DNA重组载体构建
重组载体构建的方法和步骤
重组载体构建的方法和步骤全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：重组载体构建是基因工程领域中非常重要的一项技术，它可以用来将特定的基因插入到目标细胞中，实现基因的转移和表达。
在科学研究、医学诊断和治疗等领域中都有广泛的应用。
下面我们来详细介绍一下重组载体构建的方法和步骤。
一、选择载体首先我们需要选择一个适合的载体作为基础，常见的载体有质粒、病毒、原核生物等。
在选择载体时需要考虑载体的大小和特性，以及目标基因的大小和需要表达的水平。
同时还需要考虑载体的复制原点、抗生素抗性基因等相关元件。
二、线性化载体接下来我们需要将选择的载体进行线性化处理，以便将目标基因插入到载体中。
线性化可以通过受控的限制酶酶切处理来实现，将载体的环状DNA骨架切割成线性DNA片段。
三、插入目标基因将目标基因与线性化的载体进行连接。
目前常用的方法包括：内切酶切割连接法、PCR扩增连接法、接头连接法等。
这些方法可以有效地将目标基因插入到载体中，并确保插入的正确性和稳定性。
四、转化目标宿主将构建好的重组载体导入到目标宿主细胞中，使其稳定地存在和复制。
转化的方法多样，包括热激转化、电穿孔转化、化学法转化等。
转化效率和载体稳定性是评价转化效果的主要因素。
五、筛选重组子对转化后的细胞进行筛选，筛选出含有目标基因的重组子。
常用的筛选方法包括抗生素筛选、荧光筛选、酵素检测等。
筛选过程中需要注意筛选压力和筛选条件的优化，以提高筛选效率。
六、鉴定重组子对筛选出的重组子进行鉴定，确保其构建正确。
常用的鉴定方法包括PCR扩增、酶切鉴定、序列分析等。
通过这些方法可以验证重组子的结构和功能是否正确，确保后续实验的准确性和可靠性。
七、表达目标基因对鉴定合格的重组子进行表达。
通过选用适当的启动子和调控元件，可以实现目标基因的高效表达。
表达的方法有多种选择，包括转染法、感染法、转基因法等。
表达的效果可以通过荧光显微镜观察、酶活性测定、Western blot等方法进行检测和验证。
DNA重组质粒的构建概述
DNA重组质粒的构建概述引言DNA重组质粒是现代生物学研究中常用的工具，它可以用来携带外源基因并在目标生物体中表达，从而实现对基因功能的研究和利用。
本文将概述DNA重组质粒的构建过程，包括选择质粒载体、外源基因的克隆插入以及构建质粒的鉴定等内容。
选择质粒载体质粒是细胞内独立存在的环状DNA分子，广泛存在于细菌和酵母等单细胞生物中。
在构建DNA重组质粒时，选择一个适合的质粒载体非常关键。
常用的质粒载体有pUC19、pET28a、pET-DEST42等，在选择时可以根据实验需求考虑载体大小、选择标记物和基因表达系统等因素。
外源基因的克隆插入1. DNA片段的获取首先，需要获取外源基因的DNA片段。
这可以通过PCR扩增、基因合成或其他方法来获得。
在PCR扩增时，需要设计一对引物，使其能够特异性地扩增目标基因。
合成基因片段时，可以利用现代合成生物学的技术，将目标基因序列按照设计的引物进行人工合成。
2. 酶切和连接接下来，使用限制酶将质粒载体和外源基因片段酶切开。
酶切的目的是产生互补的黏性末端，使得质粒载体和外源基因片段可以互相连接。
选择适当的限制酶在切割时产生互补的黏性末端，使得连接更加有效。
然后，将质粒载体和外源基因片段连接在一起。
这可以使用DNA连接酶和连接试剂，在适当的条件下进行连接。
连接后的质粒称为重组质粒。
3. 转化宿主细胞将构建好的重组质粒转化到适当的宿主细胞中，使其能够在细胞内进行复制和表达。
常用的宿主细胞有大肠杆菌和酵母等。
构建质粒的鉴定通过一系列实验，对构建好的质粒进行鉴定，以确保其正确性和完整性。
常用的鉴定方法有限制酶切鉴定、测序验证、PCR扩增鉴定等。
1. 限制酶切鉴定利用正确的限制酶将质粒进行切割，然后经过琼脂糖凝胶电泳进行分析。
根据不同的切割模式，可以判断质粒是否正确构建。
2. 测序验证通过测序技术对质粒进行测序分析，确保质粒中的外源基因片段的完整性和准确性。
3. PCR扩增鉴定使用特异性引物对质粒进行PCR扩增，在琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物的大小，判断质粒中的目标基因是否存在。
实验八DNA重组子的构建与鉴定
1.取新的0.5ml eppendorf管，编号。 2.依次加入：
ddH2O
2μl
T-vector
1 μl
PCR product 10×T4 DNA ligase buffer
5μl 1μl
T4 DNA ligase
1μl
3.混匀后将液体全部甩到管底涂板及培养
因pUCm-T载体带有Ampr基因，而外源片 段上不带该基因，故转化受体菌后只有 带有pUCm-T的受体菌（转化子）才能在 含有Amp的LB平板上存活；只带有自身 环化外源片段的转化子则不能存活。此 为初步的抗性筛选。
α-互补
-互补的插入失活 pUC载体上LacZ’基因的5‘端有一段多克 隆位点(MCS)区，本身虽不干扰LacZ’ （ -片段）的合成，但插入外源目的基 因后就会阻止LacZ’的合成，使不能互补
5’ MCS lacZ’ 3’ 5’ 外源DNA lacZ’ 3’
肽 互补
肽移码突变 不互补
蓝－白斑筛选示意图
α互补(蓝白斑)筛选
pUCm-T上带有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序
