酶活性浓度的测定技术一

三、连续监测法测定酶活性浓度
随着科学技术的不断进步与发展，各 种自动生物化学分析仪的广泛使用，连 续监测法已逐步取代定时法而成为临床 实验室测定酶活性浓度最常用的方法。
(一)连续监测法的种类 1．直接法 2. 间接法
1．直接法
这类方法是在不终止酶促反应条件下，直 接通过测定反应体系中底物或产物理化特性的 变化如吸光度、荧光、旋光性、pH、电导率、 粘度等，从而计算出酶活性浓度。其中以分光 光度法应用最为广泛，也是方法学上最成熟的 一种。
4．其他方法:
二、酶活性浓度的测定
测定酶的催化活性浓度是临床酶学分析最为常用的方法，具有 迅速、灵敏、成本低等特点。可根据酶促反应进程曲线，采用合理的 方法进行酶活性浓度的测定。
(一) 酶促反应进程
(二) 酶活性浓度测定方法
酶活性浓度测定就是要使酶促反应的初 速度(v) 达到最大速度Vmax，即在过量底物存在 下的零级反应期的速度，此时反应速度与酶浓度 [E]之间有线性关系。如按反应时间将酶活性浓 度测定方法进行分类，可分为定时法(fixed time assay)和连续监测法(continuous monitoring assay)两大类。
3．荧光法和放射性核素法:
对于一些酶浓度很低的标本，可考虑改用灵敏度 较高的荧光法或放射性核素法。荧光法取决于酶促反 应生成荧光物质的速率，此速率与酶浓度成正比，并 通过荧光光度计进行测定，根据荧光强弱的变化换算 出酶的活性。例如，还原型的NAD(P)H有强烈的荧光， 故所有以NAD(P)+为辅酶的氧化还原酶类均可用荧光法 进行测定。核素法因有污染且操作烦杂，目前应用较 少。
临床常规酶学分析所用的酶偶联法中， 多以脱氢酶为指示酶。通过监测其反应物 NADH或NADPH于340nm处吸光度的变化速率， 可以很容易地监测指示酶反应。
用酶偶联法测定酶活性浓度时，并不是一开始反应 就全部反映了测定酶活性。这是因为在偶联反应中存在 几个时相：一是预孵育期，反应一开始只存在底物 A， 不存在指示酶的反应，在此时相中使存在于样品中的干 扰物质充分进行反．应，将试剂中的NADH变为NAD+。二 是延滞期，加入底物启动反应，在启动后的一段短时间 内，产物 B开始出现并逐渐增加，处于较低水平，指示 酶反应速度也较低，不能代表测定酶的反应速率Vx，这 一时期称为延滞期。随着产物B增加到一定程度时，Ex和 Ei反应速率相同，达到了稳态期。此阶段 340nm波长处 吸光度才会有明显的线性变化。最后由于底物消耗，反 应速度又复减慢。
1．定时法
这是早期测定酶活性浓度的方法。
大多是使酶作用一段时间，然后加入强酸、 强碱、蛋白沉淀剂等终止酶促反应，测定这段时 间内底物的减少量或产物的生成量，计算酶促反 应平均速度。这类方法有多种命名，如“取样 法”、“终点法”或“两点法”。
用定时法测定酶活性浓度，必 须保证酶和底物在所选定的温度下 作用时间要很精确，否则会引起较 大误差。这种方法的优点是比较简 单，因测定时酶促反应已被终止， 故比色计或分光光度计无需保温设 备，显色剂的选择也可不考虑对酶 活性的影响。缺点是无法知道在整 个酶促反应进程中是否都是零级反 应。
连续监测法测定结果常较定时法高， 且因在酶促反应初始阶段底物最充裕，而 产物的抑制作用、可逆反应、酶变性等均 很小，因而测定结果也较取样法准确。
3．平衡法
通过测定酶促反应开始至反应达 到平衡时产物或底物浓度的总变化量 来求出酶活性浓度的方法，称为终点 法。与定时法不同的是，平衡法是在 酶促反应平衡期([S]或[P]不变)任何 一点进行测定，无需终止反应。目前 此法已少使用。
连续监测法
这类测定方法简单，优点是可将多点的 测定结果连接成线，很容易找到成直线的区 段，可以观察到是否偏离零级反应，因而可 选择线性反应期来计算酶活性，不需终止反 应。通常截取反应开始后较短的时间，就能 近似地建立这种反应量与反应时间的线性关 系，不过这种时间范围因酶种类和反应条件 而异，必须用实验方法进行确定。
另一类是目前应用最多，最为广泛的酶偶联法， 即在原反应体系中加入另一些酶试剂，所进行的酶 促反应和被测酶反应偶联起来。
(二)酶偶联反应
最简单的酶偶联反应(单底物反应且只 有一个工具酶)模式为：
A Ex B EiC
被测定酶(Ex)催化的反应称为始发反应； 产生被检测物质产物C(如NADH)的反应称为指 示反应，相应的偶联酶(第二个酶)酶称指示 酶(Ei)。
如果一些酶促反应找不到合适的指示 酶与其直Leabharlann Baidu偶联，此时往往还可在始发反应 和指示反应之间加入另一种酶，将二者连接 起来，此反应称为辅助反应。模式为：
A Ex B EaC Ei D
一般习惯将最后一个酶称指示酶Ei，其他外加 的酶称为辅助酶(Ea)。个别情况还可能使用两 种或以上的辅助酶。将这一连串酶促反应称为 酶偶联体系。
2. 间接法
直接法虽然简单，但只有底物与产物 之间，在理化性质等方面有显著差异时， 才能使用直接法。故至今也只有很少一部 分酶能用直接法进行测定。目前可采用两 类间接法进行酶学测定。
一类方法是在原来反应体系中加入一些试剂， 这些试剂只和酶反应物迅速作用，产生可被仪器检 出的物质变化，但同时又不和酶作用也不影响酶活 性。典型的例子是血清ChE的丁酰硫代胆碱测定法。
2．连续监测法
连续测定酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时 间变化的多点数据，求出酶反应初速度，间接计算酶活性浓度的 方法称为连续监测法。
2．连续监测法
连续测定酶反应过程中某一反应产物或 底物的浓度随时间变化的多点数据，求出酶 反应初速度，间接计算酶活性浓度的方法称 为连续监测法。与定时法不同的是，这类方 法勿需停止酶促反应，不需添加其他呈色试 剂，就可测定反应物的变化，很容易观察到 反应的整个过程。
利用NAD(P)H在340nm处的吸光度的变化测定各种 脱氢酶的方法是应用最广的一类方法。NAD(P)H在 260nm波长和340nm波长处有吸收峰，而氧化型NAD+／ NADP+只在260nm波长处有吸收峰，这是因为分子中有 腺嘌呤的缘故。340nm波长处吸光度的变化可以反映 反应体系中NAD(P)H量的增减。还可利用一类人工合 成的所谓“色素原”底物，其本身为无色或微黄色， 酶作用后生成有色化合物，如目前应用硝基苯酚和硝 基苯胺的衍生物进行水解酶和一些还原酶的测定。