植物生理学实验指导

实验一小液流法测植物组织水势一、目的学会用小液流法和质壁分离法测植物组织水势和渗透势。

二、材料用具及仪器药品马铃薯、刀片、移液管、培养皿、蔗糖溶液（1mol/L），显微镜三、原理1、小液流法测植物组织水势植物细胞是一个渗透系统，若将植物细胞放在各种不同浓度的蔗糖溶液中时，由于细胞液的浓度与外界溶液的浓度（或水势）的差异。

两者便会发生水分的交换。

当ψ cell外＞ψw cell时，细胞则吸水，细胞外溶液的浓度↑，细胞外溶液的比重↑。

当ψ cell外＝ψw cell时，细胞液与细胞外溶液水分平衡，细胞外溶液的浓度不变，细胞外溶液的比重不变。

当ψ cell外＜ψw cell时，细胞则失水，细胞外溶液的浓度↓，细胞外溶液的比重↓。

本实验是以有色液滴的比重变化确定等渗浓度。

根据公式，即可计算出外溶液的ψs，即ψs= - CiRT[i:离解系数，蔗糖等于1;c:等渗浓度；R：气体常数，0.0083 MPa·L/mol·K；T表示绝对温度，即273+t（实验时溶液的温度）]。

2、质壁分离法测渗透势ψw＝ψp＋ψs。

当ψ cell外＞ψw cell时，细胞则吸水。

当ψ cell外＜ψw cell时，细胞则失水，发生质壁分离。

当发生初始质壁分离时，ψp＝0 ，ψw＝ψs＝ψ cell外= - CiRT四、方法步骤小液流法测植物组织水势1．按十字交叉法把1mol/L蔗糖溶液（母液）分别配成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mol/L蔗糖溶液各10ml。

分别置于5支大试管中，编号作为实验组。

2．另取5支小试管对应于实验组编号，从实验组取2ml蔗糖溶液作为观察组。

3．切约2mm左右见方的马铃薯片。

4．把马铃薯片放入实验组，每组20片，20分钟后，加一点点亚甲基蓝粉末，摇匀。

5．用吸管吸蓝色液，伸入对应观察组中部，轻轻挤出一滴液滴，轻轻取出吸量管，观察液滴移动方向。

6.根据公式ψs=-CiRT,计算出所测材料的ψ cell质壁分离法测渗透势1、按十字交叉法把1mol/L蔗糖溶液（母液）分别配成0.1、0.2、0.3、0.5、0.6 mol/L 蔗糖溶液各2ml。

2、材料处理：用刀片在蚕豆叶表皮划一方格，用镊子撕下表皮，迅速投入每梯度溶液。

3、镜检确定等渗溶液：视野中1/2细胞在角隅处发生轻度质壁分离的溶液为等渗溶液。

4、计算渗透势。

五、溶液配法：六、思考题1、用小液流法测植物组织水势和质壁分离法测植物组织渗透势有何区别？2、毛细吸量管为何轻轻挤出一滴液滴，为何轻轻取出？ 太快了会造成液滴直接滴下去，影响实验结果3、小液流法和质壁分离法测得的植物组织水势和渗透势与真实值是否完全相等？为什么？用质壁分离法测定的植物细胞渗透势测量值略大于实际值。

小液流法测定植物组织的水势测量值略小于实际值。

实验2 叶绿体色素的提取分离及其性质鉴定一、目的学会叶绿体色素提取和分离的方法，了解叶绿体色素的性质。

二、材料用具及仪器药品1、层析液配方：石油醚20ml+丙酮2ml+苯1ml ，90标号汽油2、天平、研钵、烧杯、量筒、滤纸、表面皿、剪刀、95%乙醇、汽油、漏斗、滴管、手电3、新鲜菠菜叶三、原理叶绿体含有叶绿体色素，叶绿体色素主要包括有Chla 、Chlb 、叶黄素和胡萝卜素，可用有机溶剂乙醇、丙酮等将它们提取出来。

