DNA重组技术ppt课件
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重组DNA完整版PPT
➢ 重组DNA技术，又称为基因或分子克隆技术，是 基因工程的核心技术。该技术包括了一系列的分子 生物学操作步骤。
➢ 所谓基因工程(genetic engineering)就是有意识 地把一个生物体中有用的目的基因转入另一个生物 体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要的产 物。
生物技术
4 转化受体细胞和转化子的筛选 重组DNA技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程的核心技术。 （3〕TaqDNA聚合酶； 每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍
5 转化子的分析——Southern杂交 以mRNA为模板，以短的寡核苷酸〔oligo(dT)）分子作引物，加入dATP, dTTP, dGTP和dCTP, oligo(dT)与mRNA分子的多聚A〔polyA〕 尾巴碱基配对，在逆转录酶的作用下，根据碱基互补原则人工合成一段与之互补的DNA片段，这一过程称为反转录。 （2〕以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段； 4 转化受体细胞和转化子的筛选 4 转化受体细胞和转化子的筛选 重组DNA技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程的核心技术。 反转录人工合成互补DNA （2〕以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段； 每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍
（的基因； PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增〔包括分离〕一段目的基因的技术。 每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍
（3〕TaqDNA聚合酶； 美国Mullis教授 开汽车时的联想 重组DNA技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程的核心技术。
DNA片段； ➢ （3〕利用聚合酶链式反应〔PCR〕特异性
地扩增所需要的目的基因片段，等等序
反转录人工合成互补DNA➢ 构建基因获取目的基因存在的 问题——➢
➢ 所谓基因工程(genetic engineering)就是有意识 地把一个生物体中有用的目的基因转入另一个生物 体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要的产 物。
生物技术
4 转化受体细胞和转化子的筛选 重组DNA技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程的核心技术。 （3〕TaqDNA聚合酶； 每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍
5 转化子的分析——Southern杂交 以mRNA为模板，以短的寡核苷酸〔oligo(dT)）分子作引物，加入dATP, dTTP, dGTP和dCTP, oligo(dT)与mRNA分子的多聚A〔polyA〕 尾巴碱基配对，在逆转录酶的作用下，根据碱基互补原则人工合成一段与之互补的DNA片段，这一过程称为反转录。 （2〕以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段； 4 转化受体细胞和转化子的筛选 4 转化受体细胞和转化子的筛选 重组DNA技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程的核心技术。 反转录人工合成互补DNA （2〕以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段； 每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍
（的基因； PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增〔包括分离〕一段目的基因的技术。 每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍
