴锅中激活，然后将DNA转移到感受态细胞悬液中，反复吹打，使其均匀接触（由于细菌可以从环境中直接吸收DNA）；2、运用热胀冷缩的原理，将混悬液放在冰水浴中半个小时到40分钟（最短时间），使得DNA 与细胞表面受体结合；3、轻轻的将混悬液置于37到45度的水浴锅45秒；4、平稳快速的转入冰水浴中2分钟；5、取出，加入900ul 的37℃预热的LB培养基，混匀；6、放入37度的培养箱1小时，让菌苏醒，恢复生长；7、取适当离心（3000至4000r/min，1min，弃部分上清液200微升）的管中细胞均匀地接种在选择培养基（LB培养基+某种抗生素）；8、提前一天进行抗生素平板，培养基灭菌，之后，加入抗生素（青霉素），分布均匀，冷却至60度以下，适当摇瓶，摇着冷却，混匀后，涂平板，冷却凝固，再放入冰箱充分凝固，再在37度培养箱1 小时，烘干水，离心，3000-4000 r/min 1 min ，去上清；9、挑选部分的菌落，至少5个（随机）单菌落，进行扩大培养，以便于鉴定；10、将菌作为PCR模板进行扩增（菌落PCR)；11、进行菌种保藏，在液体培养基上；12、再将菌种送到公司测序，如果是碱基突变、引起氨基酸变化等，就需要重新开始做。
24 生物化学实验--重组质粒的构建
重组质粒的构建【目的】1. 验证基因工程的基本理论和聚合酶联链反应的基本原理。
2. 熟悉重组质粒的构建和利用聚合酶联链反应法获取目的基因的方法。
3. 了解 PCR 仪的使用方法。
【原理】1.DNA 的分离与纯化原理基因组 DNA 因来源不同、性质不同以及用途不同，其分离纯化的方法也不相同。
哺乳动物细胞基因组 DNA 的分离与纯化的方法主要有酚抽提法、甲酰胺解聚法、玻棒缠绕法以及各种快速方案。
本实验以哺乳动物细胞为例，介绍制备高分子量DNA 样品的酚抽提法。
酚抽提法可用于多种来源标本的高分子量 DNA 样品的制备，包括单层培养细胞、悬浮生长细胞、新鲜的组织以及血液标本等。
本实验所用的酚抽提法源自对 1976 年 Stafford 及其同事提出的方案的改进。
它以含 EDTA 、 SDS 及 RNA 酶（无 DNA 酶）的裂解缓冲液裂解细胞，经蛋白酶 K 处理后，用 pH8.0 的 Tris 饱和酚进行抽提，离心分层后，蛋白质因变性位于有机相与水相的界面，而 DNA 进入水相，重复抽提 DNA 至一定纯度，根据不同需要进行透析或沉淀处理，获得所需范围的高分子量 DNA 样品。
分离过程中 EDTA 为二价金属离子螯合剂，可以抑制 DNA 酶的活性，同时降低细胞膜的稳定性。
SDS 为生物阴离子去垢剂，主要引起细胞膜的降解并能乳化脂质和蛋白质 ,SDS 与这些脂质和蛋白质的结合可以使它们沉淀 ,SDS 的非极性端与膜磷脂结合，极性端使蛋白质变性和降解，所以 SDS 同时还有降解 DNA 酶的作用。
无 DNA 酶的 RNA 酶可以有效水解 RNA ，而避免 DNA 的消化。
蛋白酶 K 则有水解蛋白质的作用，可以消化 DNA 酶和 DNA 上的蛋白质，也有裂解细胞的作用。
酚可以使蛋白质变性沉淀，也可抑制 DNA 酶的活性。
pH8.0 的Tris 缓冲液能保证抽提后 DNA 进入水相，而避免滞留于蛋白质层。
多次抽提，可提高 DNA 的纯度。
质粒构建-protocol批注
一、引物设计:1,选择合适的载体。
酶切位点及其顺序（酶切位点的顺序一定不能颠倒）。
2，在NCBI上再次确认目的片段的碱基序列，进行primer blast，确定其特异性。
1，使用primer5排除目的片段里含有的酶切位点，或利用其本身含有的酶切位点，最后确定所使用的酶。
2，设计引物：primer-up：Primer-down：3，核对----送公司合成。
4，对公司合成的引物离心，10000rpm、5-10分钟、at 4℃，在超净台按照管子上标注的体积加入1*TE，为100uM，再用ddH2O稀释成10uM，-30℃保存。
二、PCR（）：（一）、引物Tm值titrate：pcr（15ul小体系）Sence：0.3ul 一般titrate5个温度值，并设一Anti sence：0.3ul 个NC（不加template）DNTP：0.3ul cDNA一般为Hela或293T Taq：0.1ul10*buffer： 1.5ulTemplate（cDNA）：1ulH2O：11.5ul（二）、pcr（50ul大体系）Sence：1ul Tm温度用titrate时得到的条带Anti sence：1ul 最亮的温度DNTP：1ulTaq：0.5ul 10*buffer：5ul Template（cDNA）：2ul H2O：39.5ul三、跑胶，胶回收:称1.2g的琼脂糖加入100ml的plasmid越小胶浓度越大）胶凝固后，即可点样跑胶。
2、跑胶：120V、40min。
