实验四.重组质粒载体的构建
实验四.重组质粒载体的构建
5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3' 3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'
DNA纯度、缓冲液、温度条件及限 制性内切酶本身都会影响限制性内切酶 的活性。大部分限制性内切酶不受RNA 或单链DNA的影响。当微量的污染物进 入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进 一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每 次都要用新的吸管头。如果采用两种限 制性内切酶,必须要注意分别提供各自的 最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则 可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低 盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随 后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内 切酶水解。
2、 混匀反应体系后,将eppendorf管置于适 当的支持物上（如插在泡沫塑料板 上）,37℃水浴保温2-3小时,使酶切反应 完全。 3、 每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0), 混匀,以停止反应,置于冰箱中保存备用。
注意事项
1. 酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成 分会干扰酶反应。 2、酶活力通常用酶单位（U）表示，酶单位的定义是：在最适反应 条件下，1小时完全降解1mg lDNA的酶量为一个单位，但是许多 实验制备的DNA不象lDNA那样易于降解，需适当增加酶的使用 量。反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中 的微量杂质可能干扰随后的反应。 3、市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶 反应缓冲液（1×）进行稀释。另外，酶通常保存在50%的甘油 中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下，否则，酶 活性将受影响。
构建DNA限制性内切酶图谱有许多 方法。通常结合使用多种限制性内切酶， 通过综合分析多种酶单切及不同组合的 多种酶同时切所得到的限制性片段大小 来确定各种酶的酶切位点及其相对位置。 酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性 和精确程度。
同源重组实验步骤
同源重组实验步骤2.构建质粒载体：获得目标DNA片段后，需要准备一个质粒载体，由于同源重组实验通常使用的载体为质粒，因此需要选择合适的质粒载体。
通常选择的载体具有以下特点：小尺寸，方便操作和复制；至少具有一个选择性标记，如抗生素抗性基因；具有多个限制性内切酶切位点，方便插入DNA片段。
3.酶切质粒载体：为了在质粒中插入目标DNA片段，需要通过酶切将质粒切开。
选择适当的限制性内切酶，将质粒切割成线性的DNA分子。
切割后的质粒将具有相应的粘性末端。
4.酶切目标DNA：同样的，在切割质粒之前，需要通过酶切目标DNA片段来制备粘性末端。
选择适当的限制性内切酶，将目标DNA片段切割成线性的DNA分子，并留有与质粒末端相兼容的粘性末端。
5.进行连接：将酶切后的质粒和目标DNA片段进行连接。
将目标DNA片段与线性的质粒反应，使其两者的粘性末端互相连接。
由于粘性末端具有互补性，使得两者可以进行连接。
连接实验通常在适当的缓冲液中进行，并添加DNA连接酶。
6.转化宿主细胞：连接完成后，将混合物转化到宿主细胞中。
这通常是通过电穿孔、热激冷冻法、钙磷法等方法来实现的。
转化宿主细胞后，用培养基培养细胞，以便DNA在细胞中复制。
7.选择重组细胞：培养转化后的细胞后，需要选择具有重组质粒的细胞。
这通常通过添加对应抗生素或其他选择性培养基的方法来实现。
只有携带重组质粒的细胞才能生存并继续生长。
8.鉴定重组细胞：确定是否成功进行了同源重组，通常通过PCR检测、酶切鉴定或测序等方法来进行。
PCR检测、酶切鉴定和测序可以确定质粒中是否存在目标DNA片段，以及目标DNA片段是否插入到了正确的位置。
9.扩大培养重组细胞：验证重组细胞后，可以通过扩大培养的方式，获得更多的重组细胞或质粒。
10.应用：获得重组细胞或质粒后，可以根据实验需要进行其他研究。
