(色谱分析)凝胶电泳
生物医学中的电泳技术应用
生物医学中的电泳技术应用电泳技术是生物医学领域中非常重要的分析手段之一，其应用广泛而深远。
本文将从几个方面介绍电泳技术在生物医学中的应用。
一、基础研究在生物医学研究中，电泳技术被广泛应用于基础研究中。
例如，研究生物分子之间的相互作用、研究蛋白质水平的变化和研究基因序列的变化等。
其中，凝胶电泳和毛细管电泳是最常见的电泳技术。
在凝胶电泳中，生物分子被加入到凝胶中，然后通过电场进行分离，进而研究其分子量、电荷、结构等信息。
毛细管电泳则是利用毛细管中的微小空间，通过不同的能级让生物分子逐一通过，达到分离的目的。
二、疾病诊断电泳技术在疾病诊断中也有广泛的应用。
例如，血浆蛋白电泳可以用于肿瘤、免疫缺陷和炎症等疾病的诊断。
通过对血浆中的蛋白质进行电泳分离，可以确定不同种类的蛋白质浓度和比例的变化，进而判断某一疾病的进展和治疗效果。
另外，DNA电泳也是诊断遗传性疾病的重要手段。
例如，PCR-amplified DNA可以通过凝胶电泳分离，在分离的过程中可以诊断出某些疾病所需的特定位点。
这些信息有助于医生更加准确地判断患者的疾病类型和疾病进程的状态。
三、新型药物开发电泳技术在新型药物开发中也有重要的应用。
例如，蛋白质色谱技术就是利用毛细管电泳技术对蛋白质进行分离和分析，多用于新药的筛选和鉴定。
通过蛋白质色谱技术可以快速筛选大量的药物分子，以确定最具有潜力的药物分子，进而研制出治疗某些疾病的新型药物。
四、肿瘤治疗最后，电泳技术在肿瘤治疗中也有着广泛的应用。
例如，电泳技术可以将药物直接引入肿瘤细胞，从而提高治疗效果。
另外，电泳技术也可以用于寄生虫和细菌的治疗，利用电场生物学技术破坏病原体的细胞膜或细胞壁，达到抗病的效果。
总之，电泳技术在生物医学中的应用非常广泛，包括基础研究、疾病诊断、新型药物开发和肿瘤治疗等方面。
未来，电泳技术还有广泛的发展前景，在医学研究和临床治疗中都将发挥更为重要的作用。
蛋白质分子量测定
蛋白质分子量测定方法目前，蛋白质分子量测定的常用方法主要有四种：年度法、凝胶过滤层析法、凝胶电泳法和凝胶渗透色谱(GPC)法。
一、粘度法一定温度条件下，高聚物稀溶液的粘度与其分子量之间呈正相关性，随着分子量的增大，聚合物溶液的粘度增大。
通过测定高聚物稀溶液粘度随浓度的变化，即可计算出其平均分子量(粘均分子量)。
该方法操作简单、设备价格较低，通常不需要标准样品，但无法测定聚合物的分子量分布。
粘度法所需设备：恒温槽、乌倍路德粘度计。
二、凝胶过滤层析法在凝胶色谱柱中，分子量不同的聚合物分子，由于其渗入凝胶微孔的能力不同而在柱中得以分离。
分子量较大的分子，渗入凝胶微孔较浅，随洗脱液流动速度较快，因而先流出色谱柱；相反，分子量较小的聚合物分子后流出。
通过测定从进样到聚合物分子流出色谱柱期间流过凝胶柱的洗脱液的体积，并与标准样品比较，即可计算聚合物的分子量，并估算其分子量分布。
凝胶层析技术操作方便，设备简单，样品用量少，而且有时不需要纯物质，用一粗制品即可，目前已得到相当广泛的应用。
凝胶层析法测定分子量也有一定的局限性，在pH6—8的范围内，线性关系比较好，但在极端pH时，一般蛋白质有可能因变性而偏离。
糖蛋白在含糖量超过5%时，测得分子量比真实的要大，铁蛋白则与此相反，测得的分子量比真实的要小。
凝胶过滤层析法所需设备：层析柱、紫外分光光度计。
三、SDS-凝胶电泳法SDS是十二烷基硫酸钠的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而使其电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。
SDS-凝胶电泳法是目前蛋白质分子量测定中使用最广泛的方法，实验成本较低，仪器设备也相对很简单，一套电泳装置即可。
简述各种色谱分离(吸附、电泳、离子交换、凝胶、亲和)的机理。
简述各种色谱分离(吸附、电泳、离子交换、凝胶、亲和)的机理。
以下是对各种色谱分离技术（吸附、电泳、离子交换、凝胶和亲和）的简要描述：1. 吸附色谱：- 原理：基于样品成分与固定相之间的吸附作用进行分离。
- 机制：固定相通常是多孔性材料，可以选择性地吸附目标化合物，而其他成分则通过溶剂流动被洗脱。
- 应用：常用于有机物混合物的分离，特别是在制药、环境和食品分析中。
2. 电泳色谱：- 原理：分子在电场中的迁移速率不同，根据其电荷和大小进行分离。
- 机制：样品分子在电场中迁移，根据电荷的差异，带有相同电荷的分子会以不同的速率迁移，从而实现分离。
- 应用：广泛应用于核酸、蛋白质和低分子有机物的分离与分析。
3. 离子交换色谱：- 原理：根据样品中阳离子或阴离子与固定相上的离子交换发生吸附和解吸作用进行分离。
- 机制：固定相通常是具有离子交换基团的树脂，可以选择性地吸附或释放样品中的离子。
- 应用：主要用于离子的分离，如无机离子、有机酸和氨基酸等。
4. 凝胶色谱：- 原理：根据样品成分在凝胶基质中的分配系数差异进行分离。
- 机制：样品分子在凝胶基质中扩散，较大的分子由于在凝胶中的阻塞效应而迁移速度较慢，从而实现分离。
- 应用：常用于聚合物、蛋白质和核酸的分离与精细分析。
5. 亲和色谱：- 原理：通过样品成分与固定相上特异性结合的亲和作用进行分离。
