实验五 固定化脲酶活力的测定
固定化技术实验报告
固定化技术实验报告实验目的：本实验旨在掌握固定化技术的原理和方法，了解固定化酶和固定化细胞在生物技术领域的应用，并通过实验操作加深对固定化技术的理解。
实验原理：固定化技术是一种将生物催化剂（如酶、细胞等）固定在某种载体上，以便于重复使用和提高催化效率的技术。
固定化方法主要包括吸附法、包埋法和共价结合法等。
固定化后的生物催化剂具有稳定性高、易于分离和回收等优点。
实验材料：1. 酶样品：以过氧化氢酶为例。
2. 固定化载体：琼脂糖凝胶、多孔聚丙烯酰胺凝胶等。
3. 实验试剂：过氧化氢溶液、缓冲液等。
4. 实验器材：离心机、恒温水浴、移液枪、量筒、试管等。
实验步骤：1. 准备固定化载体：将琼脂糖凝胶或多孔聚丙烯酰胺凝胶按照说明书比例溶解在水中，形成凝胶溶液。
2. 固定化酶：将酶样品与凝胶溶液混合，通过吸附或包埋的方式使酶固定在凝胶载体上。
3. 固化：将混合后的凝胶溶液倒入模具中，放入恒温水浴中固化。
4. 切割固定化酶：将固化后的凝胶切成适当大小的块状，用于后续实验。
5. 活性测定：将固定化酶块放入含有过氧化氢的缓冲液中，测定固定化酶的催化活性。
6. 重复使用性测试：将固定化酶块重复使用多次，观察其催化活性的变化情况。
实验结果：1. 固定化酶的活性测定结果显示，固定化后的酶具有较高的催化效率。
2. 重复使用性测试结果表明，固定化酶在多次使用后仍能保持较高的活性，显示出良好的稳定性。
实验讨论：固定化技术在提高酶的稳定性和重复使用性方面具有显著优势。
实验中采用的吸附法和包埋法操作简单，适合实验室规模的操作。
然而，固定化过程中可能存在酶失活的风险，需要进一步优化固定化条件以提高酶的活性和稳定性。
实验结论：通过本实验，我们成功地掌握了固定化技术的原理和操作方法，并通过实验验证了固定化酶的高催化效率和重复使用性。
固定化技术在生物技术领域具有广泛的应用前景，值得进一步研究和开发。
参考文献：[1] 张三. 生物固定化技术原理与应用[M]. 北京：科学出版社，2020.[2] 李四. 固定化酶的制备与应用研究[J]. 生物工程学报，2019,35(4): 678-685.注：以上内容为示例，实际实验报告应根据实验操作和结果进行详细撰写。
脲酶实验的测定实验报告
一、实验目的1. 了解脲酶的基本性质及其催化反应原理。
2. 掌握脲酶活性测定的实验方法。
3. 通过实验验证脲酶活性受温度、pH值等因素的影响。
二、实验原理脲酶是一种水解脲的酶，可以将脲分解为氨和二氧化碳。
在酸性条件下，氨与苯酚反应生成蓝色络合物，通过测定蓝色络合物的吸光度，可以计算出脲酶的活性。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：脲酶溶液、脲底物、苯酚、硫酸、NaOH、pH缓冲液、蒸馏水、移液器、试管、恒温水浴锅、紫外可见分光光度计等。
2. 实验仪器：移液器、试管、恒温水浴锅、紫外可见分光光度计等。
四、实验方法1. 配制脲酶溶液：取一定量的脲酶粉末，加入适量的蒸馏水溶解，配制成一定浓度的脲酶溶液。
2. 配制底物溶液：将脲底物与苯酚按照一定比例混合，加入适量的硫酸，配制成底物溶液。
3. 脲酶活性测定：a. 取一定量的脲酶溶液，加入底物溶液，混匀；b. 将混合液置于恒温水浴锅中，设定一定的温度；c. 在一定时间内，每隔一定时间取样，用紫外可见分光光度计测定吸光度；d. 根据吸光度计算脲酶活性。
五、实验结果与分析1. 温度对脲酶活性的影响：a. 在不同温度下（如25℃、30℃、35℃、40℃、45℃）进行实验，记录吸光度；b. 根据吸光度计算脲酶活性；c. 分析温度对脲酶活性的影响。
2. pH值对脲酶活性的影响：a. 在不同pH值条件下（如pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）进行实验，记录吸光度；b. 根据吸光度计算脲酶活性；c. 分析pH值对脲酶活性的影响。
六、实验结论1. 温度对脲酶活性的影响：在一定范围内，随着温度的升高，脲酶活性逐渐增强；超过最适温度后，脲酶活性逐渐降低。
2. pH值对脲酶活性的影响：在一定范围内，随着pH值的升高，脲酶活性逐渐增强；超过最适pH值后，脲酶活性逐渐降低。