列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。 这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS）， 但并没有破坏lacZ的阅读框架，不影响其正常功能。 E. coli DH5α菌株带有β-半乳糖苷酶C端部分序列
重组体导入受体细胞后的筛选培养
大部分是含空载体的 转化子（非重组子） 少部分是含目的基因 的转化子（重组子） 少数是不含载体的受 体细胞（非转化子）
常用鉴定方法
小规模制备质粒DNA进行限制酶切分析 互补 杂交筛选
a
12
酶切和电泳方法
➢ 琼脂糖凝胶电泳 分离鉴定大小不 等的酶解片段：
DNA重组技术(Recombinant DNA)实验原理、用品和步骤
DNA重组技术(Recombinant DNA)实验原理、用品和步骤【实验原理】1．DNA重组技术重组DNA(Recombinant DNA)技术是遗传工程的核心技术，也是人类在基因和DNA分子水平进行操作的技术。
它包括以下几个步骤：1）重组DNA分子的构建：即将目的基因（DNA或cDNA片段）与载体DNA重组，应用TA 克隆方法,将PCR扩增产物快速克隆至质粒载体中。
该方法利用了PCR过程中使用的热稳定聚合酶(Taq酶)在所复制的双链分子末端加上单一脱氧腺苷酸(A),从而产生一A-粘性末端的性质,设计一种线性载体,使之含有一T-粘性末端,可直接插入PCR产物,在DNA连接酶作用下，目的DNA和载体DNA连接形成重组DNA分子。
2）将重组DNA分子转化宿主细胞。
3）克隆选择增殖：将转化后的液体涂布于琼脂培养基表面，培养基中含有宿主菌敏感的抗生素，重组DNA（TA克隆载体分子）含有相应抗生素的抗性基因，转化的细菌能在培养基上生长形成集落。
挑取菌落，置液体培养基中培养，得到大量含重组DNA的细菌。
4）收获扩增后的培养细胞，提取重组DNA分子（质粒），并纯化，获得某一基因或DNA片段的大量拷贝。
2．质粒DNA的小量制备常见的质粒DNA提取方法有简易一步提取法、碱裂解法和煮沸法。
本实验采用的是碱裂解法，碱裂解法的原理：在PH 12.0~12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒（CC）DNA仍为自然状态。
将pH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构。
大部分染色体DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态。
通过离心，将可去除大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用乙醇沉淀回收质粒DNA。
3．质粒DNA的限制性内切核酸酶（限制酶）切分析限制酶存在于原核生物体内，根据其结构和功能特性分为：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。
重组载体构建的方法和步骤
重组载体构建的方法和步骤
1. 选择载体，首先需要选择合适的载体，常用的载体包括质粒、病毒、人工染色体等。
选择载体时需要考虑载体大小、复制方式、
宿主范围等因素。
2. 线性化载体，将所选载体进行线性化处理，通常采用限制性
内切酶对载体进行切割，生成线性化的载体。
3. 外源基因插入，将待插入的外源基因与线性化载体进行连接。
这一步通常需要利用DNA连接酶或者DNA重组酶来实现。
4. 载体转化，将重组后的载体导入到宿主细胞中。
这一步通常
采用转化、转染或者电穿孔等方法。
5. 筛选正常重组子代，经过载体转化后，需要进行筛选以获得
正常重组的子代细胞。
通常采用抗生素筛选或者标记基因筛选的方式。
6. 鉴定重组子代，对筛选得到的细胞进行PCR、酶切、测序等
方法进行鉴定，确保重组载体的构建成功。
总的来说，重组载体构建的方法和步骤包括选择载体、线性化载体、外源基因插入、载体转化、筛选正常重组子代和鉴定重组子代。
这些步骤需要严格操作，并且需要根据具体实验情况进行调整和优化。
希望这些信息能够对你有所帮助。
基因工程-5-重组DNA构建与筛
重组DNA技术的应用领域
基因治疗
利用重组DNA技术对病变细胞 进行基因修饰，以达到治疗疾 病的目的。
农业生物技术
通过重组DNA技术改良农作物， 提高产量和抗性。
基因克隆
通过重组DNA技术将目的基因 插入到载体中，实现基因的克 隆和扩增。
生物制药
利用重组DNA技术生产具有特 定功能的蛋白质或抗体，用于 药物研发和生产。
重组DNA技术的发展趋势
随着科学技术的不断进步，重组DNA技术将不断发展和完善，有 望在疾病治疗、生物制药、农业育种等领域发挥更大的作用。
重组DNA技术面临的挑战
尽管重组DNA技术具有广泛的应用前景，但同时也面临着一些 挑战，如技术难度、安全性问题、伦理问题和法规限制等。
重组DNA技术的未来发展方向
重组DNA技术安全性评估标准
对重组DNA技术的安全性进行评估，需要遵循国际公认的安全性评估标准，如美国食品药品 监督管理局（FDA）和世界卫生组织（WHO）等机构制定的相关指南和规定。
重组DNA技术安全性评估内容
评估内容包括重组DNA技术的操作过程、使用的载体、宿主细胞、目的基因等，以及潜 在的基因突变、基因转移和基因表达等方面。
SUMMAR Y
01
重组DNA技术概述
重组DNA技术的定义
