DNA重组-载体构建常见问题及解决方法
载体酶切不完全 同源重组空载
载体酶切不完全同源重组空载1. 概述随着生物技术的发展，基因工程领域的研究日益深入。
在基因工程中，载体酶切和同源重组是常用的技术手段。
然而，有时候在实验进行过程中，会出现载体酶切不完全导致同源重组空载的情况。
这种情况不仅影响了实验结果的准确性，还给科研工作者带来了困扰。
研究载体酶切不完全和同源重组空载的原因以及解决方法对于基因工程领域具有重要意义。
2. 载体酶切不完全的原因（1）酶活性差：一些酶在实验条件下的活性可能会受到影响，导致酶切不完全；（2）酶切位点异质性：某些酶切位点的序列可能存在变异，导致酶切不完全；（3）DNA结构：DNA序列的结构也会影响酶切的效果，一些复杂的DNA结构可能会导致酶切不完全。
3. 同源重组空载的原因（1）载体酶切不完全导致的同源重组空载；（2）实验条件的影响：如温度、pH值等因素可能会影响同源重组的效果；（3）DNA序列的特殊性：一些DNA序列的特殊性可能会导致同源重组空载。
4. 解决载体酶切不完全和同源重组空载的方法（1）优化酶切条件：调整实验条件，如酶的活性、PH值、温度等，以提高酶切的效率；（2）使用多种酶联合酶切：有时候使用多种酶联合酶切可能会提高酶切的效率；（3）DNA序列修饰：对DNA序列进行修饰，如合成修改碱基序列，以改善酶切效果；（4）优化同源重组条件：调整同源重组的条件，如温度、时间等，以提高同源重组的效率。
5. 结语载体酶切不完全和同源重组空载是基因工程领域中常见的问题，解决这些问题对于研究工作者来说具有重要意义。
通过分析载体酶切不完全和同源重组空载的原因，以及采取相应的解决方法，可以有效提高基因工程实验的成功率，促进基因工程领域的发展。
希望今后能有更多的研究能够深入探讨这些问题，为基因工程技术的进步做出贡献。
载体酶切不完全和同源重组空载是基因工程领域中常见的问题，而针对这些问题的解决方法也是多种多样的。
以下我们将进一步探讨这些问题的解决方案，并提出一些新的观点来应对这些挑战。
重组载体构建的方法和步骤
重组载体构建的方法和步骤全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：重组载体构建是基因工程领域中非常重要的一项技术，它可以用来将特定的基因插入到目标细胞中，实现基因的转移和表达。
在科学研究、医学诊断和治疗等领域中都有广泛的应用。
下面我们来详细介绍一下重组载体构建的方法和步骤。
一、选择载体首先我们需要选择一个适合的载体作为基础，常见的载体有质粒、病毒、原核生物等。
在选择载体时需要考虑载体的大小和特性，以及目标基因的大小和需要表达的水平。
同时还需要考虑载体的复制原点、抗生素抗性基因等相关元件。
二、线性化载体接下来我们需要将选择的载体进行线性化处理，以便将目标基因插入到载体中。
线性化可以通过受控的限制酶酶切处理来实现，将载体的环状DNA骨架切割成线性DNA片段。
三、插入目标基因将目标基因与线性化的载体进行连接。
目前常用的方法包括：内切酶切割连接法、PCR扩增连接法、接头连接法等。
这些方法可以有效地将目标基因插入到载体中，并确保插入的正确性和稳定性。
四、转化目标宿主将构建好的重组载体导入到目标宿主细胞中，使其稳定地存在和复制。
转化的方法多样，包括热激转化、电穿孔转化、化学法转化等。
转化效率和载体稳定性是评价转化效果的主要因素。
五、筛选重组子对转化后的细胞进行筛选，筛选出含有目标基因的重组子。
常用的筛选方法包括抗生素筛选、荧光筛选、酵素检测等。
筛选过程中需要注意筛选压力和筛选条件的优化，以提高筛选效率。
六、鉴定重组子对筛选出的重组子进行鉴定，确保其构建正确。
常用的鉴定方法包括PCR扩增、酶切鉴定、序列分析等。
通过这些方法可以验证重组子的结构和功能是否正确，确保后续实验的准确性和可靠性。
七、表达目标基因对鉴定合格的重组子进行表达。
通过选用适当的启动子和调控元件，可以实现目标基因的高效表达。
表达的方法有多种选择，包括转染法、感染法、转基因法等。
表达的效果可以通过荧光显微镜观察、酶活性测定、Western blot等方法进行检测和验证。
