大鼠腹侧中脑多巴胺能神经元的形态学发育与分布特征

* 通讯作者： 曾水林 mail： zsl@ seu． edu． cn 电话： 13951893917 ，E-
姜
宇等： 大鼠腹侧中脑多巴胺能神经元的形态学发育与分布特征
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随 着 分 子 生 物 学 的 发 展， 多 巴 胺 （ dopamine， DA） 能神经元变性疾病引起运动障碍和情感异常的 人们 发病机制成为神经科学领域研究的热点之一， 将研究 目 光 转 向 其 发 育 过 程。 在 中 脑 多 巴 胺 能 （ mesencephalic dopaminergic， mDA） 神经元的发育过 往往要经历有丝分裂、 迁移、 聚集、 分化、 突触 程中， 细胞死亡等一系列的过程。 至今对它的形态、 形成、 生理及病理学研究虽已不少， 但对其发育过程中的 形态学研究不多。 本课题用免疫荧光染色方法对 E16． 5 d 至成年（ 4 月龄 ） 几个发育阶段的大鼠腹侧 中脑 （ ventral mesencephalon， VM ） 酪 氨 酸 羟 化 酶 （ tyrosine hydroxylase positive， TH ） 阳 性 神 经 元 的 形 态与分布进行观察， 为探讨 mDA 神经元的在体发育 提供形态学依据。
结
1
果
VM 内 TH 阳性细胞的形态与分布变化
E16． 5 时， TH 阳性神经元的胞体为圆形或椭圆 B ） 。 TH 形， 胞体小， 突起细而长， 分支较少 （ Fig． 1A阳性细胞密集分布于 VM， 能隐约区分出腹侧被盖区 （ ventral tegmental area，VTA ） 与 黑 质 （ substantia nigra， SN） 区。P0 时， TH 阳性神经元的胞体呈带有 椭圆形， 突起粗大且剖学与组织胚胎学系，南京 210009 ； 2． 扬州大学医学院附属扬州洪泉医院 神经内科，扬州 225200 ）
【摘
要】 目的： 探讨大鼠腹侧中脑多巴胺能 （ mDA） 神经元的形态学发育和分布特征 。方法： 取胚胎晚期至成
以酪氨酸羟化酶 （ TH ） 免疫荧光染色方法观察 mDA 神经元。 结果： 年大鼠不同时期的腹侧中脑连续冠状切片 ， （ 1 ） 在胚胎期， TH 阳性细胞多为圆形或椭圆形 ， 随着发育进程， 其突起逐渐伸长， 分支也逐渐增多； 出生后 28 d， TH 阳性细胞表现为成熟 mDA 神经元的形态特征。（ 2 ） Map2 / TH 免疫荧光检测显示， 新生期大鼠腹侧中脑 TH 阳性神经元定位分布与成年期的 mDA 神经元分布趋向一致。（ 3 ） E16． 5 d 时腹侧中脑 TH 阳性细胞的数量和密 度最大， 此后逐渐下降。结论： 大鼠 mDA 神经元的发育在出生前后 ， 呈现先大量形成后又逐渐减少的过程 ， 与此 同时其形态趋向成熟； 至 P0 d 时 mDA 神经元分布定位基本完成 ， 至出生后 28 d 形态学发育成熟。 【关键词】 酪氨酸羟化酶； 多巴胺能神经元； 免疫荧光； 中脑； 发育； 大鼠
健康 SD 大鼠由东南大学实验动物中心提供 ， 雌 ， 5 ： 16． 5 d （ E16． 5 ） 、 雄不拘 随机分成 组 胚胎 组 新 生（ P0 ） 组、 出生后 7 d （ P7 ） 组、 出生后 28 d （ P28 ） 组 和成年 4 月龄 （ Adult ） 组 （ n = 4 ） 。 小鼠抗大鼠 TH 04051 ， ABR ） 、 2 单克隆抗体 （ OMA1兔 抗 大 鼠 Map20172 ， Santa Cruz） 、 多克隆抗体（ sc冰冻切片机 （ CM 1900 ， LEICA） 和荧光显微镜（ BX60F5 ， Olympus） 。 2 方法 2． 1 免疫荧光检测 各组大鼠经腹腔注射戊巴比 妥钠（ 40 mg / kg ） 麻醉后， 用含 4% 多聚甲醛的磷酸 缓冲液（ PB ） 灌注固定， 取全脑组织置于 4℃ 的上述 相同固定液中后固定 2 h， 再置于含 30% 蔗糖的 PB 溶液中过夜； 冰冻切片 （ 片厚 30 μm ） 后置组织切片 于 0． 01 mol / L PBS 中 漂 洗 5 min， 然 后 用 含 0． 3% Triton X100 的 PBS 溶 液 （ PBT ） 洗 片， 室 温 下 30 min； 再用 10% 山羊血清封闭 2 h； 分别加入小鼠抗 TH（ 1∶ 500 ） 或 / 和兔抗 Map2 （ 1∶ 500 ） 抗体， 4℃ 孵育 FITC 或者山羊抗小 过夜； PBT 洗片后加山羊抗小鼠TRITC / 山羊抗兔FITC 二抗 （ 1 ∶ 200 ） ， 鼠室温孵育 30 min 后 4℃ 过夜（ 遮光） ； 洗片、 贴片及甘油封片后 荧光显微镜下照相。对照实验用 0． 01 mol / L PBS 代 替一抗。 统计学处理： 每个独立组收集数据的样本数 （ n = 4 ） 。荧光显微镜下观察 TH 阳性和 Map2 + / TH 阳性细胞在腹侧中脑的表达分布： 每个样本取腹侧 中脑相同序列切片 6 张， 随机计数 10 个非重叠视野
2011 ， 27 （ 3 ） ：276 ～ 280
神 经 解 剖 学 杂 志 Chinese Journal of Neuroanatomy

大鼠腹侧中脑多巴胺能神经元的形态学发育与分布特征
姜
1， 2 1* 2 1 宇 ， 曾水林 ， 徐春华 ， 李凤飞 ， 杨 1 2 鎏 ， 韩银华
（ 单位面 积， 镜 下 × 200 ） ， 采用图像软件分析系统 （ Olympus， DP Controller ） 计数阳性细胞和测量并计 算细胞面积。细胞计数资料用均数 ± 标准差表示， 所有数据采用 SPSS10． 0 软件进行方差分析 （ ANOVA） ， 以 P ＜ 0． 05 为有显著性差异。