七、实验注意事项1. 实验过程中应严格控制温度和pH值，以保证实验结果的准确性。
2. 操作过程中注意移液器的准确使用，避免污染和误差。
脲酶的测定方法
一、脲酶测定(比色法)脲酶是对尿素转化起关键作用的酶，它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用来表示土壤供氮能力。
1、试剂配制：（1）pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g 氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。
（2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL 丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。
称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。
使用前，取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。
（3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，（1.9g次氯酸钠溶于1L水中）溶液稳定。
（4）10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。
（5）N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL 含0.1mgN的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。
2、操作步骤称取5ｇ土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15ｍｉｎ;往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液(ｐＨ6.7),仔细混匀。
在37℃恒温箱中培养24ｈ。
然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上),摇荡,将悬液过滤。
取滤液1mL置于50mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至10mL,然后加入4mL苯酚钠溶液,并立即加入3mL次氯酸钠溶液，加入每一试剂后,立即将混合物摇匀,20ｍｉｎ后,将混合物稀释至刻度,在波长578ｎｍ处测定吸光值。
脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态氮量。
标准曲线绘制：分别取0、1、3、5、7、9、11、13mL氮工作液置于50mL容量瓶中，加蒸馏水至20mL，再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀，20min后显色，定容。
1h内再分光光度计上于578nm处比色。
脲酶、蛋白酶和L-天冬酰胺酶活性测定方法
一、脲酶活性测定方法（苯酚钠-次氯酸钠比色法）1.称取5g过100目筛的风干土样于50ml容量瓶中，加入1ml甲苯使其与土样充分混匀静置15min，使土壤中微生物被完全杀死；2.往瓶中加入10ml 100g/L的尿素溶液和20ml柠檬酸盐缓冲液，仔细混匀后置于37℃恒温下培养24h；3.用加热至38℃的蒸馏水稀释至刻度线（甲苯应浮在刻度线之上），摇匀，过滤；4.每一土样都设置用水代替基质的对照；对整个实验，设置无土壤的对照，以检验试剂的纯度；5.吸取3ml滤液到50ml容量瓶中，用水稀释至15ml，然后加入4ml苯酚钠溶液，并加入3ml次氯酸钠溶液，每次加完试剂都要摇匀；6.静置20min后，使其充分显色，定容显色液，于分光光度计578nm处比色，脲酶活性以24h后1g土壤中铵态氮的mg数表示。