（3〕TaqDNA聚合酶； 美国Mullis教授 开汽车时的联想 重组DNA技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程的核心技术。
DNA片段； ➢ （3〕利用聚合酶链式反应〔PCR〕特异性
地扩增所需要的目的基因片段，等等序
反转录人工合成互补DNA➢ 构建基因获取目的基因存在的 问题——➢
DNA重组及重组DNA技术PPT课件
切割：以内切方式水解双链DNA中的磷酸二酯键， 产生的DNA片段5’ 端为磷酸基，3’ 端为羟基。
II型酶切割双链DNA产生3种不同的切口
在对称轴中心同时切割双链，产生平末端或 称钝性末端（blunt end），如Hpa I：
5' …GTT▼AAC…3' Hpa I 5' …GTT AAC…3'
• 多聚核苷酸激酶 • 碱性磷酸酶
合成双链cDNA分 子
5ˊ羟基末端 磷酸化
切除末端 磷酸基
1. 限制性核酸内切酶
（restriction endonuclease, RE）
能识别DNA的特异序列，并在识别位点 或其周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。
由于能限制外源DNA的 “入侵”而得名。与甲 基化酶共同构成细菌的 限制修饰系统，限制外 源DNA， 保护自身DNA
3' …CAA▲TTG…5'
3' …CAA TTG… 5'
在对称轴两侧相对位点分别切割一条链。从 5' 端切割产生5' 端突出的粘性末端，如EcoR Ⅰ ：
5' …G▼AATT C…3' EcoR I 5' …G
3' …C TTAA▲G…5'
3' …CTTA A 5'
5' AATTC…3' G… 5'
基因克隆的主要操作步骤
分(分离) 目的基因
粘性末端
切(切割)
质粒
粘性末端
匹配的粘性末端
酶切后的目的基因片段 接(连接)
连接后的重组 质粒DNA分子
转(转化)
目的基因
染色体
重组质粒
DNA重组技术的基本步骤PPT课件
-
41
（1）、农杆菌转化法
-
42
转移至受体细胞 整合到染色体上
-
43
P15-2
根据农杆菌可将目的基因导入双子 叶植物的机理，你能分析出农杆菌不能 将目的基因导入单子叶植物的原因吗？ 若想将一个抗病基因导入单子叶植物 (如小麦），从理论上说，你认为应该 怎么做？
因为单子叶植物不能分泌出大量的酚类化合物来吸引农杆菌， 向单子叶植物的伤口处喷洒酚类化合物，使用基因枪法及花粉
1、什么是目的基因？
2、获取目的基因的方法有哪些？其操 作过程分别是怎样的？
-
9
1、目的基因概念： 主要指的是编码蛋白质的结构基因。也 可以是一些具有调控作用的因子。
2、目的基因获取方法： Ⅰ、从基因中获取目的基因 Ⅱ、利用PCR技术扩增目的基因 Ⅲ、化学方法直接人工合成 8100 C. 17280 D. 7560
-
28
4、在遗传工程中，若有一个控制有利性状的DNA分 子片段为ATGTG／TACAC，要使其数量增多，可用PCR
技术进行人工复制，复制时应给予的条件是 D
①双链DNA分子为模板 ②ATGTG或TACAC模板链 ③四 种脱氧核苷酸 ④四种核苷酸 ⑤DNA聚合酶 ⑥热稳定 DNA聚合酶⑦引物 ⑧温度变化 ⑨恒温
-
36
目的基因与运载体结合所需的条件有 D
①同一种限制酶 ②具有抗性基因的质粒
③RNA聚合酶 ④目的基因
⑤DNA连接酶 ⑥四种脱氧核苷酸
⑦ATP
A．①②③④⑤⑥⑦ B．①②④⑤⑥⑦
C．①②③④⑤
D．①②④⑤⑦
（多选）一个基因表达载体的构建应包括 ABCD
A．目的基因 B．启动子 C．终止子 D．标记基因
《重组DNA技术简介》课件
载体的构建
选择合适的载体，如质粒或病毒载体，对其进行 限制性内切酶切割、连接和转化等操作，构建成 重组载体。
克隆的表达与分析
对阳性克隆进行培养和诱导表达，收集表达产物 并进行相关分析，如蛋白质纯化、Western blot 等。
03
重组DNA技术的实验操作
基因的克隆与鉴定
基因克隆
将目的基因从原始生物体中提取出来，经过剪切、拼接等操作后 ，将其插入到载体DNA中，形成重组DNA的过程。
04
重组DNA技术的安全性与伦理问题
重组DNA技术的安全性评估
重组DNA技术的安全性
重组DNA技术是一种在分子水平上对DNA进行操作的技术，通过该技术可以实现对生物 遗传信息的精确控制。经过多年的研究和应用，重组DNA技术已经得到了广泛的应用和 认可，被认为是一种相对安全的技术。