DNA测序常见问题分析及解决办法总结
DNA测序常见问题分析及解决办法总结PCR类型测序模板注意事项PCR类型测序模板注意事项•总反应体积建议为50uL或100uL，扩增结束后取3ul用1%左右的琼脂糖电泳检测，应为单一的条带。
3ul样品总量不低于50ng(非常小的PCR产物可以酌情减小)，PCR产物产量过低说明PCR扩增结果不是很理想，应改进条件重新扩增。
•对于有杂带和扩增弥散的PCR产物，需经琼脂糖电泳将目的片段切下来并回收，建议将PCR 产物作克隆后进行测序。
有杂带的和扩增弥散的PCR产物即使通过琼脂糖电泳纯化，测序仍有可能出现双峰等异常结果。
•经上述检测合格的PCR产物，需经过琼脂糖电泳纯化去除未反应的引物，dNTP，引物二聚体等影响测序反应的组分。
有多种纯化方法可供选择，Promega，Qiagen和生工等公司都有相应的产品可供选择。
纯化后的PCR产物经电泳检测估计总量应不低于200ng/Kb(非常小的PCR产物可以酌情减小)。
•与质粒模板相比，PCR产物彼此间差异很大，因此，每个PCR模板应尽可能提供相应的PCR 退火温度和PCR产物的长度，以供测序时参考。
•PCR模板一般不应短于200bp，过短的PCR产物应经克隆后进行测序。
•纯化好的PCR产物应溶于双蒸水中，TE缓冲液会严重影响测序反应。
•若让公司对PCR产物进行纯化，PCR产物需满足∶总量不低于1ug/kb，片段长度不低于200bp •各种PCR测序模板均应提供相应的测序引物，并尽可能提供引物的全序列，并将引物浓度准确稀释到5pmole/ul 。
引物浓度的换算关系∶总ng数 = pmole x 分子量/1000由于PCR产物测序相对较难，为使您能拿到一个好的结果，请尽量满足上述要求。
DNA测序常见问题分析及解决办法总结测序常见问题分析序列中出现N值的常见原因：通常有以下几种情况将造成测序结果中N值较多：•PCR产物直接进行测序，在PCR产物长度以后将无反应信号，机器将产生许多N值。
716-DNA重组常见问题
DNA重组常见问题TaKaRa的内切酶和NEB的内切酶哪个更好一些？参考见解： TaKaRa的内切酶、NEB的内切酶两个公司的酶的品质都非常好。
NEB公司的酶的活性很高，切出两条小带可能是因为出现星活性，可以试试把酶量减半。
NEB的酶很多都是克隆的，所以纯度比较高。
应用磁性微球提取人全血基因组DNA，将提取出的DNA直接用于限制性酶切反应，应用Taq1酶，但发现酶切后产生的是smier片断，即切碎的状态。
不知原因是什么？在做这类实验时，一般是将PCR产物进行酶切，这与实验结果有联系吗？是不是直接提取出的DNA必须要做PCR扩增，才能应用酶切？参考见解：1. 为建立基因组文库时一般才用限制性内切酶酶切人基因组DNA.目的是为获得含有人全部DNA的随机片段的总和.然后再用载体和宿主细胞构建克隆.关于文库建立园内资料很多.lyz703lyz战友感兴趣的话可以自己搜索下.2. 电泳图,酶切后是一片弥散的带,是因为基因组中存在大量Taq1酶的酶切位点,由于操作属于随机酶切,所以得到的DNA也是随机的,而不是大量均一的.那么电泳后的出现这样的结果也很容易解释.3. 一般在PCR后采用酶切是由于酶切模板数目巨大且均一,在了解了被切DNA上有关限制性内切酶位点的信息后,我们就可以根据自己的目的来选择合适的内切酶进行酶切.做抑制差减杂交,需要回收细菌基因组酶切(Alu1酶)后的全部片段,要求回收后至少是6微升,浓度要有0.3微克\微升,按照抑制差减杂交说明书,采用酚仿抽提和无水乙醇沉淀法,只要酶切2微克基因组就能满足条件,可已经把酶切量扩大到10多微克了,回收还是达不到浓度(大约只有0.06微克\微升),又不敢切胶回收,怕EB对后续反应造成影响。
请教该怎么办？参考见解：回收酶切产物浓度低的原因可能是：苯酚/氯仿抽提时损失太多。
说明书上说苯酚/氯仿/异戊醇和氯仿各抽提两次，这样经过四次抽提DNA损失得非常多，解决办法是将50?l酶切产物加等体积的灭菌去离子水，然后再抽提，损失会减少很多；另外乙醇沉淀时可以延长，低温沉淀会提高得率；还有用80％乙醇洗涤沉淀弃上清时，要轻轻用移液枪吸出，防止将沉淀随上清倒出。