1.取25ml酪氨酸基质溶液于100ml三角瓶中，于30℃水浴保温；2.加入5g鲜土，1ml甲苯，混匀后，30℃恒温箱中培养48h；3.取出三角瓶，加入25ml蛋白质沉淀剂，静置30min，待蛋白质沉淀后用干滤纸过滤；4.取2ml滤液于试管中，加入0.55mol/L Na2CO35ml，33% Folin试剂1ml，立即振荡；5.将试管放入30℃恒温水浴中，显色30min；6.用分光光度计在波长680nm处测定光密度，由标准曲线查出酪氨酸含量。
1.称取5g鲜土（过10目）于50ml刻度试管中，加0.2ml甲苯和9ml Tris缓冲液，混匀后加入1ml 0.05mol/L L-天冬酰胺溶液，混匀，37℃下培养2h后，加入35ml KCl-Ag2SO4混合溶液，混合均匀，静置冷却至室温（约5min），用KCl-Ag2SO4混合溶液定容，混匀；2.吸取20ml L-天冬酰胺溶液前，加入KCl-Ag2SO4混合溶液。
酶的固定化及性质研究
实验五酶的固定化及性质研究一、实验目的1、了解固定化的机理；2、掌握酶固定化原理、操作步骤、固定化酶活的测定方法。
二、实验原理由于游离状态的酶对热、强酸、强碱、高离子强度、有机溶剂等稳定性较差，易失活，并且反应后混入催化产物等物质，纯化困难，不能重复使用。
为了克服这些问题，酶固定化技术于20世纪60年代应运而生并发展起来。
它是通过化学或物理的手段，用载体将酶束缚或限制在一定的区域内，使酶分子在此区域进行特有和活跃的催化作用，反应完成后可将其回收。
用酶固定化技术是实现酶重复连续使用的有效手段，是降低酶成本的有效方法。
酶固定化方法大致可分为4类：吸附法、交联法、包埋法、共价结合法。
吸附法是最早出现的酶固定化方法，包括物理吸附和离子交换吸附。
该法条件温和，酶的构象变化较小或基本不变，因此对酶的催化活性影响小，但酶和载体之间结合力弱，在不适pH、高盐浓度、高温等条件下，酶易从载体脱落。
共价结合法先借助于一些方法，在载体上引进一活泼基团，然后在此活泼基团再与酶分子上的某一基团反应，形成共价键的方法。
该方法常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等，其中戊二醛的应用最为广泛。
本实验采用载体交联法将酶固定在壳聚糖上，研究其固定化条件、固定化酶的特性三、实验器材与试剂1．试剂：戊二醛、壳聚糖、ABTS。
2．器材：可见分光光度计、砂性漏斗、试管、酸度计四、操作步骤1、酶的固定化：称取1g壳聚糖溶于1%冰醋酸100ml，玻棒搅拌使其溶解均匀，再逐滴加入用2 mol/L NaOH使其产生白色絮状沉淀，水洗至中性，抽滤脱水制成湿状壳聚糖载体。
先加入5%戊二醛，在室温下振荡（2h）搅拌后静置，抽滤，洗去多余戊二醛。
再加入一定量酶液，搅拌振荡1h，静置、抽滤，得固定化漆酶。
2、固定化酶酶活测定：测定反应体系同游离酶，称取0.1g 固定化酶与底物混合，搅拌反应，用注射器滤嘴过滤后取上清液，于420nm 处测光吸收值。
脲酶定性的实验
脲酶定性的实验随着膨化技术在饲料工业中推广普及,越来越多的饲料生产商在配方中使用膨化大豆粉,与其它蛋白资源一样,大豆的适度熟化非常重要,熟化程度低会含抗胰蛋白酶等营养抑制因子,熟化度过高又会导致氨基酸利用率低.判断膨化大豆粉是否合格的主要指标是脲酶活性.脲酶活性是指：在30±5℃和PH值等于7的条件下,每分钟每克膨化大豆分解尿素所释放的氨态氮的毫克数.脲酶本身无营养意义,但它与抗胰蛋白酶的含量接近,并且遇热变性失活的程度与抗胰蛋白酶相似,因此,尿酶活性用来作为膨化大豆加热是否合适的间接估测指标.脲酶活性没有负值,最低为0.在我国现行的国标推荐值为0.3,在美国一般认为以不超过0.2为宜,并且针对日粮中有尿素的反刍动物而言不得超过0.12,当然对于家禽和猪0.3或稍高都可以接受.国内很多大企业一般均采用0.2.实验室定量测定脲酶活性的方法较复杂,有滴定法和pH增值法两种,已有研究表明两者对同一样品测得的数值也不相等.目前国内绝大部分企业都采用快速而简单的简易判定方法定性地估测脲酶活性,一般来说,主要有如下两种方法.一.液态法1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨,会使酚红指示剂改变颜色.2.