3、泡EB溶液20min后，紫外灯下观察，切胶（要带防护手套和口罩）4、做胶回收:（1）加入400ul溶胶液，55℃溶胶；（2）待胶全溶后，过胶回收柱，12000rpm，1min；（3）DNA Wash Buffer 500ul，12000rpm，1min，twice；（4）开盖离心，15min；（5）换新的1.5ml EP管，加Elution Buffer 30ul，12000rpm，1min，重复吸取，12000rpm，1min；（Elution Buffer使用前65℃温热）（6）测浓度四、连接：2x Buffer 5ul10ul的体系T Vector 0.5ul 16℃水浴过夜Insert 4ulLignase 0.5ul若insert浓度较大，应加的量小于4ul，则其余部分用水补齐。
重组表达质粒的构建
重组表达质粒的构建重组表达质粒的构建1．原核表达载体选择质粒载体是重组蛋⽩表达的关键⼯具，其结构如下图。
重组蛋⽩表达，我们⾸先要将基因插⼊到表达载体上，插⼊的位置为多克隆位点。
质粒载体上有很多的功能元件，这些元件对于蛋⽩的表达都是⾄关重要的。
尽管我们经过系统的分析和预测，但是仍有很多蛋⽩不能顺利表达、表达量很低或者表达状态不好。
这个时候我们需要尝试构建不同的表达载体以期得到最好的效果，这些载体的主要区别是启动⼦和融合标签的差异。
蛋⽩表达优化主要⼯作也就是尝试构建不同融合表达标签，使⽤不同的宿主表达菌，测试不同的表达条件，筛选出最优表达体系。
常⽤的融合标签有GST、MBP、Trx、6His、SUMO等，这些标签主要功能是促表达、促可溶、信号标记或助纯化。
福因德⽣物可以提供以下系列载体以供科研表达研究。
我们选择表达载体的时候不但要考虑蛋⽩怎么表达成功，更要考虑蛋⽩怎么纯化出来，纯化的问题主要是考虑纯化标签和酶切位点的选择，下表我们列举了常见的纯化标签和酶切位点。
以上为原核表达常⽤的标签和酶切位点,其性质也都作了简要的介绍，各专业⽹站或专业书籍已对此做详尽解释，科研⼯作者可根据具体实验设计⽅案，组合设计以上标签和酶切位点的使⽤。
特别值得注意的是，选⽤和设计蛋⽩酶切位点的时候⾸要考虑的是序列内部有没有蛋⽩酶位点，同时要考虑酶切的效率和蛋⽩酶试剂成本。
⼀般商业化载体，在标签蛋⽩与载体多克隆位点之间都设计有酶切位点。
标签可设计在N-端也可在C-端,设计在N-端的优势是,可通过标签⾼效翻译起始位点带动插⼊蛋⽩的表达,可溶性标签的⾼效表达更可促进蛋⽩的可溶性表达;同时,⼤部分的蛋⽩内切酶的切割位点在C-端,所以标签设计在N-端可将标签切割完全。
在设计标签序列与酶切位点的时候还要考虑N-端稳定性原则，也就是所谓宿主细胞的N-端规则（N-end rule）,这个要避免；同时，还应该检查是否引⼊了可与别的蛋⽩相互作⽤的序列或者蛋⽩酶切位点。
实验四.重组质粒载体的构建
生物技术大实验—实验四
重组质粒载体的构建
• 限制性酶切概述 • DNA片段的回收 • 重组质粒的构建 • 实验仪器设备 • 实验试剂 • 实验步骤 • 注意事项
5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3' 3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'
DNA纯度、缓冲液、温度条件及限 制性内切酶本身都会影响限制性内切酶 的活性。大部分限制性内切酶不受RNA 或单链DNA的影响。当微量的污染物进 入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进 一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每 次都要用新的吸管头。如果采用两种限 制性内切酶,必须要注意分别提供各自的 最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则 可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低 盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随 后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内 切酶水解。
也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿 抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙 醇，混匀后置-70℃低温冰箱30分钟，离心、干燥 并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。 DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理 图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶 切位点组成，以直线或环状图式表示。在DNA序 列分析、基因组是不可缺少的环节，近年来发展起来的 RFLP(限制性片段长度多态性)技术更是建立在它 的基础上。
