酶质量浓度的测定
连续监测法测定酶活性浓度 医学课件
以色素原GCNA为底物，甘氨酰甘氨酸为受体，GGT催化γ谷氨酰基团从GCNA转移至甘氨酰甘氨酸上，并游离出2-硝基 -5-氨基苯甲酸。后者的生成量与样品中的GGT活性成正比关 系，故测定405nm处的吸光度增量可计算出GGT的活性。
GCNA 双甘氨酸 pGHG7T.72 硝基 5 氨基苯甲酸 L 谷氨酰 甘氨酰甘氨酸
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第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
（三）方法学评价
②2-硝基-5-氨基苯甲酸在410nm的摩尔消光系数为 7.96×103（pH为7.70），受pH和温度影响较大。若选择 401nm或405nm时需注意校正。
③由于产物摩尔消光系数较小，样品用量大，样品体积 分数0.0909，为了样品和反应液在37℃平衡，故需要孵育时 间180s和底物启动模式。
（一）测定方法概述
γ-L-谷氨酰对硝 基苯胺为底物
L-γ-谷氨酰-α（β） -萘胺为底物
方法灵敏度低， 底物溶解度差， 受溶血干扰较 大
可以连续监 测，有较好 的灵敏度和 准确性，但 底物溶解度 差
L-γ-谷氨酰-3-羧 基-4-硝基苯胺为
底物
IFCC推荐方 法
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第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
CNPF AFU CNP(黄色) L - 岩藻糖
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第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
（三）方法学评价
CNPF法所采用CNP的解离常数(pKa)5.5与AFU的最适pH相 近，缩短了反应时间，无需样本空白，实现了AFU的连续监测 法测定。提高pH可提高CNP的离子化率，但过高的pH会影响 酶活性；该方法操作简便，测定时间短，灵敏度及抗干扰性都 有所提高。溶血仍有干扰。
酶活性和质量测定方法及其评价
1.酶活性测定方法（1）按反应时间分类法：20世纪50年代以前大都使用固定时间法。
这种方法是以酶催化反应的平均速度来计算酶的活性，现多已不用。
50年代中期开始采用连续监测法。
这种方法用自动生化分析仪上完成，可以测酶反应的初速度，其结果远比固定时间法准确，在高浓度标本尤为明显，但本法也受到反应时间，反应温度，试剂等的影响，应加以注意。
1）定时法：通过测定酶反应开始后某一时间段内（t1到t2）产物或底物浓度的总变化量来求取酶反应初速度的方法，称为两点法，其中t1往往取反应开始的时间。
在酶反应一定时间后，往往通过加入强酸、强碱、蛋白沉淀剂等，使反应完全停止，所以也叫中止反应法。
2）连续监测法：又称为动力学法或速率法、连续反应法。
在酶反应过程中，用仪器监测某一反应产物或底物浓度随时间的变化所发生的改变，通过计算求出酶反应初速度。
3）平衡法：通过测定酶反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量来求出酶活力的方法，又叫终点法。
（2）按监测方法分类法：可分为①分光光度法；②旋光法；
③荧光法；④电化学方法；⑤化学反应法；⑥核素测定法；⑦量热法。
2.酶质量测定法随着免疫技术的发展，出现了利用酶的抗原性，通过抗原、抗体反应来直接测定酶的质量，直接用质量单位ng／ml、μg／L来表示酶含量的高低。