- 机制：固定相通常是含有配体的材料，可与目标分子发生特异性的结合，而其他成分则通过洗脱。
- 应用：广泛应用于蛋白质、抗体、酶和药物的纯化和分析。
这些色谱分离技术在不同的应用领域具有广泛的应用，并可以根据样品特性和目标分离要求进行选择。
(色谱分析)凝胶电泳
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二维电泳基本操作流程
① 样品准备 ② 等电聚焦（IEF, 第一维） ③ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE,第二维) ④ 染色 ⑤ 图像分析 ⑥ 质谱分析 ⑦ 数据库分析，鉴定蛋白
CH=CH2
CH CH2 ( CH CH2 )n
形
C=O
C=O
C NH2
成
NH
O
NH
O
凝 胶
CH2
催化剂
+ 2nCH2=CH C NH2
CH2
的
NH
NH
O
反
C=O
C=O
C NH2
应
CH=CH2
式
CH CH2 ( CH CH2 )n
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聚丙烯酰胺凝胶浓度与蛋白质分子量的关系
C=2.6%
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在电场中以一定的迁移率从负极移向正极
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天然琼脂（agar）:又名琼胶、菜燕、冻粉，从石 花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。
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D-半乳糖
3，6-脱水-L-半乳 糖
琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力 的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成 大网孔型凝胶。
稳定的线性pH梯度中电泳，结果导致每种 蛋白质分子迁移到等于其pI的pH处（此时蛋
白质分子的净电荷为零），最终聚集形成一 个很窄的蛋白区带
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳标准曲线_概述及解释说明
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳标准曲线概述及解释说明1. 引言1.1 概述在生物化学研究领域中，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的技术。
它被广泛应用于蛋白质分子量测定、鉴定和纯化等方面。
准确绘制和使用SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳标准曲线对于确定样品中蛋白质的相对分子量非常重要。
1.2 文章结构本文将围绕SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳标准曲线展开详细阐述与解释，主要包括以下几个部分：引言、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳标准曲线概述、SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳方法与步骤解释、建立SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳标准曲线的实验步骤和要点解说明、结论与展望。
1.3 目的本文的目的是全面介绍和解释SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳标准曲线的概念、意义和用途。
同时，还将详细阐述如何进行样品制备与处理、凝胶制备与电泳条件的解释以及凝胶图谱分析方法的说明。
此外，本文还会详细描述实验步骤和要点，帮助读者建立SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳标准曲线，并对结果进行分析和解读。
最后，结论部分将总结研究目的、讨论研究结果的启示和展望未来的研究方向。
通过本文的阐述，读者将能够全面了解SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳标准曲线并正确应用于相关实验中。
2. SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳标准曲线概述2.1 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳简介SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和分析技术。
其基本原理是根据蛋白质的分子量差异，利用SDS（十二烷基硫酸钠）和聚丙烯酰胺凝胶的作用，将蛋白质样品分离成不同迁移距离的条带。