安全评估的必要性
各国政府也制定了一些关于重组DNA 技术的法规和政策，例如美国的《人 间重组DNA研究指南》和中国的《人 间遗传资源管理暂行办法》等。这些 法规和政策对技术的研发和应用进行 了规范和管理，以确保技术的安全和 可控性。
重组DNA技术的社会影响与争议
社会影响
争议与挑战
重组DNA技术作为一种先进的生物技 术，对社会产生了深远的影响。该技 术的应用不仅推动了生物医学领域的 发展，也促进了农业、工业等领域的 技术革新。同时，该技术的应用也引 发了一些社会问题和争议。
基因表达的调控对于生物体的生长发 育和环境适应性至关重要。基因表达 受到多种因素的影响，包括DNA的甲 基化、染色质结构的改变、蛋白质因 子的作用等。
重组DNA技术的操作流程
目的基因的获取
通过限制性内切酶将DNA切割成片段，再通过 凝胶电泳和回收试剂盒分离得到目的基因。
重组DNA技术PPT课件
3. cDNA 4. 聚合酶链反应
2021/3/7
CHENLI
4
基本概念
• 基因（gene）：P219
• 基因组（genome）：P292
• 基因组学（genomics）：
研究基因组的结构、信息与功能的 科学。
• 基因组计划：HGP——P440
• 后基因组
• 功能基因组
2021/3/7
CHENLI
CHENLI
16
(五)重组体的筛选
直接选择法
1. 抗药性选择 2. 标志补救 3. 分子杂交法
2021/3/7
间接筛选法
核酸水平
蛋白质水平
*1. 酶切图谱 *2. 核酸探针 *3. PCR *4. 序列测定
CHENLI
免疫学的技术： SDS-PAGE 、 Western blot 、 ELISA 、 放 免 、 免疫沉淀、 荧光抗体等
2. 平端DNA间的连接
3. 同聚物加尾连接
4. 人工接头连接
2021/3/7
CHENLI
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2021/3/7
CHENLI
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2021/3/7
CHENLI
14
(四)重组DNA分子导入受体菌
• 无性繁殖
• 感受态细胞: 容易接受外源DNA的状态.
• 方式:
转化、转染、感染
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
2021/3/7
CHENLI
第40章、重组DNA技术
1. 目的基因的获取 2. 克隆载体的选择与构建 3. 外源基因与载体的连接 4. 重组DNA导入受体菌 5. 重组体的筛选
6. 克隆基因的表达
2021/3/7
CHENLI
DNA重组(共26张PPT)
加上连杆（ 1inker ），使之形成粘性末端后，再用DNA连接酶连接
Klenow
补平
DNA接头(adapter)连接法
连C5T'杆G的CA5G’-末GG端G和GC待G克隆的DNA片段5G’-末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化G，A然T后C再C通过T4DNA连接酶G的G作A用T使C两者连接起来。
G C 3‘…C--G--A—G A--C--G--T--C--C--T--C … 5’
：在最佳反应条件下15 才能发挥其连接DNA分子的功能作用
3‘…C--G--A--G-- A--C--G--T--C--C--T--C … 5’
℃反应1 小时，完全连接 目的序列回收产 5.0μL 连杆的5’-末端和待克隆的DNA片段5’-末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后再通过T4DNA连接酶的作用使两者连接起来。
来源
大肠杆菌
T4噬菌体
能源辅助因子 NAD+
ATP
功能
催化DNA粘性末端 粘性末端、平末
的连接
端均可连接
5.4 DNA连接酶的反应体系
• 1U DNA连接酶的酶活性 10×连接缓冲液 加上连杆（ 1inker ），使之形成粘性末端后，再用DNA连接酶连接
5 体外连接DNA片段的方式
1.0μL
这种酶需要在一条DNA链的3’-末端具有一个游离的羟基(-OH)，和在另一条DNA链的5’-末端具有一个磷酸基团(-P)，只有在这种情况下，
5'
5' GATCC CCCCCCCTAGG
GGATCCCCCCC CCTAGBa5m位' H点I酶切
GAATTGGGGGGGATCC
GGATCCCCCCC AATTC
Klenow
补平
DNA接头(adapter)连接法