4、 观察DNA离不开紫外透射仪,可是紫外光对 DNA分子有切割作用。从胶上回收DNA时,应 尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300360nm）,以减少紫外光切割DNA。 5、 EB是强诱变剂并有中等毒性,配制和使用时 都应戴手套,并且不要把EB洒到桌面或地面上。 凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理 后才能清洗或丢。 6、 当EB太多,胶染色过深,DNA带看不清时,可将 胶放入蒸馏水冲泡,30分钟后再观察。
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重组质粒的构建（beta版）
一、引物设计:
1.选择合适的载体。
酶切位点及其顺序（酶切位点的顺序一定不能颠倒;注意ATG和stop codon）。
2.在NCBI上再次确认目的片段的碱基序列。
1，使用word
2，设计引物：primer-up
Primer-down
3，另设计一对引物扩增CDS区，引物位于CDS区之外，扩增产物包含完整的CDS区。
引物长度约20个碱基。
4，核对----送公司合成。
5，对公司合成的引物快速离心，在超净台按照管子上标注的体积加入高压水（dd2H2O），配成100umol/ul(100uM),-20℃保存。
使用时按1：3比例稀释成25uM工作浓度。
二、PCR（P出目的片段）：
（一）、PCR P出目的片段：
2,pcr: cDNA 1ul
10x PFU buffer 2.5ul ℃ 5min
dNTP 1ul ℃ 30sec
F’-Primer 1ul ℃ 30sec
R’-Primer 1ul ℃ X min
PFU 0.5ul ℃ 5min
dd2H2O 18ul
（X是根据片段的长度设定，1000bp/min，退火温度根据Tm值来计算，一般低于Tm值5℃）
3，跑胶、回收:
（1），配胶：
0.6g 琼脂糖
60ml 1X TAE
0.6ul (待温度降到50-60℃左右时)
25分钟后，即可点样跑胶。
（2），跑胶：130-150V、25-30分钟左右。
（3），紫外灯下观察，切胶（要带防护手套和口罩）
4，胶回收（胶回收试剂盒）:
按照试剂盒的protocol来做，在胶回收的最后一步，Elution Buffer预先在55-65℃温箱中水浴，放在37℃温箱中2min。
对胶回收的产物跑胶验证。
可建立10ul的体系：回收产物5ul、6xloading buffer 2ul、dd2H2O 5ul。
三、酶切、链接：
1，目的片段酶切：（酶切时间根据酶的活性,70℃15-20min灭活）
insert (胶回收产物) 10ul
10 x buffer 2ul
20ul的体系dd2H2O 6ul
EcoRI 1ul
HindⅢ1ul
2，载体酶切：（1~2小时）
Vector （1ug/ul）：5 ul（总量5ug）
10 x buffer 2ul
20ul的体系dd2H2O 11ul
EcoRI 1ul
HindⅢ1ul
为方便以后使用，载体可以一次性多切点。
3，酶切时，首先要核对一下酶的buffer，有时双酶切时两个酶不能共用一种buffer，那么就要先切一端，酶切回收后再用另一酶切另一端，然后再酶切产物回收。
4，连接：
10x T4 Ligation Buffer 1ul
Vector 1ul
10ul体系insert 3ul（2～3ul）
T4 DNA Lignase 1ul
dd2H2O 4ul
附：Ligation system
DNA片段克隆到质粒载体上
载体与插入DNA的摩尔数比例为1:3-10。
最佳的摩尔数比例因载体类型的不同而不同，例如cDNA 和基因组DNA克隆载体。
可根据以下公式计算插入DNA用量：
[实例]:
载体与插入片段的摩尔数比例为1:3，如连接反应中加入100ng 6kb载体，插入片段大小为0.5kb，这时应加入插入片段的量为：
四、转化：
⑴、冰上30min-→热激：42℃、60秒（30～60s）-→冰上2分钟
⑵、加750ul LB，37℃、150 rpm、45分钟。
⑶、离心，4500g,5min。
吸去上清600ul，余150ul涂板
⑷、220rpm、过夜。
五、挑克隆
六、质粒提取（mini）(按试剂盒protocol)
七、酶切鉴定：
plasmid：5ul（总量5ug）
10 x buffer 1ul
10ul的体系dd2H2O 2ul
EcoRI 1ul
HindⅢ1ul
跑胶检测酶切后DNA条带位置（分子量）是否一致
八、测序
九、质粒提取（midi）
十、转染、Western blot(检测蛋白表达及表达条带是否符合)。