试剂2.1尿素:GB696,分析纯.2.2酚红指示剂2.2.1称取0.1g酚红,加1.43mL0.1mol/L氢氧化钠溶液,在研钵中研磨以促溶解；2.2.2转移至250mL定量瓶中,加蒸馏水至刻度,摇匀备用.3.操作方法3.1取0.2g粉末样品,置于25mL比色管中.3.2加0.02g尿素,加酚红指示剂2滴,再加水20mL,充分摇匀15s.3.3记录粉红色出现时间,并根据时间判断尿酶活性,颜色出现时间应少于15min. 颜色出现时间脲酶活性1min 极强1～5min 强5～15min 稍有15min 无同时作空白对照试验.样品空白(不加尿素)及试剂空白(不加样品),只有上述空白正常时,即酚红指示剂不改变颜色,试验结果才是可靠的.一般企业认为7、8分钟变色较为合适.二、半固态法1.原理：大豆制品中的脲酶可使尿素分解成氨,会使酚红指示剂改变颜色.2.试剂2.1稀硫酸（H2SO4）0.2N.2.2尿素一酚红试剂2.2.1将1.2克酚红溶解于30ml0.2N的NaOH中；2.2.2用蒸馏水将之稀释至约300mL；2.2.3加入90g尿素（分析纯）并溶解之；2.2.4用蒸馏水稀释至2L；2.2.5加入14mL 1.0N的H2SO4或70mL o.2N的H2SO4；2.2.6用蒸馏水稀释至最后体积3L；2.2.7溶液应具明亮的琥珀色.3.操作方法3.1在一个150ml的烧杯中倒入少量试剂,注意溶液必须呈明亮的琥珀色.若溶液已转变为深桔红色,滴人稀硫酸溶液并搅拌之,直至溶液再度呈琥珀色.3.2量一匙粉末样品,放置于培养皿中.3.在样品上加入两匙试剂,轻轻搅拌,将样品平铺于培养皿中.若仍有干样品斑点,则再加入试剂,直至将样品浸湿.4.放置5分钟后观察：a. 没有任何红点出现：再任其放置25分钟,若仍无红点出现,说明大豆粉过熟.b. 有少量红点：少量尿素酶活性,可用.c. 样品表面约有25％为红点覆盖：少量尿素酶活性,可用.d. 豆饼表面约有50％为红点覆盖：尿素酶活性较高,不可以使用.e. 豆饼表面的75％－100％为红点覆盖：尿素酶活性很高,样品过生,不能使用. 以上两种简易脲酶活性估测方法在国内各饲料厂被广泛采用,尤其是后者在膨化大豆粉生产的在线检测上很普遍.尽管这两种方法原理一样,但是,因其操作过程差异,所以对膨化大豆粉品质的反映内容也不尽相同.三、液态法和半固态法之比较首先需要说明的是,这两种脲酶活性快速检测方法没有行业约定俗成的名称,笔者接触过的企业均只采用其中的一种方法,对前者可以称之为“试管法”,后者称之为“表面皿法”,根据其实施的过程及样品的状态,笔者将其区分为“液态法”和“半固态法”.从实施方法来看,液态法是过程检测,从开始一直到规定时间段结束,而半固态法属于断点检测,是5分钟后看结果；液态法通过控制各个体合格,总体自然合格,而半固态法要求的是总体符合统计学上的合格,即允许部分个体不合格.简单地说,液态法要求每一个微粒的熟化程度均要满足5分钟以内不变色,如果一个不合格,整个批次为不合格；而半固态法允许部分微粒在5分钟内变色,部分不合格,总体可以是合格的.从这点上来说,液态法对膨化大豆粉的品质要求更高,控制更严格,不仅要求熟化,而且要均匀熟化.举例说明,如果在熟化完全的大豆粉样品中掺入微量（可以是一粒）生大豆粉,液态法会立即变色从而判定为不合格,而半固态法只是增加了一个变色点,总体上仍是合格的.从上可以看出,这两种检测方法对膨化大豆粉品质的反映内容是不一样的.半固态法反映的是产品符合统计学上的合格,而液态法反映的是完全合格.这两种不同检测方法对膨化设备的要求也是有差别的,液态法要求设备能均匀熟化,而半固态法允许产品出现部分不合格,只要总体上符合就可以,对膨化设备的要求自然要低. 可能会有人疑问,膨化大豆粉出来的不都应该是均匀一致的吗?其实不然,物料在膨化机内受到湿、热、机械剪切的共同作用从而熟化,机械剪切对膨化大豆粉所起的作用大约能占三成多,如果结构设计上缺陷或部件磨损,就会导致熟化不均匀.目前湿法膨化大豆粉的出料温度大都在135度左右（对家禽和猪要求可能低点）,六年前,笔者曾遇到过膨化大豆粉出料温度在170度,用液态法检测仍不合格,出来的料有熟的,有褐变的,还有少许夹生的,如果用半固态法检测,估计就合格了.次年,一膨化厂使用某企业膨化机生产膨化大豆粉,因不熟被退货六十吨,根据大部分企业采用半固态法检测的情况,将其以一定比例掺入熟化料中,最终符合统计学上的合格.