载体构建介绍
5.常见问题
选择标记类型和选择 1、选择性标记类型 药物抗性（如Kan，Amp等） 营养依赖性标记（如SC-Leu 等） 2、如何选择 根据所选载体上所带的标记
5.常见问题
Gateway系统引物设计-需要对读码框
这是因为中间载体和终载体上某些编码氨基酸或者抗性 基因同目的片段共用一个起始密码子。
载体构建
戎浩 2015.12
C
ONTENTS
目录
1 2 3 4
载体简介 载体构建
注意事项 常见问题
1.载体简介
目的基因的克隆与鉴定
ห้องสมุดไป่ตู้
生理检测 纯化
载体构建
大肠转化，质粒 提取与鉴定
移栽
分子检测
继代繁殖 农杆菌的转化与活化
外植体制备
筛选
浸
染
共培养
1.1载体
载体（vector） ，能将外源DNA或基因片段携带入 宿主细胞内的一个具有自我复制能力的DNA分子。
退火温度不合适，设置梯度，选择最适退火温度
2、条带不单一
引物不特异，适当增长引物序列长度；
适当提高退火温度
5.常见问题
载体酶切的问题 1、酶切质粒浓度和纯度要好 2、酶切温度和时间
如果两个酶的最适温度不同，建议单酶切，回收后在
用另一个酶切，时间最好过夜切。 3、没有切开 可能是酶失活，建议酶切时增加阳性对照，确定酶是 否好用
5.常见问题
克隆基因的酶切位点及引物问题 1、单酶切 单酶切后进行连接，质粒自连、目的片段自连、目的
片段之间连接、目的片段和载体各种错误连接、目的片段
反向连接等等，尽量不选单酶切 2、保护碱基数目的问题。 在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保 护碱基，这会使得酶切效率大大提高。
载体构建介绍
1.2载体的功能
运送外源基因高效的转入到受体细胞中 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供条件
1.3载体应具备的条件
具有对受体细胞的可转移性 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 具有多种单一的酶切位点 具有合适的选择性标记
2.载体构建（酶切连接）
3.3 PCR
为获得和目的基因完全相同的序列，一般使用高保真酶 进行目的片段的扩增。（加尾）
3.4 PCR产物纯化
目的片段
琼脂糖凝胶电泳
切胶回收（方法参照试剂盒）
1.避免一些非特性条带 2.防止PCR体系中一些成分对转化的影响
3.5 BP反应
3.6 大肠杆菌转化 3.7 质粒提取
3.8 LR反应
现在人们还在不断寻找新的载体，如叶绿体或线粒体 DNA也有可能成为载体。
1.2载体的分类
克隆载体
植 物 基 中间载体 因 工 程 卸甲载体 载 体
表达载体ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
一元表达载体 双元表达载体
1.2载体分类
克隆载体
可携带出入的外源 DNA片段并可转入受体 细胞中大量扩增的DNA 分子。通常含有筛选 标记，在插入外源的 基因的时候不会破坏 载体本身的自我复制 功能。
1.2载体分类
中间载体
1.2载体分类
卸甲载体
野生型的Ti质粒不能直接作为基因工程的载体，期TDNA区存在一段阻碍细胞分化和植株再生的基因Onc， 将其切除，即“解除”其“武装”，因此称为卸甲载 体。
1.2载体分类
双元表达载体
一般植物表达载体 是成套使用的，一套 中有两个，一个是带 有可以供插入外源表 达基因的MCS和筛选 标签的融合蛋白（通 常是GFP，GUS或抗性 基因蛋白）的普通表 达载体。另一个载体 就是双元表达载体。
重组质粒构建注意事项
重组质粒构建注意事项重组质粒构建是现代生物学中常用的技术手段，其能够利用DNA重组技术将感兴趣的基因片段插入到质粒中，从而探究基因的功能、调控及其在生物体中的作用。
下面是重组质粒构建中需要注意的一些关键问题。
1.选择合适的质粒载体：质粒是一种能够自主复制的小型DNA分子，其可以含有多个对基因表达有重要影响的元件，如启动子、终止子、选择性标记基因等。
因此，选择合适的质粒载体对于重组质粒构建至关重要。