重组DNA技术是指通过人工手段将 不同来源的DNA片段进行剪切、拼 接和重组，从而构建出新的DNA分 子，实现基因的修饰、表达和调控。
该技术涉及基因克隆、载体构建、 DNA转化和筛选等多个环节，是现代 生物技术领域中的核心技术之一。
重组DNA技术的历史与发展
T4 DNA连接酶连接
将目的基因与载体进行连接，形成重组DNA分子。常用的 连接方法是T4 DNA连接酶连接法。
实验十载体构建
实验目的： 能够综合运用DNA回收、酶切、连接、
转化、质粒提取、酶切鉴定筛选重组质粒等 分子生物学技术。
设计重组载体时的注意事项
• 目的DNA插入克隆载体
在克隆载体的MCS中选择合适的酶切位点： 通过引物设计在目的片段两端加上酶切位点 注意在外源DNA片段的内部不• 第三天：
保存平板，留待下周提质粒鉴定 电泳鉴定 或 PCR鉴定
乙组提pUC18
2000 1000
20ng/μl
2000 1000
HindIII、EcoRI双酶切50 μl体系
• 待酶切DNA：不超过2.5 μg • 10×Y buffer: 10 μl （工作液浓度为2×) • EcoRI: 1 μl • HindIII: 1μl -1.5 μl • 加ddH2O至总体积为50 μl
• 目的DNA插入表达载体
除上述注意事项，引物设计时还要注意读码框要 和表达载体的读码框一致
实验流程
• 第一天：
– 电泳PCR产物并回收 – 双酶切目的片段及质粒 – 电泳检测、回收上述两种DNA – 电泳检测回收产物 – 连接反应（过夜）
空闲时间准备LA（含50μg/ml氨苄青霉素） 平板，LB培养基，试管及牙签灭菌。
37℃孵育≥1小时
T4 DNA 连接酶 20 μl体系
• pUC18 200-400ng 载体与插入片段的摩尔比： • 待插入的DNA片段 1: （3~10） • 10 × buffer：2 μl • T4 DNA 连接酶： 1.5 μl • 加ddH2O至总体积为20 μl
15℃孵育4-18小时 或 室温3小时 或 4 ℃ 过夜
表达载体的构建方法及步骤
表达载体的构建方法及步骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。
一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。
原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。
而真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。
（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+（3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段（4）P/E 启动子/增强子（5）Terms 终止信号（6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。
如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。
载体选择主要考虑下述3点：【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。
【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。
如<10kb 选质粒。
（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。
（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。
【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。
综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。
（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。
（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。
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RNAi实验中，我们经常用到siRNA表达载体（shRNA vector）：
shRNA表达载体除了常规载体具有的一些结构之外，最显著的特点就 是其启动序列。
shRNA表达载体的启动子：
H1和U6系列为目前shRNA表达载体最常用的启动子，这一类启动子依赖 RNA聚合酶 III （pol IIIIH1-H1-U6（双启动子）
Ambion公司
pSilencer™ 4.1-CMV
Restriction sites The same ORF with fusion partner Protective residues
⑴ 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 ⑵ 产物不能形成二级结构。 ⑶ 引物长度一般在15~30碱基之间。 ⑷ G+C含量在40%~60%之间。 ⑸ 碱基要随机分布。 ⑹ 引物自身不能有连续4个碱基的互补。 ⑺ 引物之间不能有连续4个碱基的互补。 ⑻ 引物5′端可以修饰。 ⑼ 引物3′端不可修饰。 ⑽ 引物3′端要避开密码子的第3位。