免疫学方法与测定活性方法相比，其优点是灵敏度和特异性高，不受体液中其他物质的影响，特别是抑制剂和激活剂的影响，当血液中有酶抑制剂存在，或因基因缺陷，合成了无活性的酶蛋白时，可以测出灭活的酶蛋白量，有利于疾病诊断和科学研究。
如肌酸激酶同酶MB（CKMB）质量测定较活性测定对疾病的诊断价值高。
生物化学检验中酶的测定综述
定时法
通常是酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、
蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时间内 底物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应 的平均速度。
定时法中酶促反应的过程
注意事项
用定时法测定酶活性浓度， 必须了解不同酶促反应速率和时间的关系， 应先做预试验找出酶促反应速率恒定的时期，
CK-MB
这些方法适用于临床自动化分析，具有测定时
间短（最快仅需7min）、灵敏性高（最低检测 限<µg/L）和准确性好的特点，明显优于其他 分析测定CK-MB的方法，1990年后逐渐被广泛 接受。 为使CK-MB质量分析标准化，AACC成立了专门 的标准化委员会，最近已研制成功采用重组基 因技术的CK-MB参考材料（Rck-2）。
由于同工酶（及其亚型同工型）一级结构的不
同，导致其在理化性质、催化性质、生物学等 方面有明显的性质差异，这些差异为同工酶的 分析和鉴定提供了理论基础。 临床同工酶的分析大致可分为两步，即首先精 确地分离出某酶的各同工酶组分，然后测定酶 的总活性和各同工酶组分的活性。
电泳法
在研究同工酶的所有方法中，电泳法的使用最
CK-MB
是诊断AMI、测定心肌梗塞面积的重要指标。 近年来，国外对AMI诊断效率评价时多采用测
定CK-MB质量，即测定CK-MB的酶蛋白质量浓度 （Mass）的方法。 CK-MB质量的测定通常是制备抗CK-M抗体和抗 CK-B抗体或采用CK-MB抗体，用CLIA、ELISA、 FEIA等方法测定。
同一种属中由不同基因或等位基因所编码的多
肽链单体、纯聚体或杂化体，具有相同的催化 作用，但其分子构成、空间构像、理化性质、 生物学性质以及器官分布或细胞内定位不同的 一组酶称为同工酶。 凡酶蛋白结构不同的同工酶称为原级同工酶， 而将经加工或修饰后的同工酶称为次级同工酶 或酶的多种形式。
酶检测方法
酶检测方法引言酶是一类生物催化剂，能够加速化学反应速率而不被消耗。
酶检测方法是通过测定酶活性或酶与底物的反应产物来评估酶的功能和浓度。
酶检测方法在生物医学研究、生物工程、食品检测等领域具有广泛的应用。
酶检测方法的分类酶检测方法可以根据测定酶活性的原理和方法进行分类，常见的分类包括：1.光度法：利用酶催化反应产生的吸光度变化来测定酶活性。
常见的方法有比色法、荧光法和发光法等。
其中，比色法是一种常用的酶检测方法，通过测定反应产物的吸光度来间接测定酶活性。
2.电化学法：利用酶催化反应产生的电流变化来测定酶活性。
常见的方法有电化学阻抗法、循环伏安法和恒电位法等。
电化学法具有高灵敏度、高选择性和实时监测等优点，广泛应用于生物传感器和生物芯片等领域。
3.质谱法：利用质谱仪测定酶催化反应产生的质荷比变化来测定酶活性。
质谱法具有高分辨率、高灵敏度和高特异性等优点，适用于复杂样品的酶活性测定。
4.核磁共振法：利用核磁共振仪测定酶催化反应产生的核磁共振信号变化来测定酶活性。
核磁共振法具有非破坏性、无辐射和无需标记等优点，适用于生物体内酶活性的测定。
5.荧光法：利用酶催化反应产生的荧光信号变化来测定酶活性。