连C5T'杆G的CA5G’-末GG端G和GC待G克隆的DNA片段5G’-末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化G，A然T后C再C通过T4DNA连接酶G的G作A用T使C两者连接起来。
G C 3‘…C--G--A—G A--C--G--T--C--C--T--C … 5’
：在最佳反应条件下15 才能发挥其连接DNA分子的功能作用
3‘…C--G--A--G-- A--C--G--T--C--C--T--C … 5’
℃反应1 小时，完全连接 目的序列回收产 5.0μL 连杆的5’-末端和待克隆的DNA片段5’-末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后再通过T4DNA连接酶的作用使两者连接起来。
来源
大肠杆菌
T4噬菌体
能源辅助因子 NAD+
ATP
功能
催化DNA粘性末端 粘性末端、平末
的连接
端均可连接
5.4 DNA连接酶的反应体系
• 1U DNA连接酶的酶活性 10×连接缓冲液 加上连杆（ 1inker ），使之形成粘性末端后，再用DNA连接酶连接
5 体外连接DNA片段的方式
1.0μL
这种酶需要在一条DNA链的3’-末端具有一个游离的羟基(-OH)，和在另一条DNA链的5’-末端具有一个磷酸基团(-P)，只有在这种情况下，
5'
5' GATCC CCCCCCCTAGG
GGATCCCCCCC CCTAGBa5m位' H点I酶切
GAATTGGGGGGGATCC
GGATCCCCCCC AATTC
DNA重组技术的基本工具PPT课件
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基因工程的工具酶
1．限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
(1)来源
主要来自于 原核生物
。
(2)特点
① 识 别 双 链 DN特A 定核分苷酸子 的 某 种
序列；
磷酸二酯键
②使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的
断裂。
(3)作用结果
中心轴线两侧
①黏性末端：在所识别序列的
将
DNA的两条链分别切开时形成中的心末轴端线。
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基因进入受体细胞的载体—— “分子运输车”
1．载体的种类有 质粒 λ噬、菌体
动植的物衍病生毒物、
等。
2．常用载体——质粒
(1)质粒是一种自裸我露复的制、结构简单双、链独环立状于DN细A 菌拟核DNA之外，
并具有
限制酶切割 能 力 的
分子外。源
(2)质粒DNA分子上有标一记至基多因个
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A．目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割 B．目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割 C．质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割 D．质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割 思维导图：
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SUCCESS
THANK YOU
2024/10/15
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3．载体的种类 (1)细菌质粒，它是细菌拟核DNA以外的小型双链环状DNA，有 的细菌只有一个，有的细菌有多个。 (2)λ噬菌体的衍生物和某些动植物病毒的DNA。 一般来说，天然载体往往不能满足人类的所有要求，因此人 们根据不同的目的和需求，对某些天然的载体进行人工改造。
重组DNA技术详细概述PPT(41张)
动物和植物 基到某种载体上能够 代表所有可能序列并且可以稳定维持和使用的 DNA片段的集合。根据序列的来源，可分 为基因组和cDNA。
建立的主要目的在于使用合适的方法，从 中鉴定出特定的一个克隆对其进行鉴定。