上述事件,大概就是这两种不同测定方法的实践意义吧.脲酶urease（水解酶）：脲酶试验原理：存在于大多数细菌、真菌和高等植物里.它是一种酰胺酶、能酶促有机物质分子中酶键的水解.脲酶的作用是极为专性的,它仅能水解尿素,水解的最终产物是氨和碳酸.土壤脲酶活性,与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关.根际土壤脲酶活性较高,中性土壤脲酶活性大于碱性土壤.人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况.土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量,也可以通过测定未水解的尿素量来求得.本方法是测定生成的氨量.试剂：1）甲苯2）10%尿素：称取10g尿素,用水溶至100ml.3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184克柠檬酸和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水.将两溶液合并,用1mol/LNaOH将PH调至6.7,用水稀释至1000毫升.4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量乙醇,加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮,用乙醇稀释至100毫升（A）,存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B）.将AB溶液保存在冰箱中.使用前将2溶液各20毫升混合,用蒸馏水稀释至100毫升.5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂,至活性氯的浓度为0.9%,溶液稳定.6）氮的标准溶液：a 精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000ml,得到1ml 含有0.1mg氮的标准液标准曲线绘制：吸取配置好的氮溶液10ml,定容至100ml,即稀释了10倍,吸取1,3,5,7,9,11,13ml移至50ml容量瓶,加水至20ml,再加入4ml苯酚钠,仔细混合,加入3ml次氯酸钠,充分摇荡,放置20分钟,用水稀释至刻度.将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定,以标准溶液浓度为横坐标,以光密度值为纵坐标绘制曲线图.取新鲜土壤7份,每份30g,装于棕色广口瓶中,先将1,3－二氯丙烯溶于丙酮（定量）,6份分别加入不同浓度均为1.5ml的1,3－二氯丙烯,使之在土壤中的浓度分别为1、10、50、100、200、500µg/g,另1份相应加入1.5ml的丙酮作为对照,然后调节土壤的含水量至最大田间持水量的60%（记录此时重量,以便补充水分）.放置于25℃恒温培养箱,培养后第0d、1d,5d,10d（前10d密封,后来测定的敞口）、20d,30d,40d,50d分别取土样检测脲酶的活性.取样前,反复旋转广口瓶,混匀土样,一个处理随机取3个重复.1) 称取5g过1mm筛的风干土样于100ml容量瓶中.2) 向容量瓶中加入1ml甲苯（以能全部使土样湿润为度）并放置15分钟3) 之后加入10ml 10％尿素溶液和20ml柠檬酸缓冲液（PH6.7）,并仔细混合4) 将容量瓶放入37摄氏度恒温箱中,培养24h5) 培养结束后,用热至38摄氏度水稀释至刻度,仔细摇荡,并将悬液用致密滤纸过滤于三角瓶中.6) 显色：吸取3ml滤液于50ml容量瓶中,加入10ml蒸馏水,充分震荡,然后加入4ml苯酚钠,仔细混合,再加入3ml次氯酸钠,充分摇荡,放置20分钟,用水稀释至刻度,溶液呈现（青定）酚的蓝色.7) 1h内在（（青定）酚的蓝色在1h内保持稳定）在分光光度计上用1cm液槽,于578nm处将显色液进行比色测定.8) 无土对照：不加土样,其他操作与样品实验相同.以检验试剂纯度,整个实验设置一个对照9)无基质对照：以等体积的水代替基质,其他操作与样品实验相同.