比如，可以通过转录和翻译来获得重组蛋白，用于功能鉴定；也可以将重组质粒转入其他宿主细胞，用于产生大量的重组蛋白。
重组载体构建的方法和步骤
重组载体构建的方法和步骤全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：重组载体构建是基因工程领域中非常重要的一项技术，它可以用来将特定的基因插入到目标细胞中，实现基因的转移和表达。
在科学研究、医学诊断和治疗等领域中都有广泛的应用。
下面我们来详细介绍一下重组载体构建的方法和步骤。
一、选择载体首先我们需要选择一个适合的载体作为基础，常见的载体有质粒、病毒、原核生物等。
在选择载体时需要考虑载体的大小和特性，以及目标基因的大小和需要表达的水平。
同时还需要考虑载体的复制原点、抗生素抗性基因等相关元件。
二、线性化载体接下来我们需要将选择的载体进行线性化处理，以便将目标基因插入到载体中。
线性化可以通过受控的限制酶酶切处理来实现，将载体的环状DNA骨架切割成线性DNA片段。
三、插入目标基因将目标基因与线性化的载体进行连接。
目前常用的方法包括：内切酶切割连接法、PCR扩增连接法、接头连接法等。
这些方法可以有效地将目标基因插入到载体中，并确保插入的正确性和稳定性。
四、转化目标宿主将构建好的重组载体导入到目标宿主细胞中，使其稳定地存在和复制。
转化的方法多样，包括热激转化、电穿孔转化、化学法转化等。
转化效率和载体稳定性是评价转化效果的主要因素。
五、筛选重组子对转化后的细胞进行筛选，筛选出含有目标基因的重组子。
常用的筛选方法包括抗生素筛选、荧光筛选、酵素检测等。
筛选过程中需要注意筛选压力和筛选条件的优化，以提高筛选效率。
六、鉴定重组子对筛选出的重组子进行鉴定，确保其构建正确。
常用的鉴定方法包括PCR扩增、酶切鉴定、序列分析等。
通过这些方法可以验证重组子的结构和功能是否正确，确保后续实验的准确性和可靠性。
七、表达目标基因对鉴定合格的重组子进行表达。
通过选用适当的启动子和调控元件，可以实现目标基因的高效表达。
表达的方法有多种选择，包括转染法、感染法、转基因法等。
表达的效果可以通过荧光显微镜观察、酶活性测定、Western blot等方法进行检测和验证。
克隆载体构建实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习克隆载体的构建方法，掌握分子克隆的基本原理和操作步骤。
2. 掌握利用限制性内切酶和DNA连接酶进行DNA片段的插入和连接。
3. 熟悉重组质粒的鉴定和扩增方法。
二、实验原理克隆载体是分子生物学研究中常用的工具，它可以将目的基因插入其中，并在宿主细胞中进行扩增。
克隆载体的构建主要包括以下步骤：1. 设计引物：根据目的基因序列设计特异性引物，用于PCR扩增目的基因片段。
2. PCR扩增：利用引物扩增目的基因片段。
3. 载体线性化：利用限制性内切酶将载体线性化，使其具有末端粘性。
4. DNA片段连接：将目的基因片段与载体进行连接。
5. 转化宿主细胞：将连接后的重组质粒转化至宿主细胞。
6. 鉴定和扩增：通过PCR、酶切等方法对转化后的细胞进行鉴定和扩增。
三、实验材料1. 试剂：PCR引物、限制性内切酶、DNA连接酶、DNA分子量标准、Taq酶、pUC19载体、感受态细胞等。
2. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、移液器、DNA纯化柱等。
四、实验步骤1. 设计引物：根据目的基因序列设计特异性引物，引物长度一般为20-30个碱基，其中包含酶切位点。
2. PCR扩增：利用引物扩增目的基因片段，PCR反应体系如下：- 10×PCR缓冲液5μl- dNTPs（每种2.5μmol/L）4μl- 引物（上下游引物各1μmol/L）2μl- DNA模板1μl- Taq酶0.5μl- ddH2O补充至50μl3. 载体线性化：利用限制性内切酶将载体线性化，反应体系如下：- 载体DNA 5μl- 10×酶切缓冲液5μl- 限制性内切酶1μl- ddH2O补充至20μl4. DNA片段连接：将PCR产物与载体进行连接，反应体系如下：- 线性化载体DNA 5μl- PCR产物5μl- 10×连接缓冲液5μl- DNA连接酶1μl- ddH2O补充至20μl5. 转化宿主细胞：将连接后的重组质粒转化至感受态细胞，具体操作方法如下：- 将感受态细胞铺板于含有适当抗生素的培养基上，37℃培养过夜。
重组质粒的构建
重组质粒的构建重组质粒的构建是基因工程的核心步骤之一，其目的是将目的基因插入到质粒载体中，以实现目的基因的稳定表达和克隆化。
以下是重组质粒构建的主要步骤：1.目的基因获取首先需要获取目的基因。
目的基因可以从基因文库、PCR、基因组测序等方法中获取。
根据需要选择合适的方法，将目的基因克隆到质粒载体中。
2.载体质粒选择选择适合的质粒载体是重组质粒构建的关键步骤之一。
根据目的基因的特点和表达要求，选择适合的质粒载体。
常见的质粒载体有pET、pUC、pBluescript等。