已发现三种类型的限制性内切酶，它们在组成、与修饰酶活性关系和切 割性质上有如下差别：（1）Ⅰ类限制性核酸内切酶：由3种不同的亚基 组成，兼有修饰酶和依赖于ATP的内切酶活性，它能识别和结合于特定 的DNA序列位点，但随机切断在识别位点以外的DNA序列（通常在识别 位点周围400bp~700bp）。这类酶的作用需要Mg2+、SAM及ATP；（2） Ⅱ类限制性核酸内切酶：不具有修饰酶活性，只由一条肽链组成，需要 Mg2+，但不需要SAM和ATP，其切割DNA特异性最强，且在识别位点内 部切断DNA，93%的限制性内切酶属于此类；（3）Ⅲ类限制性核酸内切 酶 与Ⅰ类酶相似，需要Mg 2+和ATP，但切点在识别序列周围25bp~30bp 范围内。显然，II类限制性内切酶最适合于基因克隆，通常在重组DNA 技术中提到的限制性内切酶都属于此类。
大肠杆菌是最常用的原核宿主菌，原因是对它 比较了解，操作起来也特别容易。酵母是最常 用的真核宿主细胞，其很多性质与大肠杆菌相 似；草地贪夜蛾的培养细胞专门用来接受改造 过的昆虫杆状病毒载体。
将重组DNA引入到宿主细胞的途径
转化 转染 电穿孔 脂质体介导 弹道基因转移
重组体的选择和筛选
（2）某些载体还含有真核细胞DNA复制起始区，以方便 在真核细胞内的自主复制；
（3）含有集中了多种常用的限制性内切酶切点的多克隆 位选择性标记，有利于克 隆的筛选和鉴别；
目前使用的载体多衍生于质粒、噬菌体和病毒。
建立的主要目的在于使用合适的方法，从 中鉴定出特定的一个克隆对其进行鉴定。
已发现三种类型的限制性内切酶，它们在组成、与修饰酶活性关系和切 割性质上有如下差别：（1）Ⅰ类限制性核酸内切酶：由3种不同的亚基 组成，兼有修饰酶和依赖于ATP的内切酶活性，它能识别和结合于特定 的DNA序列位点，但随机切断在识别位点以外的DNA序列（通常在识别 位点周围400bp~700bp）。这类酶的作用需要Mg2+、SAM及ATP；（2） Ⅱ类限制性核酸内切酶：不具有修饰酶活性，只由一条肽链组成，需要 Mg2+，但不需要SAM和ATP，其切割DNA特异性最强，且在识别位点内 部切断DNA，93%的限制性内切酶属于此类；（3）Ⅲ类限制性核酸内切 酶 与Ⅰ类酶相似，需要Mg 2+和ATP，但切点在识别序列周围25bp~30bp 范围内。显然，II类限制性内切酶最适合于基因克隆，通常在重组DNA 技术中提到的限制性内切酶都属于此类。
大肠杆菌是最常用的原核宿主菌，原因是对它 比较了解，操作起来也特别容易。酵母是最常 用的真核宿主细胞，其很多性质与大肠杆菌相 似；草地贪夜蛾的培养细胞专门用来接受改造 过的昆虫杆状病毒载体。
将重组DNA引入到宿主细胞的途径
转化 转染 电穿孔 脂质体介导 弹道基因转移
重组体的选择和筛选
（2）某些载体还含有真核细胞DNA复制起始区，以方便 在真核细胞内的自主复制；
（3）含有集中了多种常用的限制性内切酶切点的多克隆 位选择性标记，有利于克 隆的筛选和鉴别；
目前使用的载体多衍生于质粒、噬菌体和病毒。
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定，折衷方法是１２℃过夜。
3. ＤＮＡ的平末端和粘性末端
由于内切酶产生的ＤＮＡ末端有平末端和粘 性末端，因而连接反应中就有平未端连接和 粘性末端连接。 二者连接效率不同。
粘性末端效率高，因而在底物浓度，酶浓度 选择上是有差异的，
4.碱性磷酸酶处理质粒载体
为了提高连接效率，一般采取提高ＤＮＡ的浓度， 增加重组子比例。这样就会出现ＤＮＡ自生连接 问题， 为此通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶 处理，除去其５’末端的磷酸基，防止环化， 通过接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修 复。
根据点样量制备合适厚度的琼脂糖凝胶板； 切胶时尽可能切掉不含ＤＮＡ片段的凝胶； 要尽量减少ＤＮＡ在紫外下的照射时间以
减少对ＤＮＡ的损伤； 熔胶要完全 。
ＤＮＡ的连接
在T4ＤＮＡ连接酶的作用下，平端或带有相 同粘末端的ＤＮＡ分子可以连接上。ＤＮＡ 连接酶的作分三步：
T4ＤＮＡ 连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP 复合物。
加ＤＮＡse-free的BSA 可以起到稳定酶活性 的作用；
用硅化处理的器皿进行酶切可以提高酶活 性；
酶切所用器皿和ddH2O要经过高温灭菌方可 使用；
ＤＮＡ样品应不含重金属离子
ＤＮＡ片段的胶回收
电泳洗脱法 低熔点琼脂糖凝胶电泳挖块法 冻融回收法 玻璃奶回收法 柱回收法（按说明书进行）
酶-AMP复合物再结合到具有5’-磷酸基和3’羟 基切口的ＤＮＡ分子上，使ＤＮＡ腺苷化。