每个土样都设此对照.结果计算：土壤脲酶活性以24小时后100g土壤中NH3－N的毫克数表示.M＝（X样品－X无土－X无基质）*100*10式中：M－土壤脲酶活性值X样品――样品实验的光密度值在标准曲线上对应的NH3－N毫克数X无土――无土对照实验中的光密度值在标准曲线上对应的NH3－N毫克数X无基质――无基质对照实验中的光密度值在标准曲线上对应的NH3－N毫克数100 ――样品定容的体积与测定时吸取量的比值10 ――酶活性单位的土重与样品土重之比值注意事项：当脲酶活性为3-80微克NH3-N时,本法能获得可靠结果.当脲酶活性小于3微克NH3-N,培养时间需增至24小时（已经24h了）（计算时应考虑这一点）计算：脲酶活性以24h后1g土壤中NH3-N的mg数表示.NH3-N（mg）＝a*2A：从标准曲线查得NH3-N毫克数2 ：换算成1k土的系数.。
脲酶活性的测定
大豆制品中脲酶活性的测定定性法：酚红法一、原理：酚红指示剂在pH 6.4-8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶在pH=7.0，T=30℃时可将尿素水解产生氨，释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红的时间长短来判断脲酶活性的大小。
二、仪器和试剂：粉碎机：粉碎时不产生强烈发热；分析天平；25ml纳式比色管；恒温水浴锅；0.1%酚红指示剂：0.1g苯酚红溶于100ml 95%乙醇溶液；结晶尿素；三、方法：将试样粉碎，准确称取0.05±0.001g试样于25ml纳式比色管，加入0.2g结晶尿素及5滴酚红指示剂，加入25ml蒸馏水，摇动10s，立即置于30±0.5℃水浴锅中，开始计时，观察溶液颜色变化，5min 后，取出比色管，摇匀，观察溶液颜色。
空白试验：不加尿素，其他同上。
品质判定：如果溶液为明显的粉红色，则认为该大豆制品脲酶活性超标，为不合格产品。
•0-1min变红，活性非常强（＞1.0）；•1-2min变红，活性大概0.5-1.0；•2-5min变红，活性大概0.3-0.5。
四、注意事项：1.粉碎样品时，不应产生大量热，否则会影响结果判定；2.称量样品时，一定要将样品混合均匀，否则会造成试验误差；3.试样和空白试验同时操作，过程要迅速，防止时间影响。
尿素-酚红法一、原理：酚红指示剂在pH 6.4-8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶可将尿素水解产生氨，释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红样品占所有样品的比例来判断脲酶活性的大小。
二、仪器和试剂：表面皿；0.2N氢氧化钠溶液：称取0.8g氢氧化钠溶于100ml蒸馏水；1.0N硫酸溶液：移取7.0ml浓硫酸溶于500ml蒸馏水；尿素-酚红试剂：用500ml烧杯将0.8g酚红溶于20ml 0.2N氢氧化钠溶液，用蒸馏水稀释至约300ml，加入60g尿素，并溶解之，转移至2L容量瓶，冲洗烧杯数次,加蒸馏水至约1.5L，加入9.4ml 1.0N 硫酸溶液，用蒸馏水定容至2L；此时溶液应具有明亮的琥珀色；（过段时间溶液会变为深橘红色，可滴入稀硫酸溶液搅拌之，直至溶液再次变为琥珀色）三、方法：将一满匙样品放入表面皿中，摊平，将以调好的尿素-酚红试剂滴入表面皿中的样品上，直至完全浸湿，停留5min，观察样品的颜色反应。
脲酶定性实验报告
一、实验目的1. 了解脲酶的催化特性，掌握脲酶催化反应的原理；2. 掌握脲酶定性实验的操作方法；3. 通过实验观察脲酶催化反应的现象，验证脲酶的催化活性。
二、实验原理脲酶是一种催化脲水解的酶，其催化反应的化学方程式为：脲+ H2O → CO2 + NH3在本实验中，我们利用脲酶催化脲水解产生CO2和NH3的特性，通过观察溶液pH 的变化来验证脲酶的催化活性。
当脲酶催化脲水解时，生成的NH3会与溶液中的酸反应，使溶液pH值升高，当溶液pH值达到一定范围时，指示剂会发生颜色变化，从而验证脲酶的催化活性。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）脲酶试剂；（2）脲标准溶液；（3）NaOH标准溶液；（4）酚酞指示剂；（5）pH计；（6）锥形瓶；（7）移液管；（8）烧杯。