荧光法具有高灵敏度、高选择性和实时监测等优点，广泛应用于生物分子的定量和定位分析。
酶检测方法的步骤酶检测方法的一般步骤包括：1.样品制备：将待测样品进行处理，如离心、过滤、稀释等，以获得适合测定的样品。
2.酶反应体系的建立：根据待测酶的特性和反应条件，选择适当的底物、辅酶、缓冲液和温度等，建立酶反应体系。
3.酶反应的进行：将样品与酶反应体系混合，在恒定的温度和pH条件下进行酶反应。
4.反应终止：通过改变反应条件或添加反应终止剂等方式，停止酶反应。
5.产物的测定：根据酶反应产生的产物特性，选择相应的测定方法进行测定。
常见的方法有分光光度法、荧光法、电化学法等。
6.数据分析：根据测定结果，计算酶活性或酶浓度，并进行数据分析和统计处理。
第2章 DNA的纯化、浓度的测定及质量鉴定
第二章DNA的纯化、浓度的测定及质量鉴定实验一 DNA(或RNA)的核酸酶处理纯化一、原理和用途在基因工程中，DNA与RNA的提取与纯化是最基本的实验方法。
在DNA提取时，有时会有RNA的污染，在RNA提取时，有时会有DNA的污染，为了消除它们对后续实验的影响，通常我们要对所提取的DNA或RNA用相应的核酸酶进行纯化。
核糖核酸酶A（又叫RNA酶A，RNase A）来源于牛胰脏，是一种内切核糖核酸酶，可特异性攻击RNA上嘧啶残基的3′端，切割与相邻核苷酸形成的磷酸二酯键，从而除去RNA，其反应终产物为嘧啶3′磷酸及末端带嘧啶3′磷酸的寡核苷酸。
脱氧核糖核酸酶I（又叫DNA酶I，DNase I）来源于牛胰脏，是一种内切脱氧核糖核酸酶，它能水解双链或单链DNA，产生带5′端磷酸基团的单核苷酸及寡核苷酸的混合物。
当Mg2+存在时，DNA酶I可独立地作用于每条DNA链，且切割位点随机分布。
而当Mn2+存在时，DNA酶I可在两条链大致同一位置上切割DNA链，产生平齐末端或具有1～2个核苷酸突起的DNA片段。
二、实验材料粗提的DNA（或RNA）溶液。
三、溶液与缓冲液1．核糖核酸酶A2．10×RNase A悬浮液3．DNase I4．10×DNase I液（含MgCl2）或10×DNase I缓冲液（含MnCl2）5．灭菌纯水6．无水乙醇7．70％乙醇8．TE缓冲液四、仪器设备及耗材制冰机，冰箱，冷冻低温超速离心机，干燥培养恒温器，恒温水浴箱，旋涡振荡器，真空干燥器，离心管架，吸头盒, 2 μL、10 μL、100 μL、200 μL、1000 μL移液器，10 μL、200 μL、1000 μL吸头，1.5 mL离心管等。
五、实验方法1. 有些商业用固体RNase A干粉（或DNase I）可能含有微量的DNase（或RNase）活性，故在使用前应去除其活性，去除的方法可按照商家的使用说明书进行。
医学检验主管检验师资格考试复习资料生物化学(12)血清酶催化活性浓度和代谢物浓度酶法检测技术
医学检验主管检验师资格考试复习资料生物化学（12）血清酶催化活性浓度和代谢物浓度酶法检测技术一、酶活性的定义及单位酶活性指酶催化反应的能力即酶促反应速度。
表示常用国际单位。
1min能转化1微摩尔底物（μmol）的酶量为一个国际单位（μmol／min）。
用SI制表示的酶活性单位为Katal（催量）。
每秒钟转化1个摩尔底物的酶量为1Katal（mol/sec）常用单位为μKatal或nKatal。
国际单位和Katal间关系为：1U＝1μmol／min＝16.67nmol／s＝16.67nKatal1.连续监测法中酶活性浓度的计算：连续检测法指的是在酶反应过程中，用仪器监测某一反应产物或底物浓度随时间的变化所发生的改变，通过计算求出酶反应初速度。