纸层析法是分离叶绿体色素最简单的方法。

它的原理是利用混合色素中各个成分物理、化学性质的差别，分别以不同程度分布于两相中（即固定相和流动相）。

由于它们以不同的速度移动，从而达到分离的目的。

叶绿体色素容易受光的破坏，变成褐色。

叶绿体色素具有荧光现象。

叶绿素分子的镁可被铜替代，形成铜代叶绿素。

叶绿体色素对不同波长的光具有吸收作用。

四、操作方法1、叶绿体色素的提取称取新鲜菠菜叶片5克，剪碎，放在研钵中，加95%乙醇5m1，加石英砂和碳酸钙少许，共研磨成匀浆（约10分钟），加95%乙醇10m1研磨5分钟，过滤。

2、分离叶绿体色素方法一：用滴管吸取上面的色素提取液4～5滴。

一滴一滴地滴在滤纸的中央（滤纸要平放在表面皿或培养皿上）。

待色素点风干后，向该色素点上慢慢滴加汽油，使四种色素（叶绿素a 、叶绿素b 、叶黄素、胡萝卜素）在滤纸上分离出来，四种色素在滤纸上的移动速度是胡萝卜素（橙黄色）>叶黄素（黄色）>叶绿素a(蓝绿色)>叶绿素b （黄绿色）。

方法二：取一块预先干燥处理过的定性滤纸，将它剪成长约10cm ，宽约1cm 的滤纸条。

编号 母液 ml 蒸馏水 ml 溶液浓度 mol/L 1 2 8 0.2 2 3 7 0.3 3 4 6 0.4 4 5 5 0.5 5 6 4 0.6 6 7 3 0.7用毛细管吸取色素提取液。

在滤纸条的一端（约距这一端的1cm处）划出一条滤液细线，等滤液干燥后，再重复划4～5次。

将滤纸条的另一端（约距这一端1cm处）拆成“V”字形，并将它挂在放有层析液的烧杯壁上（注意：色素线要略高于层析液面，且滤纸条下端最好不要碰到烧杯壁），盖上培养皿。

经几分钟后，观察色素带的分布，最上端为胡萝卜素，其次是叶黄素，再次是叶绿素a，最后是叶绿素b。

3、叶绿体色素的性质鉴定（1）叶绿体色素的皂化反应取2.5ml叶绿体色素提取液，加2.5ml30%KOH-甲醇液，充分摇匀，加5ml苯摇匀，静置10分钟，观察。

（2）叶绿素的荧光现象取上述色素乙醇提取液少许于试管中，在反射光和透射光下观察色素提取液的颜色有什么不同。

反射光下观察到的溶液颜色，即为叶绿素产生的荧光现象。

（3）光对叶绿素的破坏作用取上述色素乙醇提取液少许，分装在2支试管中，1支试管放在暗处（或用黑纸包裹），另1支试管放在强光下（太阳光），经2—3小时后，观察两支试管中溶液的颜色有何不同？（4）叶绿素分子的取代反应取上述色素乙醇提取液少许于试管中，1滴1滴地加入盐酸，直至溶液出现褐绿色，此时叶绿素分子已遭破坏，形成去镁叶绿素。

然后加醋酸铜晶体1小粒，慢慢地在酒精灯上加热溶液，使溶液又产生亮绿色，此即表明铜已在叶绿素分子中替代了原来镁的位置。

（5）光对叶绿体色素的破坏取上述色素乙醇提取液少许于试管中，在光和暗条件下观察色素提取液的颜色有什么不同。

五、实验报告1、将纸层析法分离叶绿体色素的实验结果贴在实验报告纸上，并给予分析。

2、解释叶绿体色素的光学性质。

六、思考题1、Chla、Chlb、叶黄素和胡萝卜素在滤纸上的分离速度不一样，这与它们的分子量有关吗？关系不大，主要与它们的极性大小有关2、什么叫叶绿素的荧光现象？铜代叶绿素有荧光现象吗？叶绿素的酒精溶液在透射光下为翠绿色，而在反射光下为棕红色。

这个红光就是叶绿素受光激发后发射的荧光。

这个现象就是荧光现象铜代叶绿素没有荧光现象，将叶绿素分解了实验3 叶绿体色素的吸收光谱、叶绿素a和b含量的测定一、目的了解叶绿体色素的吸收光谱的绘制方法，学会叶绿素a、b含量的测定方法，了解叶片中叶绿素a、b的含量。