2. 实验仪器：（1）分析天平；（2）滴定管；（3）水浴锅；（4）磁力搅拌器。
四、实验步骤1. 配制脲酶溶液：将脲酶试剂溶解于适量的去离子水中，配制成一定浓度的脲酶溶液。
2. 配制脲标准溶液：准确称取一定量的脲，溶解于去离子水中，配制成一定浓度的脲标准溶液。
3. pH计校准：将pH计置于水浴锅中，加入去离子水，用pH计测量水的pH值，根据测量结果校准pH计。
4. 取锥形瓶，加入一定量的脲标准溶液。
5. 用移液管加入一定量的脲酶溶液，使脲酶与脲反应。
6. 将锥形瓶放入水浴锅中，保持一定的温度，使反应进行。
7. 在反应过程中，用pH计测量溶液的pH值，观察pH值的变化。
8. 当溶液pH值达到一定范围时，加入酚酞指示剂，观察溶液颜色变化。
9. 记录实验数据，包括脲酶溶液浓度、脲标准溶液浓度、反应时间、溶液pH值等。
五、实验结果与分析1. 实验现象：在脲酶催化下，脲水解产生CO2和NH3，使溶液pH值升高，当溶液pH值达到一定范围时，加入酚酞指示剂，溶液颜色由无色变为粉红色。
2. 结果分析：通过实验观察到，脲酶催化脲水解反应具有明显的催化活性，能够使溶液pH值发生变化，且加入酚酞指示剂后溶液颜色发生变化，进一步验证了脲酶的催化活性。
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实验五固定化脲酶活力的测定
一、实验原理
固定化酶的活力测定方法，有振荡测定法、酶柱测定法和连续测定法等多种方法。
常用的振荡测定法，是将一定质量的固定化酶放在一定形状和大小的容器中，加入一定量的底物溶液，在固定化酶的最适反应条件下，振荡或搅拌反应系统，反应一定的时间后，取出一定量的反应液，进行酶活力测定。
酶活力测定的反应原理和方法与溶液酶活力的测定方法相同：脲酶催化尿素水解生成氨和二氧化碳，最适反应pH 7.0。
氨与纳氏试剂反应生成黄色配合物，其吸光度与氨浓度成正比。
故可测定脲酶活力的大小。
二、仪器和试剂
1、水浴锅，分光光度计，移液管，比色皿及其他常规仪器
2、实验四制备的固定化脲酶
3、磷酸缓冲液（pH 7.0）：6.7 g Na2HPO4.2H2O，3.25 g KH2PO4，溶于蒸馏
水并定容至100 ml
4、3%尿素溶液：3 g尿素溶于磷酸缓冲液中，并定容至100 ml
5、标准氨溶液：称取在60℃干燥至恒重的分析纯硫酸铵1.322 g，蒸馏水溶
解并定容至100 ml。
此溶液含NH3为40 µM
6、1 M H2SO4溶液：56 ml浓硫酸，缓慢加入盛有600 ml蒸馏水容量瓶中，
冷却后加水定容至1000 ml
7、纳氏试剂：称取16 g氢氧化纳，溶于50 mL水中，充分冷却至室温。
另
称取7 g碘化钾和10 g碘化汞(HgI2)溶于水，然后将此溶液在搅拌下徐徐
注入氢氧化纳溶液中，用水稀释至100 mL，过夜澄清后，倒出上清液贮
于棕色瓶中，密塞保存。
三、实验步骤
1、将实验四中得到的凝胶包埋脲酶重新称重（m1）。
取0.3-0.5 g，切碎。
2、取两支试管编号（1号空白管，3号样品管），分别称取凝胶包埋脲酶100
mg（m2）置于两管中，各加入蒸馏水9 ml，磷酸缓冲液1 ml，于30℃水
浴中保温5 min。
3、向3号管加入30℃预保温的3%尿素溶液1 ml，并准确开始计时；向1
号管加蒸馏水1 ml，于30℃水浴中反应20 min（t），并不断振摇。
4、20 min后两管同时加入1 ml 1 M H2SO4溶液终止反应。
（V1=12 ml）
5、另取3支试管编号（1号、3号与上对应，2号为标准氨溶液），按下表加
入试剂：（V2=0.1 ml）
摇匀后在30 min内，480 nm波长下比色测定吸光度，分别记为A3（样品），A2（标准），A1（空白）。
定义脲酶在30℃，中性条件下，每分钟水解底物产生1 µmol氨的酶量，为1个酶活力单位。
四、结果计算
100 mg脲酶所得到固定化酶的总活力（U）：
（A3—A1）×m1×V1×NH3的摩尔数
U= ×100%
（A2—A1）×m2×V2×t。