2.2 标准曲线意义与用途标准曲线是根据已知浓度的标准样品制备的一系列溶液，通过测定这些溶液在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移距离和色谱峰面积得到。
标准曲线可以在定量分析时用于确定未知蛋白质样品的浓度。
2.3 研究背景与重要性在生物学、医学和生化等领域中，了解蛋白质样品的浓度是很重要的。
使用SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳标准曲线可以帮助我们准确计算样品中的蛋白质浓度。
这对于研究蛋白质功能、进行药物研发以及诊断和治疗疾病等具有重要意义。
毛细管凝胶电泳
毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳（Capillary gel electrophoresis）是一项色谱分析技术，通常用于精确、快速分析DNA、蛋白质和其他大分子的结构和功能。
它的基本原理是利用电流将大分子物质移动到凝胶中，从而分割生物颗粒。
该技术可以显着提高分析结果的灵敏度，准确性和动态范围。
此外，毛细管凝胶电泳技术与当今大多数分析技术相比具有成本效益，可以使用较少的药物，物质，时间和空间来完成完整的分析。
毛细管凝胶电泳是一种常见的电泳技术，可用于分析碱基对，DNA片段，核酸，蛋白质等大分子。
它可以用于对同一样本中不同分子组分的定性分析和定量分析。
此外，该技术还可用于产品质量控制，同位素校准，质谱分析，基因组学和动力学分析等。
与其他电泳技术相比，毛细管凝胶电泳具有许多优势，例如分辨率高，耗时短，分析时间快，可以使用较少的试剂量，可容纳大量样品，耗能低等。
此外，毛细管和微孔板可以提供更多的应用，比如更大的离子溶解度，更高的拓扑结构和更高的浓度分辨率。
毛细管凝胶电泳技术的基本设备包括：毛细管，泵，助焊剂，控制单元，电极，凝胶，加热器和检测仪。
毛细管凝胶电泳的检测器一般采用可视化检测仪，通过看到DNA片段在凝胶中移动的位置来决定碱基序列。
毛细管凝胶电泳技术在许多生物学和医学领域都具有广泛的应用。
例如，它可以用于鉴定和分离DNA序列，检查DNA和蛋白质的独特结构，确定基因的存在，表达和调节，检测疾病携带者和外源分子，研究药物-大分子物质相互作用，发现并鉴定突变样本，诊断遗传性疾病，检测药物和药物库存等。
总而言之，毛细管凝胶电泳是一种提供准确，快速，成本效益分析结果的电泳技术，它可以对特定生物大分子进行定性和定量分析，广泛应用于研究，诊断疾病，质量控制，药物研究，基因组学和动力学分析的领域。
凝胶电泳法(SDS-PAGE)测定乳与乳制品中 β-乳球蛋白的含量
染色液的器皿中，染色 12 h。染色后的凝胶用脱 色也浸泡脱色，至凝胶背景无色为止。用光密度 仪对凝胶进行测定分析，根据光密度值计算 β-乳 球蛋白的含量。
受到较大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过 程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。因 此，采用不连续系统，对相同样品，相同电流下， 在 5%、12%、15%以及 20%的分离胶上进行电泳， 对分离效果进行了比较，见图 1-图 4。
2.5 确定检出限 根据限量要求，对 0.2376 mg/mL 的标准样品
（较接近于空白样品）20 个平行样进行电泳，得到 标准偏差，由 LOD=3×SD 得到检出限。液态奶中 为 24 mg/100mL，奶粉、奶酪中为 240 mg/100g。 2.6 实际样品的测定
用 SDS -PAGE 测 定 β - 乳 球 蛋 白 的 标 准 溶
述，改良的考马斯亮蓝染色与传统考马斯亮染色 液，其测定结果表明 β-乳球蛋白的标准溶液与
相比，不仅使用低毒的有机试剂，缩短了脱色时 光密度值之间存在着较好的线性关系，相关系数
间，并且能达到与传统考马斯亮蓝染色的定量效 r 为 0.99，回归方程分别为 Y＝1.5452X-0.7139，
目前 β-乳球蛋白常用的检测方法有高效液 相色谱法[2-3]和电泳法[4-8]，与液相方法相比，电泳 法具有成本低、操作简单，耗时短，重复性高等特 点。
收稿日期：2008-10-22
1 材料与方法
1.1 材料与仪器 30%丙烯酰胺单体贮备液、1 mol/L Tris-HCl
缓 冲 液 ，pH 6.8、1.5 mol/L Tris -HCl 缓 冲 液 ，pH 8.8、10%过硫酸铵、10%SDS 溶液、N,N, N’,N’-四 甲基乙二胺（TEMED）溶液；样品缓冲液（4 mg 溴 酚蓝，1.6 mL 1 mol/L Tris-HCl 缓冲液，pH 6.8，4 mL SDS 溶液，1.2 mL β-巯基乙醇，100％甘油 2.2 mL，全部混合后用水稀释定容至 20 mL）；
(色谱分析)凝胶电泳
蛋白质分子的大小和形状 分子质量越小、形状越接近球形，在电
场中迁移速度越快
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12
SDS-PAGE
1967年由Shapiro建立。 1969年由Weber和Osborn进一步完善。