二、材料用具及仪器药品菠菜叶片、721分光光度计、天平、研钵、剪刀、容量瓶（25ml）、漏斗、滤纸、乙醇（95%）。

三、原理叶绿素a 、b 在波长方面的最大吸收峰位于665nm 和649nm ，同时在该波长时叶绿素a 、b 的比吸收系数K 为已知，我们即可以根据Lambert Beer 定律，列出浓度C 与光密度D 之间的关系式：D 665=83.31Ca+18.60C b (1)D 649=24.54Ca+44.24 C b (2)(1)(2)式中的D 665、D 649为叶绿素溶液在波长665nm 和649nm 时的光密度。

为叶绿素a 、b 的浓度、单位为每升克数。

82.04、9.27为叶绿素a 、b 在、在波长665nm 时的比吸收系数。

16.75、45.6为叶绿素a 、b 在、在波长649nm 时的比吸收系数。

解方程式(1)(2)，则得 ：C A =13.7 D 665—5.76 D 649 (3)C B =25.8 D 649—7.6 D 665 (4)G=C A +C B =6.10 D 665+20.04 D 649 (5)此时，G 为总叶绿素浓度，C A 、C B 为叶绿素a 、b 浓度，单位为每升毫克，利用上面（3）（4）（5）式，即可以计算叶绿素a 、b 及总叶绿素的总含量。

四、方法步骤叶绿素a 和b 含量的测定1．称取0.1克新鲜叶片，剪碎，放在研钵中，加入乙醇10ml 共研磨成匀浆，再加5ml 乙醇，过滤，最后将滤液用乙醇定容到25ml 。

2．取一光径为1cm 的比色杯，注入上述的叶绿素乙醇溶液，另加乙醇注入另一同样规格的比色杯中，作为对照，在721分光光度计下分别以665nm 和649nm 波长测出该色素液的光密度。

3、计算结果：叶绿素a 含量（mg/g. FW ）=2.01100025⨯⨯A C叶绿素b 含量（mg/g.FW ）=2.01100025⨯⨯B C 叶绿素总量（mg/g.FW ）=2.01100025⨯⨯G 黄色素和绿色素的分离将叶绿体色素的酒精提取液10毫升倒入分液漏斗中，倾斜漏斗，并沿其壁慢慢加入15毫升汽油（或乙醚），轻轻摇动5分钟，静置片刻后，溶液即分为两层，上层为绿色的汽油层，主要含有叶绿素。

弃去上层绿色的汽油层，测定下层黄色溶液的吸收光谱。

五、实验报告计算所测植物材料的叶绿素含量。

绘制黄色溶液的吸收光谱。

六、思考题测定叶绿素a 、b 含量为什么要选用红光的波长？如何绘制4种叶绿体色素的吸收光谱。

叶绿素a ,b 主要吸收红光，蓝紫光，而蓝紫光不容易取得，所以选择红光。

根据测定结果,以波长为横坐标绘制曲线,以测定结果为纵坐标，此即叶绿体色素的吸收光谱曲线。

实验4 叶绿体、光和CO2是光合作用的必要条件一、目的了解光合作用的必要条件二、材料用具及仪器药品天竺葵、银边吊兰、广口瓶、烧杯、1%NaHCO3溶液、3%KOH溶液、95%乙醇、酒精灯、培养皿、滴管、黑纸片、I2-KI溶液（配制：2gKI溶于5ml水中，再加1gI2，溶解后加水595ml）。

三、原理光合作用是绿色植物吸收太阳光的能量。

同化CO2和H2O为机物质，并释放出O2过程，其中光、CO2、叶绿素是光合作用的必要条件，由于一般植物的光合作用能产生淀粉，故以淀粉能否生成即知光合作用是否进行，可借助于淀粉与I—KI产生蓝色反应检查出来。

四、方法步骤1、证明光合作用中叶绿体的必要性。

在早上10时后，选择生长正常的银边吊兰叶放在烧杯中加水煮沸，然后将水倒掉，加入95%乙醇，放在水浴锅里煮沸（注意装着酒精的烧杯不能直接在火焰上加热，以免发生危险），直至叶绿素全部浸出，叶片呈白色为止，此时用镊子取出叶片，并将其展开于表面皿上，滴上I—KI溶液，观察其颜色的变化，可见到原有绿色的部分呈现出蓝色，而非绿色部分则呈白色。