一般而言，常用的质粒载体有pUC19、pBR322、pBluescript等，根据实验需要选择适合的质粒载体。
2.选择合适的限制性内切酶：限制性内切酶是能够识别特定的DNA序列并具有切割作用的酶。
在重组质粒构建中，常需要利用限制性内切酶切割质粒载体和目标基因片段的DNA，从而产生互补的粘性末端，便于二者连接。
因此，选择适合的限制性内切酶对于重组质粒的构建是非常重要的。
3.设计合适的引物：引物是在PCR扩增反应中用于识别目标DNA序列的短小DNA片段。
在重组质粒构建中，利用引物扩增目标基因片段是必不可少的步骤。
因此，设计合适的引物非常重要。
引物应具有良好的特异性，能够特异性地扩增目标基因片段，并且不会与质粒载体序列发生非特异性扩增。
此外，引物还可以设计一些限制性内切酶切割位点，以便于后续的连接工作。
4.进行寡核苷酸连接反应：连接反应是指将质粒载体和目标基因片段进行连接的步骤。
常用的方法有T4 DNA连接酶的连接反应和PCR引物连接法。
在连接反应中，需要注意合适的反应条件，例如连接反应的时间、反应体系的pH值、温度等，对连接效果有重要影响。
5.转化宿主细胞：转化是指将重组质粒导入宿主细胞中。
在进行转化实验时，需要注意选择合适的宿主细胞，例如大肠杆菌（E. coli）等，以及适当的培养基、适宜的温度和容器。
此外，还需要注意进行适当的筛选压力，如在含有选择性抗生素的培养基中进行培养，筛选能够稳定带有重组质粒的转化子。
DNA提取和常见问题分析及对策
D NA提取和常见问题分析及对策主讲人：**DNA简单介绍DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象。
为了进行测序、杂交和基因的表达，获得高分子量和高纯度的DNA是非常重要的前提。
D N A提取原则保证DNA结构的完整性纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质 排除有机溶剂和金属离子的污染蛋白质、多糖、酚类等降低到最低程度排除其他核酸分子的污染D N A提取的几种方法一、染色体DNA的提取CTAB法SDS法其它D N A提取的几种方法二、非染色体DNA的提取质粒DNA的提取•碱裂解法•煮沸法线粒体、叶绿体DNA的提取•差速离心结合SDS裂解法CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。
该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇或异丙醇沉淀即可使核酸分离出来。
注：CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。
CTAB法流程图植物材料裂解液异丙醇沉淀液氮研磨抽提离心洗涤DNA溶液细胞裂解上层溶液干燥溶解CTAB中各个组分的作用CTAB提取缓冲液的经典配方Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+离子或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。
CTAB提取缓冲液的改进配方PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。
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载体构建中常见问题及解决方法
重组质粒构建是常用的分子生物学手段，是研究相关分子及蛋白功能的基础，是生化分子实验中最基本的方法，但是其中还是有些基本的技巧需要掌握。
下面我总结一下自己的经验，以期能为虫友们提供借鉴，希望多少给大家一下借鉴。
所涉及内容如下：
1)克隆基因的酶切位点问题
2)目的片段的扩增
3) 载体酶切的问题
4) 连接片段浓度比的问题
5）菌液的提取
6）酶切鉴定
7）表达鉴定
一、克隆基因的酶切位点问题
1、克隆位点选择的问题。
首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。