产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来。
当我们已经获得目的基因片段，选择好适当 的克隆（或表达，转化）质粒载体， 并确定 重组方案后，下面要进行的就是ＤＮＡ片段 之间的体外连接，从而获得重组子。
此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的 基因的扩增以及目的基因表达（如现代基因 工程药物的生产），还可用于序列分析和转 基因等重要生物技术的研究中。
1、ＤＮＡ分子的体外连接
ＤＮＡ分子的体外连接就是在一定条件下， 由ＤＮＡ连接酶催化两个双链ＤＮＡ片段 组邻的５’端磷酸与３’端羟基之间形成 磷酸酸脂键的生物化学过程，ＤＮＡ分子 的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列 基础上进行的。
连接反应中值得注意的几个问题：
1.ＤＮＡ连接酶 常用的ＤＮＡ连接酶有两种： (1)来自大肠杆菌的ＤＮＡ连接酶 (2)来自噬菌体的Ｔ４ＤＮＡ连接酶。 二者的作用机理类似。
实验方法
ＤＮＡ分子的体外连接
１．在无菌Eppendorf管中加入以下溶液：
a. 0.1μg质粒载体，２倍分子的外源ＤＮＡ。
b. 加无菌水至7.5μl，于４５℃加温５分钟使重新
退火的粘端解链， 将混合物冷却到０℃。
c. 加入：
１０×Ｔ４ＤＮＡ连接酶buffer Ｔ４ＤＮＡ连接酶
1μl 0. 1μl
第四部分 ＤＮＡ重组技术
－－ＤＮＡ的酶切、回收和连接转化
ＤＮＡ的酶切反应
分子生物学中经常使用的是II型限制性内切酶。 它能识别双链ＤＮＡ分子中特定的靶序列 （4～8bp),并在该序列内切断ＤＮＡ，形成特 有的粘末端或平端。
一、实验目的
掌握ＤＮＡ酶切的基本原理。 学习和了解限制性内切酶的使用方法。 学习和掌握ＤＮＡ片段胶回收的方法
2．恒温水浴槽
五.注意事项
影响限制性内切酶活性的生物因子： 酶切割位点周围核苷酸两侧的碱基的性
质； 识别序列在ＤＮＡ中的分布频率； 与ＤＮＡ的构象有关（SC,L,OC）； ＤＮＡ的纯度（蛋白、氯仿、SDS、
EDTA、甘油等）；
内切酶用量不超过总反应体积的10%；
消化时间适当延长有利于提高酶活性；
5.连接反应的检测
连接反应成功与否，最后的检测要通过下一 步实验，转化宿主菌， 阳性克隆的筛选来确 定。
我们下面的实验从粘性末端为例操作。
实验试剂
１．纯化后的酶切质粒载体和目的基因。 ２．１０×Ｔ４ＤＮＡ连接酶buffer
200mM Tris-HCl(pH7.6) 50mM MgCl2 50mM 二硫苄糖醇 500μg/ml BSA ３．Ｔ４ＤＮＡ连接酶 ４．5mM ATP
胶回收后用30-50 μl无菌双蒸水洗脱ＤＮＡ片段，取 1-5 μl进行电泳检测，取2-5 μl测定OD260下的光吸收 值，计算ＤＮＡ的浓度。
注：1 OD 260相当于双链ＤＮＡ浓度为50 μg /ml
胶回收注意事项
将电泳槽用ddH2O反复清洗干净, 倒入新鲜 配制的灭菌电极缓冲液；
5mM ATP
1μl
２．盖上管盖，充分混匀，台式离心扣上离心５秒。
３．１２℃下过夜连接反应。
４．反应结束后于－２０℃保存。
结果与分析
电泳检查连接结果： 如何判断连接效果的成功性？
三、试剂与器材
（一）试剂 限制性内切酶；10×内切酶缓冲液 T4ＤＮＡ连接酶；10×连接酶缓冲液 电泳缓冲液 1×TAE 琼脂糖；溴酚兰； 溴化乙锭(工作浓度0.5µg/ml) 酚；氯仿；无水乙醇；70%乙醇；灭菌双蒸
水
（二）实验器材
1．电泳仪、原理
1. 核酸限制性内切酶是在原核生物中发现的 一类专一识别双链ＤＮＡ中特定碱基序列的 核酸水解酶，它们的功能类似于高等动物的 免疫系统，用于抗击外来ＤＮＡ的侵袭。现 已发现几百种限制性内切酶，它们以内切方 式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的ＤＮ Ａ片段5’端为P，3’端为OH。由于限制性内切 酶能识别ＤＮＡ特异序列并进行切割，因而 在基因重组、ＤＮＡ序列分析、基因组甲基 化分析、基因物理图谱绘制及分子克隆等技 术中收到广泛应用。
Ｔ４ＤＮＡ连接酶作用机制
Ｔ４连接酶作用分三步： １.Ｔ４ＤＮＡ连接酶与辅助因子ＡＴＰ形成
酶－ＡＭＰ复合物。 ２.酶－ＡＭＰ复合物结合到具有５’－磷酸
基和３’－羟基切口的ＤＮＡ上，使ＤＮＡ 腺苷化。 ３.产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来.