连续监测法优点之一是计算方便，不需作标准曲线或标准管，用分光光度计监测酶反应过程时，很容易求出反应体系中每分钟吸光度变化，根据摩尔吸光系数可求出△A。
ε为微摩尔（线性）吸光体系△A为吸光度变化ν为标本体积（ml）V为反应体系体积（ml）L为光径（cm）后面几项皆为常数，叫做酶活力浓度测定转化因子：2.常数K值设置应是测定酶的判断值或参考值上限，应保证这些值测定的可靠。
3.临床酶催化活性浓度测定的校准由于临床酶催化活性浓度测定受测定方法和条件的影响，国际医学检验量值溯源委员会推荐了常用酶测定的参考方法，采用与仪器和试剂相配套的有溯源校准的校正测定系统，是发展趋势。
二、测定酶活性浓度的两大类方法（一）固定时间法（取样法）先让酶与底物在一定温度下作用一段固定的时间，然后停止酶反应，加人试剂进入化学反应呈色测出底物和产物的变化。
用这类方法测酶活性浓度，必须保证酶和底物在所选定的温度下作用时间要很精确，否则将引起较大误差。
该法最基本的一点是停止反应后才测定底物或产物的变化。
（二）连续监测法连续监测法具有众多的优点，随着科学技术的发展，自动生化仪的使用，正在逐步取代“固定时间法”。
几种酶的测定方法
各种酶的测定方法:土壤脲酶测定方法（靛酚比色法）根据脉酶水解时生成的氨与苯酚钠及次氯酸钠反应，形成兰色靛酚这一原理。
试剂配制：1.甲苯（分析纯）2.10%尿素：尿素（分析纯）10克溶于100毫升蒸馏水中。
（当天做当天配）3.柠檬酸盐缓冲液：368克柠檬酸（分析纯）溶于600毫升蒸馏水中；295克氢氧化钾溶于水；将二种溶液合并，调pH至6.7，并用水稀释至2升。
4.苯酚钠溶液：A.62.5克苯酚溶于少量95%乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升。
B.27克氢氧化钠溶于100毫升水中。
将二溶液保存在冰箱里。
使用前，将溶液A、B各吸取20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升。
5.次氯酸钠溶液：用蒸馏水稀释试剂，至活性氯浓度为0.9%。
（次氯酸钠活性氯浓度为5.2%）。
标准溶液：称0.4717克硫酸铵（105 °C烘干）溶于水，稀释至1升（1毫升含100微克氮）即100ppm。
将100ppm的标准溶液稀释为10ppm。
分别吸取0、0.5ml、1.5ml、2.5ml、3.5ml、4.5ml、5.5ml、6.5ml、7.5ml于50毫升容量瓶或刻度试管中，加入试剂，最后定容至50 毫升使溶液浓度为：0、0.1ppm、0.3ppm、0.5ppm、0.7ppm、0.9ppm、1.1ppm、1.3ppm、1.5ppm。
分析步骤：称2~5克过20目风十土于50毫升磨口三角瓶中，加5~10滴甲苯，盖好，15分钟后加10毫升10%尿素和20毫升pH6.7柠檬酸盐缓冲液，摇匀后，在30C 恒温箱中培养24小时，过滤。
取滤液1~3毫升（视样品浓度定）于50毫升刻度试管中，加入4毫升苯酚钠溶液和3毫升次氯酸钠溶液，边加边摇匀。
20分钟后定容，在分光光度计波长578nm处比色（1cm比色杯）。
反应生成的靛酚兰能在60分钟以内稳定。
每一土样设置用水代替基质（即尿素）的对照，以除掉土壤中氨态氮引起的误差。
酶活性浓度测定的主要影响因素及控制
酶活性浓度测定的主要影响因素及控制影响酶促反应的因素主要有酶浓度、底物浓度、温度、pH及离子强度、电解质、辅酶、激活剂及抑制剂等。
（一）酶浓度在底物浓度远大于酶浓度时，酶促反应速率随酶浓度的增加而增加，即反应速率与酶的浓度成正比。
酶浓度特别高的标本，底物将过快且过多地消耗，影响酶活性测定，故需进行适当稀释，但要注意稀释产生的基质效应影响。