然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。
双酶切时尽量选择酶切温度相同，buffer一致，双酶切效率高的两个内切酶，二者最好是您实验室常用的酶。
2、保护碱基数目的问题。
在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。
但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。
这种忽视可能会大大影响后续的实验进展。
参考常用的酶切位点保护碱基，选择酶切时间短且酶切效率高的碱基数。
注释：
1．如果要加在序列的5‘端，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的5’端加上相应的碱基（黑色），相同如果要在3‘端加保护碱基，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的3’端加上相应的碱基（黑色）。
2．切割率：正确识别并酶切的效率
3. 加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基
二目的片段的扩增
目的片段扩增失败的原因和可采取措施：
1）无条带：引物设计错误，找人帮忙看看引物设计是否合理；退火温度不合适，设置梯度，选择最合适的退火温度；
2）条带不单一：引物不特异，适当增长或引物序列长度；
3）出现引物二聚体，适当提高退火温度或者重新设计引物。
三载体酶切的问题
酶切效率直接影响后续实验的成功率，酶切过程的注意事项：
1）酶切质粒浓度和纯度要好
2）酶切温度和时间，如果两个酶的最适温度不同，建议单酶切，回收后在用另一个酶切，时间最好过夜切
四连接片段浓度比的问题
1）连接比例的确定：上一步酶切产物回收后，用琼脂糖凝胶电泳比较载体和目的片段的亮度，确定体积比，一般载体：片段=1:3~1:5；
2）连接时间和温度：现在很多连接酶都比较高效了，室温2个小时就可以了，如果后续实验检测阳性克隆较少，可采用16℃过夜连接提高连接成功率；
3）未避免后续菌落PCR的假阳性情况，建议连接转化时做对照组：酶切后的载体做自连接对照，如果对照组与实验组长出的克隆数相差不大则很可能存在载体自连或者没完全切开的情况，建议先不要做后续验证，重新从酶切开始，增加酶量及酶切时间、适当减少所切载体的量、改变连接比等；如果对照组没有克隆形成或鲜有克隆形成，则可继续进行后续验证。
五菌液的提取及菌落PCR
挑菌时选择个头较大的单克隆，摇菌培养时间不宜过长。
为了方便发现问题，菌落PCR要设置阳性对照组（原始目的片段做模板）和阴性对照组（以双蒸水为模板）。
出现的问题和可采取措施：
1）多次PCR均无阳性克隆存在：假阳性过高，可能是由于抗性失效，建议换培养皿；
2）阴性对照组也有条带：可能是因为引物或其他试剂被模板污染了，建议所有试剂全部换掉；
3）阳性对照也无条带：酶失活或者其它试剂发生问题或忘记添加，重
新换试剂PCR鉴定
鉴定为阳性的克隆记得保存原菌液，避免后续转化过程发生突变而丢失连接成功的克隆。
六酶切鉴定
菌落PCR阳性的质粒，提取后不一定能够酶切鉴定成功，针对可能存在的问题介绍一下相应的改善措施
1）质粒浓度尽量高点，如果提出的质粒浓度较低，建议重新转化到高拷贝的细菌中，再重新提质粒进行酶切鉴定（如BL21属于低拷贝菌，DH-5α和JM109属于高拷贝菌）
2）没有切开：可能是酶失活，建议酶切时增加阳性对照，确定酶是否好用。
七表达鉴定
有的克隆前面的步骤都正确，可就是不表达：
1）有的载体质粒为单顺反子，且启动子位于多克隆位点之后，这种情况要求在扩增目的片段是引物要含有起始密码子，否则是无法表达出相应蛋白的。
2）注意表达细胞系的状态及转染效率，转染效率可以用带荧光标签的载体进行检测。
当然，最后一定要送测序，确定完全无误后方可进行后续的实验研究。
如果是研究蛋白功能，当测序结果不是100%的时候，检查差异的碱基是不是同义突变，如果是，也不影响后续实验的。
如：UCU,UCC,UCA,UCG均编码丝氨酸。