3.限制性酶切限制性酶切是重组质粒构建的重要步骤之一。
通过限制性酶切，将目的基因和质粒载体分别切开，露出粘性末端，以便于连接反应。
4.连接反应将切好的目的基因和质粒载体的粘性末端连接在一起，形成重组质粒。
连接反应需要使用T4DNA连接酶或其它连接酶进行催化。
连接反应需要在适宜的温度和pH 条件下进行一定时间，以确保重组质粒的正确构建。
5.转化宿主细胞将连接反应得到的重组质粒转化到宿主细胞中。
常见的宿主细胞有细菌、酵母、昆虫等。
转化方法有多种，如电穿孔法、化学转化法等。
转化后需要在适宜的培养条件下进行培养，以获得大量的重组质粒。
6.克隆筛选克隆筛选是重组质粒构建的重要步骤之一。
通过克隆筛选，可以确定重组质粒是否正确构建。
常见的克隆筛选方法有蓝白斑筛选、酶切法等。
7.序列验证最后需要对重组质粒进行序列验证，以确保目的基因的正确插入和序列的准确性。
序列验证可以通过Sanger测序等方法进行。
重组表达质粒的构建——原核表达载体选择
重组表达质粒的构建——原核表达载体选择质粒载体是重组蛋白表达的关键工具，其结构如下图。
重组蛋白表达，我们首先要将基因插入到表达载体上，插入的位置为多克隆位点。
质粒载体上有很多的功能元件，这些元件对于蛋白的表达都是至关重要的。
尽管我们经过系统的分析和预测，但是仍有很多蛋白不能顺利表达、表达量很低或者表达状态不好。
这个时候我们需要尝试构建不同的表达载体以期得到最好的效果，这些载体的主要区别是启动子和融合标签的差异。
蛋白表达优化主要工作也就是尝试构建不同融合表达标签，使用不同的宿主表达菌，测试不同的表达条件，筛选出最优表达体系。
常用的融合标签有GST、MBP、Trx、6His、SUMO等，这些标签主要功能是促表达、促可溶、信号标记或助纯化。
福因德生物可以提供以下系列载体以供科研表达研究。
1）促表达/促溶标签2）信标标签3）纯化标签我们选择表达载体的时候不但要考虑蛋白怎么表达成功，更要考虑蛋白怎么纯化出来，纯化的问题主要是考虑纯化标签和酶切位点的选择，下表我们列举了常见的纯化标签和酶切位点。
4）酶切位点以上为原核表达常用的标签和酶切位点,其性质也都作了简要的介绍，各专业网站或专业书籍已对此做详尽解释，科研工作者可根据具体实验设计方案，组合设计以上标签和酶切位点的使用。
特别值得注意的是，选用和设计蛋白酶切位点的时候首要考虑的是序列内部有没有蛋白酶位点，同时要考虑酶切的效率和蛋白酶试剂成本。
一般商业化载体，在标签蛋白与载体多克隆位点之间都设计有酶切位点。
标签可设计在N-端也可在C-端,设计在N-端的优势是,可通过标签高效翻译起始位点带动插入蛋白的表达,可溶性标签的高效表达更可促进蛋白的可溶性表达;同时,大部分的蛋白内切酶的切割位点在C-端,所以标签设计在N-端可将标签切割完全。
在设计标签序列与酶切位点的时候还要考虑N-端稳定性原则，也就是所谓宿主细胞的N-端规则（N-end rule）,这个要避免；同时，还应该检查是否引入了可与别的蛋白相互作用的序列或者蛋白酶切位点。
4重组表达质粒的构建——基因的克隆
重组表达质粒的构建——基因的克隆长片段基因在大肠杆菌中表达往往比较困难，作为抗原使用的重组蛋白可以考虑选择抗原性好的区段原核表达，前文已作阐述。
对整个蛋白结构研究，必须全长表达该蛋白，此时最好考虑真核表达系统，特别是含有跨膜区的蛋白。
选定要克隆的区段，需先富集纯化之后才方便插入载体，常用的富集方法是PCR或者质粒繁殖复制。
为了防止在PCR扩增过程中引入碱基错误或者碱基缺失，PCR扩增基因时候必须使用高保真Taq酶。
为了满足科研工作者不同实验需求，福因德生物将高保真Taq酶优化为即用型Mix，使用时直接加引物和模板就可以扩增。
除此之外，福因德生物还开发出LA Taq、S-Taq Mix以及SYBR荧光定量PCR Mix(需要更高品质的可选用SYBR PCR SuperMix)。
原核重组表达常用克隆技术主要有以下几种：1）酶切连接这个是目前应用最为广泛的的克隆技术，主要优点是技术稳定；缺点是周期长、步骤多，任何一个环节产生的误差都会影响克隆构建的成败。
如用酶切连接的策略进行载体批量构建，不同载体和不同外源基因尽可能选用相同的上下游酶切位点，比如，批量克隆基因到某个载体上，可一次性大量双酶切将载体线性化后保存备用，每次构建载体只需酶切外源基因片段，载体可直接取用，不必每次都酶切，省时省力（此处需特别留意的是基因内部不能有与上述所用冲突的酶切位点）。
2）TA克隆TA克隆必须使用商业的线性化载体，线性载体3´末端有一个T碱基，与PCR扩增产物3´末端A正好匹配。
这种克隆策略最大的优点是载体使用方便，扩增产物可以直接克隆到载体上，不需要酶切位点等冗余序列；缺点是：必须依赖商业化载体，载体选择受限；扩增外源片段所使用的Taq酶也必须是可以在3´末端加A，这种Taq酶的保真度不高；外源片段插入之后还必须鉴定方向。
目前，这种构建表达载体的策略已经逐渐被淘汰。