DNA polymerase
PCR的条件：
94℃ 94℃ 55℃ 72℃
5min 30s 30s 30s
30 cycle
限制性内切酶 酶切PCR产物和质粒载体
单酶切（顺序酶切） 双酶切（*共用Buffer，酶活）
纯化酶切产物
切胶回收 （1）跑胶，切胶 （2）融胶，回收目的片段 （3）紫外分光光度检测DNA浓度
●广谱表达 ●转录终止位点明确，即遇到5个连续的T终止转录
⑵ H1和U6启动子区别：
● U6 启动子比H1 效率略高，而且表达持续时间相对较长 ● H1不要求shRNA序列中sense的第一个碱基一定为“G”，任意碱基均可起始转录
载体结构 1、shRNA特定的启动序列（U6、H1等等）； 2、报告基因，最常用的为GFP/RFP系列； 3、筛选标记物，新霉素(Neomycin)，潮霉素 (Hygromycin)，嘌呤霉素(puromycin )。
文献检索
通过查阅文献，我们可以获得基因名称、来源、表达谱系等相关信息。常用 的外文数据库：
Elsevier Science数据库： 荷兰Elsevier Science公司是世界知名出版商，其出版的期刊是世界上公认的 高品位学术期刊。Elsevier Science公司提供的1,100多种全文电子期刊，是 获取科技论文全文文献的重要途径. /
现在商业化的载体上用的比较多的是新霉素和嘌呤霉素。也有一些载体同 时具有这两种抗性基因。
Invitrogen公司
pSilencer™ 2.1-U6 pSilencer™ 3.1-H1
Genscript公司
pRNA-U6.1 pRNA-U61.1 pRNA-cmv3.1
System Biosciences（SBI）
NCBI=PubMed Central (PMC) the U.S. National Institutes of Health (NIH) free digital archive of biomedical and life sciences journal literature. /pmc/
Oigo1-pGEX-4T1 Oigo2-pGEX-4T1 Oigo1-pBKT7 Oigo2-pBKT7 Oigo1-pGilda Oigo2-pGiada
Oigo1-pEGFP –C1 Oigo2-pEGFP –C1 JAK2-PET-28a JAK2-pFast-BAC
RET-pGilda y758f RET-pGilda y905f RET-pGilda y981f
少量与大量制备质粒
普通级、转染级、Endofree
●普通级(用于酶切鉴定，质粒保存，测序) ●转染级（用于细胞转染） ●Endofree （用于细胞转染）
NR2A-pSFV NR2B-pSFV NR2A-LV-GFP NR2B-LV-GFP RGL-LV-GFP TIP30-LV-GFP
PCR product:vector 3~ 10:1 At 25℃ for 2-3 hours or at 16℃ overnight Inactive T4 DNA ligase (at 70 ℃ for 10min )
感受态细胞（DH5a,TOP10,JM109等） 酶切鉴定 PCR鉴定 测序 (DNASTAR、sequncer4.2)
谢谢！
引物设计（primer 5.0、Oligo 6）
1. 化学合成法 2.基因组DNA(genomic DNA library酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)
PCR模板
●已有带有目的基因的质粒。 ●细胞或组织Total RNA 反转录的cDNA。
●按受体细胞: 原核细胞载体和真核细胞载体。
能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物(荧光蛋白，真核抗性
标记），便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单
一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA（多数质量载
体的容量小于5kb）。
pCDNA3.1 (non fusion or fusion) pCI-HA (fusion with HA tag) pRK5-FLAG (fusion with FLAG tag) pFLAG-CMV (fusion with FLAG tag) pEGFP-C1/N1 pIRES2 -EGFP
2010-3-22
Get the target DNA sequence Select appropriate vector PCR primer design Obtain cell or tissue PCR amplification Restriction, ligation and transformation Screen positive clone Sequencing
基因序列查找（http://www.ncbi.nlm.n种ih属.g名o称v/）
Rat Olig1
什么是基因载体（vector）：
是指将外源DNA或基因携带进入宿主细胞进行扩增或表达的工具。
载体的分类：
●按工作方式: 质粒载体、噬菌体载体、粘粒载体、病毒载体等。
●按功能: 克隆载体和表达载体，表达载体又分胞内表达和分泌表达载体。