2.连接反应的温度
ＤＮＡ连接酶的最适反应温度为３７℃， 但在此温度下， 粘性末端的氢键结合很不稳
3. ＤＮＡ的平末端和粘性末端
由于内切酶产生的ＤＮＡ末端有平末端和粘 性末端，因而连接反应中就有平未端连接和 粘性末端连接。 二者连接效率不同。
粘性末端效率高，因而在底物浓度，酶浓度 选择上是有差异的，
4.碱性磷酸酶处理质粒载体
为了提高连接效率，一般采取提高ＤＮＡ的浓度， 增加重组子比例。这样就会出现ＤＮＡ自生连接 问题， 为此通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶 处理，除去其５’末端的磷酸基，防止环化， 通过接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修 复。
根据点样量制备合适厚度的琼脂糖凝胶板； 切胶时尽可能切掉不含ＤＮＡ片段的凝胶； 要尽量减少ＤＮＡ在紫外下的照射时间以
减少对ＤＮＡ的损伤； 熔胶要完全 。
ＤＮＡ的连接
在T4ＤＮＡ连接酶的作用下，平端或带有相 同粘末端的ＤＮＡ分子可以连接上。ＤＮＡ 连接酶的作分三步：
T4ＤＮＡ 连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP 复合物。
加ＤＮＡse-free的BSA 可以起到稳定酶活性 的作用；
用硅化处理的器皿进行酶切可以提高酶活 性；
酶切所用器皿和ddH2O要经过高温灭菌方可 使用；
ＤＮＡ样品应不含重金属离子
ＤＮＡ片段的胶回收
电泳洗脱法 低熔点琼脂糖凝胶电泳挖块法 冻融回收法 玻璃奶回收法 柱回收法（按说明书进行）
酶-AMP复合物再结合到具有5’-磷酸基和3’羟 基切口的ＤＮＡ分子上，使ＤＮＡ腺苷化。
产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来。
当我们已经获得目的基因片段，选择好适当 的克隆（或表达，转化）质粒载体， 并确定 重组方案后，下面要进行的就是ＤＮＡ片段 之间的体外连接，从而获得重组子。
此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的 基因的扩增以及目的基因表达（如现代基因 工程药物的生产），还可用于序列分析和转 基因等重要生物技术的研究中。
1、ＤＮＡ分子的体外连接
ＤＮＡ分子的体外连接就是在一定条件下， 由ＤＮＡ连接酶催化两个双链ＤＮＡ片段 组邻的５’端磷酸与３’端羟基之间形成 磷酸酸脂键的生物化学过程，ＤＮＡ分子 的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列 基础上进行的。
连接反应中值得注意的几个问题：
1.ＤＮＡ连接酶 常用的ＤＮＡ连接酶有两种： (1)来自大肠杆菌的ＤＮＡ连接酶 (2)来自噬菌体的Ｔ４ＤＮＡ连接酶。 二者的作用机理类似。
实验方法
ＤＮＡ分子的体外连接
１．在无菌Eppendorf管中加入以下溶液：
a. 0.1μg质粒载体，２倍分子的外源ＤＮＡ。
b. 加无菌水至7.5μl，于４５℃加温５分钟使重新
退火的粘端解链， 将混合物冷却到０℃。
c. 加入：
１０×Ｔ４ＤＮＡ连接酶buffer Ｔ４ＤＮＡ连接酶