（ 1． Department of Human Anatomy，Histology and Embryology，Medical School of Southeast University，Nanjing 210009 ； 2． Department of Neurology，Yangzhou Hongquan Hospital Affiliated to Medical School of Yangzhou University，Yangzhou 225200 ，China）
材料和方法
1 材料
E ） 。 TH 支， 细胞间的突起相互连接成网状 （ Fig． 1D阳性细胞密集分布于 VM， 在 VTA 区域密集成片， 黑 SNc ） 与网状 质致密部（ substantia nigra pars compact， SN 部分界不清； 致密的纤维丛贯穿 SN 的嘴侧部分， 中间部分和尾侧的网状部， 且 TH 阳性细胞数 （ SN 区单位面积内 TH 阳性细胞数 ） 逐渐减少。 P7 时， TH 阳性神经元胞体呈现多种形态， 多为纺锤形、 锥 形和不规则形， 一级突起增多， 细胞形态与成年期类 似（ Fig． 1F） 。TH 阳性细胞较密集分布于 VTA 区和 SNc， SN 网状部的 TH 阳性神经元明显减少， 可以明 显区分 SNc 和网状部。 P28 时， TH 阳性神经元细胞成熟， 胞体较大呈 类圆形、 梭形、 星形， 胞核呈圆形、 类圆形， 突起呈树 I） 。TH 阳性细胞集中位于 VTA、 SNc， 枝状（ Fig． 1G而 SN 网状 部 分 布 稀 疏， 且 各 区 域 境 界 清 晰； 成 熟 mDA 神经元晚期标志物 DAT 表达阳性 （ 图片资料 TH 阳性神经元细胞成熟， 未提供 ） 。 成年期， 胞体 ， ， （ Fig． 1C ） 。 TH 大 核仁清晰 突起明显 阳性细胞集 VTA 区和中缝核， 中分布于 SNc、 稀疏分布于 SN 网 状部。 2 VM 内 TH 阳性细胞的定位观察 Map2 / TH 免疫荧光双标检测以显示 TH 阳性 P0 大鼠中 神经元在神经细胞中的分布。 观察显示， 脑 TH 阳性神经元定位分布与成年期 mDA 神经元 E） 。 解剖定位分布趋向一致（ Fig． 1D3 VM 内 TH 阳性细胞的密度和单个 TH 阳性细胞 的面积变化 各年龄组 TH 阳性细胞单位面积内细胞的数量 （ 细胞 密 度， 细 胞 数 / 镜 下 × 200 视 野 ） ： E16． 5 时
【Abstract】Objective： To explore the morphological changes and distributing features of mesencephalic dopaminergic （ mDA） neurons in rat ventral mesencephalon （ VM ） during its development． Methods： Continuous coronal sections of rat VM were made from the embryonic period to adult． Tyrosine hydroxylase （ TH ） immunofluorescence histochemical staining technique was used to determine the mDA neurons． Results： （ 1 ） During the embryonic period，most of the TH positive neurons were round or ovoid in shape，with their processes becoming longer in length and denser in branches． By P28 ，the THpositive neurons gradually acquired all of the morphological features of their mature mDA neurons． （ 2 ） Immunofluorescence histochemical staining for Map2 / TH showed the distribution of THpositive neurons in P0 rat mesencephalon was almost coincident with mDA neurons in adult． （ 3 ） THpositive neurons reached the climax in number and density on E16． 5 in the developing VM of rat． The number and density of THpositive neurons then decreased with development． Conclusion： The development of the mDA neurons in the mesencephalon of rat proceed in the perinatal period． A big number of mDA neurons are generated at the beginning，then the number of these cells begins to decrease，while the morphological features are maturing gradually． The distribution of the mDA neurons will be completed on P0 ， the morphological development will be completed on P28． 【Key words】 tyrosine hydroxylase （ TH） ； dopaminergic neurons； immunofluorescence； mesencephalon； development； rat