（二）反应系统温度的影响温度对酶促反应影响有两重性。
一方面，按照一般催化反应规律，温度升高可促进分子热运动，增加碰撞机会，提高酶促反应速率；另一方面，温度过高可因酶蛋白变性反而使酶反应速率下降。
多数酶在60℃时开始变性，80℃时已不可逆变性。
酶反应速率最大时的反应系统温度称为酶反应的最适温度（optimumtemperature）。
低于最适温度时，温度每升高10℃反应速率可增加1.7～2.5倍。
当高于最适温度时，反应速率则可能因酶变性失活反降低。
测定酶活性的温度长期未统一，学术团体推荐主要有3种：①德国临床生化学会（GSCC）推荐25℃；②国际临床化学联合会（IFCC）推荐30℃；③斯堪地那维亚临床生化学会（SSCC）推荐37℃。
我国推荐温度为37℃，现IFCC也改为推荐37℃。
测定酶活性时，温度的误差不能大于±0.1℃，以保证测定结果的准确性。
不同温度测定酶活性结果之间，不推荐使用酶的温度校正系数转换。
因此，不同反应温度测定酶活性应有相应参考区间，不能混用。
（三）底物的种类和浓度底物专一性不强的酶，可作用于多种底物，测定酶活性时，应优先考虑有较高诊断价值的底物。
底物专一性强的酶，如其所催化的为可逆反应，则需要从测定技术和实用方面考虑选择测定正向或负向反应。
在米氏方程中，当底物浓度［S］≫Km时，Km可忽略不计，则v=Vmax=K2［E］，即反应速率与底物浓度无关，仅和酶浓度［E］成正比，此为零级反应（图28-1中的c段）。
因此，临床测定酶活性时，一般均给予充分的底物浓度，最好为Km的10～20倍，保证反应速率与酶浓度［E］成正比，以准确测定酶活性。
第五章诊断酶学 - 酶活性浓度的测定技术
ALT双试剂法测定中，首先使血清与缺
此时反应的方向少由αN-酮A戊DH二转酸的变底为物N溶A液D混，合随，反37应°进C保行，A 应随之而下降，通过温检5m测，反将应样产品中物所A含在的34内0源nm性处α-酮A的酸消变化速 率，可以检测指示酶耗反完应。。然后再加入α-酮戊二酸启动ALT
即POD催化下， H2O2氧化芳香族胺色素原生成有色色 素，此类色素原供氢体包括：OT、DAB、ODA、TMB。
34
2. NAD(P)+或NAD(P)H偶联的脱氢酶及其指示反应
许多氧化还原反应，尤其是作为工具酶如LD、GLD、 G6PD等参与时，常将底物的H去除后传递给NAD (P)+形成 NAD(P)H。借助NAD(P)H340nm处特征性的光吸收，借此用 分光光度法检测。
通过测定被加速化学反
应的反应速率，来间接
反映酶的浓度
S
E
P
E+S
ES
E+P
V＝
ds dt
或
V＝
dp dt
14
3. 酶活性浓度
即酶所催化的化学反应的反应速率，用 酶促反应中单位时间内底物的减少量或产物 的生成量来计算。
注意：只有当酶所催化的反应速度仅与 [E] 成正比，而不受其它因素影响时，即在酶促 反应的零级期，才能根据酶所催化的化学反 应速率来确切表示酶活性浓度的大小。
A Ex B Ei P
始发反应
指示反应 辅助酶
A Ex B Ea C Ei P
辅助反应
被测酶 始发反应 指示反应 指示酶 辅助酶 辅助反应 酶偶联体系
测定酶活性浓度的两大类方法
理论上的 V0 在实际工作中是不存在的，必须让酶和底物作用一段时间，消耗掉一 定量的底物，才能测出反应速度，一般说，如消耗底物在 5％内所测到的反应速度都 可认为是初速度，如底物浓度很高时，底物消耗在 20％以内的反应往往还在线性反应 期。