他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶 中加入离子去污剂（SDS）以后,蛋白质 亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子 量的大小,电荷因素可以忽视。
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凝胶干燥器
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凝胶成像系统
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SDS－PAGE测定蛋白质 相对分子质量
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实验过程
安样品处理与加样
剥胶与固定
染色与脱色
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30
实验过程流程图
2020/7/22
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考马斯亮蓝染色法
(色谱分析)凝胶电泳
电泳
带电粒子在电场 力作用下向着所 带电荷相反的方 向泳动的现象叫 电泳。
凝胶电泳
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电泳的用途？ 2
聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis ，PAGE）
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原理
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简
CH=CH2
CH CH2 ( CH CH2 )n
形
C=O
C=O
C NH2
成
NH
O
NH
O
凝 胶
CH2
催化剂
+ 2nCH2=CH C NH2
CH2
的
NH
NH
O
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凝胶干燥器
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凝胶成像系统
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SDS－PAGE测定蛋白质 相对分子质量
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实验过程
安装电泳槽
凝胶制备
电泳
样品处理与加样
剥胶与固定
染色与脱色
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实验过程流程图
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考马斯亮蓝染色法
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蛋白质组学和双向电泳技术
一、蛋白质组学产生背景 1. 20世纪中后期，生命科学研究进入了分子生物学时代。随 着人类基因组全序列测定，生命科学跨入了后基因组时代。 2. 因mRNA的表达情况不能直接反应蛋白质的表达水平。 3. 蛋白质有自身特有的活动规律，如动态修饰、加工、转运 定位、结构形成、代谢等，均无法从基因组水平上的研究获 知。蛋白质构象更难于只靠DNA序列来解释。 4. 蛋白质才能动态反映生物系统所处的状态。 20世纪90年代中期，国际上萌发了蛋白质组学。
稳定的线性pH梯度中电泳，结果导致每种 蛋白质分子迁移到等于其pI的pH处（此时蛋
白质分子的净电荷为零），最终聚集形成一 个很窄的蛋白区带
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+
pH 3
+
pH 3
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+
pH 3
+
pH 3
pH 7.5 pH 7.5 pH 7.5 pH 7.5
–
pH 10
–
pH 10
–
465nm
棕红色
在酸性酸条性溶件液下中，蛋白质与考 马斯亮兰R-250结合形成蓝 色复合物（595nm处最大吸 收与峰蛋）白质，疏蓝水色区结的合深浅与蛋白 质浓度成正比关系
蓝色
595nm
考马斯亮蓝G-250染料
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银染法 原理：银染时蛋白条带上的AgNO3被还原成
金属Ag，沉积在蛋白条带上而显色 显色方法分为化学显色和光显色 灵敏度达2 ng/条带
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电泳过程中分子迁移的规律，小分子在前，大分子滞 后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。