1μl 0. 1μl
第四部分 ＤＮＡ重组技术
－－ＤＮＡ的酶切、回收和连接转化
ＤＮＡ的酶切反应
分子生物学中经常使用的是II型限制性内切酶。 它能识别双链ＤＮＡ分子中特定的靶序列 （4～8bp),并在该序列内切断ＤＮＡ，形成特 有的粘末端或平端。
一、实验目的
掌握ＤＮＡ酶切的基本原理。 学习和了解限制性内切酶的使用方法。 学习和掌握ＤＮＡ片段胶回收的方法
2．恒温水浴槽
五.注意事项
影响限制性内切酶活性的生物因子： 酶切割位点周围核苷酸两侧的碱基的性
质； 识别序列在ＤＮＡ中的分布频率； 与ＤＮＡ的构象有关（SC,L,OC）； ＤＮＡ的纯度（蛋白、氯仿、SDS、
EDTA、甘油等）；
内切酶用量不超过总反应体积的10%；
消化时间适当延长有利于提高酶活性；
5.连接反应的检测
连接反应成功与否，最后的检测要通过下一 步实验，转化宿主菌， 阳性克隆的筛选来确 定。
我们下面的实验从粘性末端为例操作。
实验试剂
１．纯化后的酶切质粒载体和目的基因。 ２．１０×Ｔ４ＤＮＡ连接酶buffer
200mM Tris-HCl(pH7.6) 50mM MgCl2 50mM 二硫苄糖醇 500μg/ml BSA ３．Ｔ４ＤＮＡ连接酶 ４．5mM ATP
胶回收后用30-50 μl无菌双蒸水洗脱ＤＮＡ片段，取 1-5 μl进行电泳检测，取2-5 μl测定OD260下的光吸收 值，计算ＤＮＡ的浓度。
注：1 OD 260相当于双链ＤＮＡ浓度为50 μg /ml
胶回收注意事项
将电泳槽用ddH2O反复清洗干净, 倒入新鲜 配制的灭菌电极缓冲液；
5mM ATP
1μl
２．盖上管盖，充分混匀，台式离心扣上离心５秒。
３．１２℃下过夜连接反应。
４．反应结束后于－２０℃保存。
结果与分析
电泳检查连接结果： 如何判断连接效果的成功性？
三、试剂与器材
（一）试剂 限制性内切酶；10×内切酶缓冲液 T4ＤＮＡ连接酶；10×连接酶缓冲液 电泳缓冲液 1×TAE 琼脂糖；溴酚兰； 溴化乙锭(工作浓度0.5µg/ml) 酚；氯仿；无水乙醇；70%乙醇；灭菌双蒸
水
（二）实验器材
1．电泳仪、原理
1. 核酸限制性内切酶是在原核生物中发现的 一类专一识别双链ＤＮＡ中特定碱基序列的 核酸水解酶，它们的功能类似于高等动物的 免疫系统，用于抗击外来ＤＮＡ的侵袭。现 已发现几百种限制性内切酶，它们以内切方 式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的ＤＮ Ａ片段5’端为P，3’端为OH。由于限制性内切 酶能识别ＤＮＡ特异序列并进行切割，因而 在基因重组、ＤＮＡ序列分析、基因组甲基 化分析、基因物理图谱绘制及分子克隆等技 术中收到广泛应用。
Ｔ４ＤＮＡ连接酶作用机制
Ｔ４连接酶作用分三步： １.Ｔ４ＤＮＡ连接酶与辅助因子ＡＴＰ形成
酶－ＡＭＰ复合物。 ２.酶－ＡＭＰ复合物结合到具有５’－磷酸
基和３’－羟基切口的ＤＮＡ上，使ＤＮＡ 腺苷化。 ３.产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来.
2.连接反应的温度
ＤＮＡ连接酶的最适反应温度为３７℃， 但在此温度下， 粘性末端的氢键结合很不稳