3）TOPO克隆TOPO克隆载体利用DNA拓扑异构酶I识别序列中的CCCTT松弛双螺旋并重新连接，同时兼具限制性内切酶和连接酶的功能。
重组载体构建的方法和步骤
重组载体构建的方法和步骤
1. 选择载体，首先需要选择合适的载体，常用的载体包括质粒、病毒、人工染色体等。
选择载体时需要考虑载体大小、复制方式、
宿主范围等因素。
2. 线性化载体，将所选载体进行线性化处理，通常采用限制性
内切酶对载体进行切割，生成线性化的载体。
3. 外源基因插入，将待插入的外源基因与线性化载体进行连接。
这一步通常需要利用DNA连接酶或者DNA重组酶来实现。
4. 载体转化，将重组后的载体导入到宿主细胞中。
这一步通常
采用转化、转染或者电穿孔等方法。
5. 筛选正常重组子代，经过载体转化后，需要进行筛选以获得
正常重组的子代细胞。
通常采用抗生素筛选或者标记基因筛选的方式。
6. 鉴定重组子代，对筛选得到的细胞进行PCR、酶切、测序等
方法进行鉴定，确保重组载体的构建成功。
总的来说，重组载体构建的方法和步骤包括选择载体、线性化载体、外源基因插入、载体转化、筛选正常重组子代和鉴定重组子代。
这些步骤需要严格操作，并且需要根据具体实验情况进行调整和优化。
希望这些信息能够对你有所帮助。
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5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3' 3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'
DNA纯度、缓冲液、温度条件及限 制性内切酶本身都会影响限制性内切酶 的活性。大部分限制性内切酶不受RNA 或单链DNA的影响。当微量的污染物进 入限制性内切酶贮存液中时,会影响其进 一步使用,因此在吸取限制性内切酶时,每 次都要用新的吸管头。如果采用两种限 制性内切酶,必须要注意分别提供各自的 最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则 可同时水解。若需要不同的盐浓度,则低 盐浓度的限制性内切酶必须首先使用,随 后调节盐浓度,再用高盐浓度的限制性内 切酶水解。
也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿 抽提，加0.1倍体积3mol/L NaAc和2倍体积无水乙 醇，混匀后置-70℃低温冰箱30分钟，离心、干燥 并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。 DNA限制性内切酶酶切图谱又称DNA的物理 图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶 切位点组成，以直线或环状图式表示。在DNA序 列分析、基因组是不可缺少的环节，近年来发展起来的 RFLP(限制性片段长度多态性)技术更是建立在它 的基础上。
Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中 得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。 绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核 苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如 EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列 或简并序列。
Ⅱ类酶切割位点在识别序列中, 有的在对称轴处切割,产生平末端的 DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG3');有的切割位点在对称轴一侧,产生 带有单链突出末端的DNA片段称粘 性未端, 如EcoRⅠ切割识别序列后 产生两个互补的粘性末端。
生物技术大实验—实验四
重组质粒载体的构建
• 限制性酶切概述 • DNA片段的回收 • 重组质粒的构建 • 实验仪器设备 • 实验试剂 • 实验步骤 • 注意事项
一、限制性酶切概述 限制性内切酶能特异地结合于一段 被称为限制性酶识别序列的DNA序列之 内或其附近的特异位点上,并切割双链 DNA。
它可分为三类:Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一 蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作 用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于 识别位点并随机的切割识别位点不远处 的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割 DNA分子,然后从底物上解离。Ⅱ类由两 种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限 制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另 一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别 序列。