混合样品
大分子
电泳方向
电泳 带孔胶
小分子
按分子
不2021/1同/13 分子量的蛋白质在凝胶中运动示意图
大小分19离
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SDS-PAGE分类
SDS-PAGE按照缓冲液pH值和凝胶孔径差异分为连 续
相对迁移率
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6种蛋白质混合物的电泳结果图
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琼脂糖凝胶电泳
➢ 带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链，依
靠无反应活性的稳定的介质—琼脂糖凝胶 和缓冲液，根据核酸分子大小不同、构型 或形状的差异，以及所带电荷的不同，可 以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此 分开。
成复合物，大约每两个氨基酸残基结合一个 SDS分子。
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当蛋白质的分子量在15000～200000之间时 ，蛋白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分 子量的对数呈线性关系，符合下列方程：
lgMrlgKbmK1bm
常数 斜率
迁移率
通过已知分子量的蛋白与未知蛋白的比较， 就可以得出未知蛋白的分子量。
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- - --- - -
------
-
--
---
- -- -- - - --
-
--
-
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基本原理
SDS是变性剂，它能破裂蛋白质分子中的
氢键和疏水作用，去多肽折叠。
巯基乙醇或DTT是还原剂，能打开二硫
键，因此使蛋白质分子处于伸展状态。 此时SDS以其烃链与蛋白质分子的侧链结合
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在电场中以一定的迁移率从负极移向正极
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天然琼脂（agar）:又名琼胶、菜燕、冻粉，从石 花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线状高聚物。
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没通电时的变化
所有的载体两性电解质分子都荷电，只是溶 液中荷正电和荷负电的基团数目相等，净电荷 为零。
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引入电场时的变化
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电泳结束后的变化
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等点聚焦电泳的应用
1.分析分离制备蛋白质、多肽 ①区分人血清蛋白 ②测出异常免疫球蛋白 ③基因分型 ④csf中寡克隆区带的检测 2.测定pI可鉴定蛋白质、多肽
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结果分析
相对迁移率的计算
相对迁移率mR =蛋白质样品距加样端迁移距离(cm) 溴酚蓝区带中心距加样端距离(cm)
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标准蛋白在SDS-凝胶上的示意图
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标准曲线的绘制
以每条Marker带的相对迁移率为横坐标， 相应分
子量的对数值为纵坐标，绘制标准曲线。
分 子 量
持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳
( polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。
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丙烯酰胺
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N,N’-甲叉双丙烯酰胺
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凝胶的化学结构
由丙烯酰胺单体聚合成长链，长链之间用N,N-甲叉双丙 烯酰胺交联成多孔状结构。
孔的大小可以用双丙烯酰胺的浓度来调节。 浓度增大，网状结构的空隙（孔径）减小。