是不是所有类型的酶偶联反应都可用来测酶活性浓度？回答是否定的。因为测酶 的活性浓度是依据测定酶反应速度——△A/△t 或△B/△t 求出。在酶偶联法，此值 无法直接求出，而是通过测定指示酶反应△C/△t 间接求出，要使酶偶联法测得的酶 活性浓度准确可靠，则 Vind＝Vx。换言之，指示酶的最大反应速度必须等于或接近测 定酶的最大反应速度。
只有当反应如曲线 A 时，用“固定时间法”才能测出真实的酶活性，实际工作中 是很少见的，图中曲线 B 代表了最常见的反应情况，在一个很短的线性反应期后在大 部分测定期间内主要为非线性反应期。曲线 C 说明在测定期间包括了延滞期，曲线 D 则不仅包括了延滞期，还包括非线性期，在这些反应中如用固定时间法来测定，结果 是不够准确的，一般是偏低的，而且酶浓度愈高，偏离程度愈大。
从理论上说，用酶偶联反应测酶活性浓度时，最好条件应是测定酶反应为限速反 应。动力学上为零级反应，而指示酶为一级反应，酶反应速度与指示酶底物浓度相关。
（二）指示酶、辅助酶的种类和浓度
指示酶、辅助酶的种类：常规化验中常用的酶偶联法中，多以脱氢酶为指示酶， 在常规化验中的自动分析仪几乎无一例外都有 340nm 波长，通过 NAD(P)H 系统可以很 方便地监测到指示酶反应。但从理论上说，往往可以有不止一种偶联方法，只要设法 使偶联反应中最后一个是指示酶反应，前面已提到测 CK 可以正向逆向二个方向建立 二种不同酶偶联的反应。又如在丙氨酸转氨基酶（ALT）测定法中，正向反应后产生 丙酮酸和谷氨酶，目前最常用的是用乳酸脱氢酶与丙酮酸偶联反应，伴有 NADH 下降。 但也可以用谷氨酸脱氢酶与谷氨酸作用，伴有 NADH 生成。
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化学法
产物反应，转化为有色化合物，再用分 光光度法检测。 部分酶类是在原来反应体系中加入一些与酶促 反应无关的试剂，这些试剂只和酶促反应的某 一反应物迅速作用，产生可被仪器检出的有特 征性物质，但同时又不和酶作用也不影响酶活 性。
酶偶联法
是目前在酶活性测定中应用最多，最为广泛的
直接法
这类方法是在不终止酶促反应条件下，通过特
殊的仪器直接测定反应体系中底物或产物的理 化特性变化量， 如吸光度、荧光、旋光性、pH、电导率、粘度 等，从而计算出酶活性浓度的方法。
基于NADH或NADPH理化特性 的测定方法
利用NAD(P)H在340nm处的吸光度值的变化，
测定各种脱氢酶的活性，该法是目前应用最广 的一类方法。
酶量[E]成正比例，
它是建立准确、可靠测定方法的基础。
酶促反应过程的分期
一个典型的酶促反应过程一般包括三个阶段。 延滞期（lag phase）、 线性期（linear phase）
非线性期（non linear phase）
酶促反应时间进程曲线
注意事项
要准确测定酶活性，必须了解不同酶反应速率
生物化学检验中酶的测定
广州医学院医学检验系 临床生化教研室
前言
酶的测定方法分为绝对定量法和相对定量法两
大类。绝对定量法是通过特异试剂与酶作用直 接测定酶蛋白量或酶分子浓度的方法。相对定 量法是根据酶的催化活性或酶促反应速度来间 接测定酶浓度的方法。目前临床上所用的方法 多属相对定量法。
本节内容
定时法
通常是酶作用一段时间后，加入强酸、强碱、
蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时间内 底物的减少量或产物的生成量，计算酶促反应 的平均速度。
定时法中酶促反应的过程
注意事项
用定时法测定酶活性浓度， 必须了解不同酶促反应速率和时间的关系， 应先做预试验找出酶促反应速率恒定的时期，
在酶活性测定时，如果底物或产物不能直接测