4、 观察DNA离不开紫外透射仪,可是紫外光对 DNA分子有切割作用。从胶上回收DNA时,应 尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300360nm）,以减少紫外光切割DNA。 5、 EB是强诱变剂并有中等毒性,配制和使用时 都应戴手套,并且不要把EB洒到桌面或地面上。 凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理 后才能清洗或丢。 6、 当EB太多,胶染色过深,DNA带看不清时,可将 胶放入蒸馏水冲泡,30分钟后再观察。
二、DNA片段回收 质粒、噬菌体等经酶切、电泳； PCR产物经电泳后，常常需要对一 些DNA电泳片段进行回收和纯化， 用于亚克隆、探针标记等。DNA回 收和纯化常用方法有压碎法、低融 点琼脂糖法、冻融法等，也有现成 的试剂盒供应。
三、重组质粒的构建
将经过酶切、回收纯化后的 PCR产物与质粒载体用T4DNA连 接酶连接的过程称为重组质粒载 体的构建。
四、实验仪器设备
水平式电泳装置,电泳仪,台式高速 离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪, 照相支 架, 照相机及其附件。
五、实验试剂 1、 6×电泳载样缓冲液：0.25％ 溴粉 蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于 4℃。 2、 溴化乙锭(EB)溶液母液:将EB配制 成10mg/ml,用铝箔或黑纸包裹容器, 储于 室温即可。
六、实验步骤
1、 将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管(最好0.5ml) 编号,用微量移液枪分别加入DNA 1μg和相应的 限制性内切酶反应10×缓冲液2μl,再加入重蒸水 使总体积为19μl,将管内溶液混匀后加入1μl酶 液,用手指轻弹管壁使溶液混匀,也可用微量离心 机甩一下,使溶液集中在管底。此步操作是整个 实验成败的关键,要防止错加，漏加。使用限制 性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免 活性降低。
构建DNA限制性内切酶图谱有许多 方法。通常结合使用多种限制性内切酶， 通过综合分析多种酶单切及不同组合的 多种酶同时切所得到的限制性片段大小 来确定各种酶的酶切位点及其相对位置。 酶切图谱的使用价值依赖于它的准确性 和精确程度。
在酶切图谱制作过程中，为了获得 条带清晰的电泳图谱，一般DNA用量 约为0.5-1μg。限制性内切酶的酶解反 应最适条件各不相同,各种酶有其相应 的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数 为37℃)。对质粒DNA酶切反应而言, 限 制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA加1单位酶,消化1-2小时。但要完 全酶解则必须增加酶的用量,一般增加23倍,甚至更多,反应时间也要适当延长。
2、 混匀反应体系后,将eppendorf管置于适 当的支持物上（如插在泡沫塑料板 上）,37℃水浴保温2-3小时,使酶切反应 完全。 3、 每管加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0), 混匀,以停止反应,置于冰箱中保存备用。
注意事项
1. 酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成 分会干扰酶反应。 2、酶活力通常用酶单位（U）表示，酶单位的定义是：在最适反应 条件下，1小时完全降解1mg lDNA的酶量为一个单位，但是许多 实验制备的DNA不象lDNA那样易于降解，需适当增加酶的使用 量。反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中 的微量杂质可能干扰随后的反应。 3、市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶 反应缓冲液（1×）进行稀释。另外，酶通常保存在50%的甘油 中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在1/10之下，否则，酶 活性将受影响。