不同的蛋白质分子，由于其侧链可解离 基团的种类和数量、分子质量、空间三 维结构都有所不同，所以：
• 等电点（pI）不同，同一pH条件，所带 电荷种类、数量不同
• 大小、形状不同
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迁移率
蛋白质分子在电场中的泳动速度常常用迁移 率来表示
定义：蛋白质分子在单位电场强度下的泳动
速度
m=
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蛋白质分子在不同pH下的解离状态
NH3+ P
COOH
NH3+ P
COO-
NH2 P
COO-
pH＜pI
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pH＝pI
pH＞ pI
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等电聚焦电泳（IEF）
原理
利用不同蛋白质的等电点的不同而使其在 pH梯度中相互分离的一种电泳技术
等电聚焦过程中，蛋白质分子在一个连续而
称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N,N-
methylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，
N，N—四甲基乙二胺(N，N，N，N-tetramethyl
ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵
(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，简称AP)或核 黄素(ribofavin即vita min B2，C17H20O6N4)的作用 下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支
度越快
蛋白质分子的大小和形状 分子质量越小、形状越接近球形，在电
场中迁移速度越快
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SDS-PAGE
1967年由Shapiro建立。 1969年由Weber和Osborn进一步完善。
他们发现样品介质和丙烯酰胺凝胶 中加入离子去污剂（SDS）以后,蛋白质 亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子 量的大小,电荷因素可以忽视。
凝胶浓度 /T%
分子量范围 /kDa
5
30~200
10
15~100
15
10~50
20
2~15
C=5%
凝胶浓度 /T%
分子量范围 /kDa
5
60~700
10
22~280
15
10~200
20
5~150
C：Bis占两者的百分含量（交联度） T：Acr和Bis在凝胶中的总浓度
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PAGE分离蛋白质的依据
2-DE使得分离分辨率大大提高，获得的信息也明 显增多，是目前电泳技术中分辨率最高、信息获得 最多的技术，常用于分析复杂样品及绘制蛋白质组 图谱，是蛋白质组学研究的核心技术
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二维电泳基本操作流程
① 样品准备 ② 等电聚焦（IEF, 第一维） ③ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE,第二维) ④ 染色 ⑤ 图像分析 ⑥ 质谱分析 ⑦ 数据库分析，鉴定蛋白
—VE =
__Q___ 6πrη
V=迁移速度； E=电场强度； η=介质粘度
➢ 在同一介质中电泳，m只与蛋白分子自身大 小和形状（r）、所带电荷数量（Q）相关
➢ 利用蛋白质混合物中各蛋白的迁移率不同
（蛋白性质差异造成），而达到分离的效果
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6种蛋白质混合物的电泳结果图
切取蛋白条带或蛋白点 蛋白混合物
酶解
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多肽混合物 MS/MS 数据库比对
质谱鉴定
蛋白质1 蛋白质2 蛋白质3 。。。
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蛋白质分离首选技术：
双向凝胶电泳技术
目前唯一能分离上千种蛋白的技术
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人肾脏细胞
细胞系K562
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小鼠肝细胞
双向电泳（2-dimension Electrophoresis，2-DE） 是样品经第一向电泳后，再在垂直方向上进行第二 向其他类型电泳的电泳方式。目前的双向电泳一般 是 ： 第 一 向 为 等 电 聚 焦 （ IEF ） ， 第 二 向 为 SDSPAGE