定或难于准确测定，可采用酶偶联法测定，即 在反应体系中加入一个或几个工具酶，将待测 酶生成的某一产物转化为新的可直接测定的产 物，当加入酶的反应速度与待测酶反应速度达 到平衡时，可以用指示酶的反应速度来代表待 测酶的活性。
酶偶联反应法的反应进程
用酶偶联法测定酶活性浓度时，酶促反应进程
和时间的关系， 找出酶促反应速率恒定的时间， 避开延滞期、非线性反应期。 传统的手工分析法无法在零级反应期测定，故 结果不够准确。
酶活性浓度的测定方法
酶活性浓度的测定方法
以反应时间为依据，酶活性浓度测定方法可分
为两大类
定时法（fixed time assay） 连续监测法（continuous monitoring assay）
确定线性时间，然后在这段时间进行测定， 避开延滞期和一级反应。
连续监测法
连续监测法是指每隔一定时间（2～60s），连
续多次测定酶反应过程中某一反应产物或底物 量随时间变化的数据，求出酶反应初速度，间 接计算酶活性浓度的方法。
连续监测法的测定时间
注意事项
自动生化分析仪能自动获取规定时间内的信号，
酶催化活性的途径
酶催化活性可通过测定酶促反应过程中单位时
间内底物的减少量或产物的生成量，即测定酶 促反应的速率来获得。 用这种方法获得的酶浓度的确切名称是“酶的 催化活性浓度”或简称为“酶活性浓度”。
酶活性与反应速率的关系
若[S]>>Km，且[S]很大，米-曼氏方程式可简
化为：
V K p[ E ] 此时，酶促反应的最大速度只与酶催化活性或
基于人工合成色素原底物理化特 性的测定方法
一些水解酶类或转移酶类可通过酶促反应将化
合物中的某一基团水解或移去，使无颜色的底 物转变为有颜色的产物。人们把这类底物称为 “色素原”底物。根据这一原理，人们设计合 成了一系列底物用来测定酶活性。
间接法
间接法是指酶促反应底物和产物之间没有特征
性的理化性质，需通过另一个化学反应或生化 反应，将底物或产物转化为有明显特征理化性 质的另一个化合物，然后进行测定的方法。
一、酶活性浓度的测定 二、酶质量浓度的测定 三、同工酶及其亚型测定
四、酶活性浓度测定的主要影响因素及控制
酶活性浓度的测定
主要内容
酶活性浓度测定的基本原理 酶活性浓度的测定方法 底物或产物浓度的检测
酶偶联反应法
工具酶与共通反应途径 酶活性浓度的单位
酶活性浓度测定的 基本原理
方法。即在原反应体系中加入另一些酶试剂， 将所进行的酶促反应和被测酶反应偶联起来。 在临床常规酶学分析中，以NAD（P）H为辅 酶或辅基的脱氢酶，以及过氧化物酶（POD） 是常用的酶偶联法的酶试剂。
酶偶联反应法
酶偶联反应式
A B C p
Ex Ea Ei
酶偶联反应法的基本原理
自动判断非线性度，所以连续监测法更适合于 自动化仪器。 目前已取代固定时间法而成为临床实验室测定 酶活性浓度最常用的方法。
底物或产物浓度的检测
底物或产物浓度的检测
在酶活性测定方法中，无论是定时法还是连续
监测法，酶促反应速度都要通过测定底物或产 物来实现。 依据酶促反应中底物或产物的理化特性质及检 测方法，酶活性浓度测定的方法可分为直接法 和间接法。
存在四个时相： ①预孵育期或预温期。 ②延滞期。 ③稳态期或恒态期。 ④非恒态期。
酶偶联法的吸光度变化示意图
注意事项
应用酶偶联法测定时，关键在于确定恒态期，
因为只有恒态期才能代表酶活性。 只有此阶段的吸光度才会有明显线性变化。
工具酶与共通反应途径
工具酶
在酶学分析中，作为试剂用于测定化合物浓度
或酶活性浓度的酶称为工具酶。 常用的工具酶有氧化还原酶类、转移酶类和水 解酶类，但以氧化还原酶类更多见，因为其产 物最易被直接监测而成为指示酶。
共通反应途径
在临床生物化学检验中，许多项目的测定往往
使用有工具酶的参与的类似的反应原理，即所 谓共通（或通用）反应途径。
两类常用的通用反应途径