琼脂糖凝胶电泳常见问题分析
琼脂糖凝胶电泳常见问题解答
琼脂糖凝胶电泳常见问题解答核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液中，其碱基不解离，而磷酸基团全部解离，核酸分子因而带负电荷，电泳时向正极迁移。
琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取而来并经糖基化修饰，为一种聚合链线性分子，使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，发挥分子筛功能，使得大小和构象不同的核酸分子的迁移率出现较大差异，从而达到分离的目的。
琼脂糖凝胶电泳操作简单、快速，通过调整其使用浓度，使得分辨率达到大多数实验的要求，因此成为分离、鉴定、纯化核酸分子的常用方法。
但操作过程中仍有不少要注意的问题。
1 凝胶制作1．1 凝胶浓度配制凝胶的浓度据实验需要而变，一般在0．8％～2．0％之间，如果一次配制凝胶100 ml，没用完的凝胶可以再次融化，但随着融化次数的增加，水分丢失也越多，凝胶浓度则会越来越高，导致实验结果不稳定，补水办法：一是在容器上标记煮胶前的刻度，煮胶后补充相应的水分至原刻度；二是在煮胶前称重，煮胶后补充水至原重量。
粗略一点的方法是通过多次较恒定的煮胶条件得出一个经验补水值。
以保证凝胶浓度基本维持在原浓度。
核酸染色剂溴化乙锭(ethidium bromide)可加在融化的琼脂糖中，终浓度为0．5 t*g ／ml；也可在电泳结束后染色。
1、2 梳板的选用一般每个制胶模具均配有多个齿型不同的梳板，梳齿宽厚，形成的点样孑L容积较大，用于DNA 片段回收实验等；相反，梳齿窄而薄，形成的点样孑L容积就较小，用于PCR产物、酶切产物鉴定等。
梳板的选择主要是看上样量的多少而定，一般来说，上样量小时尽量选择薄的梳板制胶，此时电泳条带致密清晰，便于结果分析。
另外，每次制胶时都要注意梳齿与底板的距离至少要1 mm，否则，拔梳板时易损坏凝胶孑L底层，导致点样后样品渗漏。
当然，点样孑L的破坏还与拔梳板的时间和方法有关，一般凝胶需冷却30 min以上方可拔梳板，应急的情况下可以将成型的凝胶块放4℃冰箱中冷却15 min 左右，拔梳板的方法是将制胶槽放置在电泳槽中的电泳缓冲液中，然后垂直向上慢慢用力，因为有液体的润滑作用，梳板易拔出且不易损坏点样孑L。
琼脂糖凝胶电泳条带不清晰的原因
琼脂糖凝胶电泳条带不清晰的原因
琼脂糖凝胶电泳是一种常用的分离和检测DNA分子的方法，但有时候会出现电泳条带不清晰的情况。
这种情况可能由以下几个原因引起。
琼脂糖凝胶的制备和使用过程中可能存在问题。
如果琼脂糖凝胶的浓度不够或者制备过程中出现了气泡，就会导致电泳条带不清晰。
此外，如果琼脂糖凝胶的pH值不正确，也会影响电泳结果。
DNA样品的质量可能不够好。
如果DNA样品的浓度过低或者存在杂质，就会导致电泳条带不清晰。
此外，如果DNA样品没有经过充分的纯化和处理，也会影响电泳结果。
第三，电泳条件可能不够合适。
如果电泳时间过短或者电压过高，就会导致电泳条带不清晰。
此外，如果电泳缓冲液的浓度或pH值不正确，也会影响电泳结果。
操作者的技术水平也会影响电泳结果。
如果操作者没有经过充分的培训和实践，就可能出现操作不当的情况，比如样品加载不均匀、电泳仪设置不正确等，都会导致电泳条带不清晰。
为了避免电泳条带不清晰的情况，我们可以采取以下措施。
首先，制备琼脂糖凝胶时要注意浓度、pH值和气泡等问题。
其次，对DNA样品进行充分的纯化和处理，确保样品质量。
第三，调整电泳条件，包括时间、电压和缓冲液浓度和pH值等。
最后，操作者要
经过充分的培训和实践，确保操作技术水平。
电泳条带不清晰可能由多种原因引起，我们需要仔细分析和排除这些原因，才能得到准确的电泳结果。
琼脂糖凝胶电泳注意事项
琼脂糖凝胶电泳常见错误及注意事项琼脂糖凝胶电泳是一种常用的分子生物学实验技术。
在实验过程中，为避免常见错误和提高实验效果，需要注意以下几点：1. 样品制备：在样品制备过程中，需要严格控制样品的来源、处理和质量。
避免污染和杂质的污染，以免影响实验结果。
2. 凝胶制备：在凝胶制备过程中，需要严格按照实验方案的要求制备凝胶。
应避免在制备过程中产生气泡和缺陷，保证凝胶质量的均一性和完整性。
3. 负载样品：样品的负载量也是影响实验结果的一个重要因素。
负载量过多或者过少，都会影响实验结果的准确性。
因此，需要根据实验要求和样品特点调整合适的负载量。
4. 配置电解液：电解液是凝胶电泳实验中的重要组成部分。
配置电解液应按照实验方案的要求进行，不能进行随意变更。
5. 进行电泳实验：在进行电泳实验时需要注意以下几点：（1）电泳时间：电泳时间应根据实验要求和实验人员的经验来调整，以保证样品可以在凝胶中分离出来。
（2）使用电源：电源是电泳实验中的重要设备，需要使用与实验要求相符的电源，避免因电源不适应或使用不当引起实验故障。
（3）电极夹：电极夹应牢固可靠，避免在实验过程中出现松动或断电等情况。
6. 结果解读：琼脂糖凝胶电泳实验结果的解读需要根据实验要求和实验人员的经验进行。
在进行实验结果的解读时需要注意以下几点：（1）确定分离带：分离带越清晰越好，可以通过显微镜来观察分离带是否正常。
（2）确定目标DNA：确定目标DNA时需要考虑实验目的和分离带的特点来确定是否符合要求。
（3）保留样品：需要在实验结果出来后保留样品，以备后续实验需要。
总之，在进行琼脂糖凝胶电泳实验时需要注意以上几点，以达到实验目的并减少实验错误的发生。
琼脂糖凝胶电泳常见问题
不规则DNA带迁移
电泳条件不合适
电泳时电压不应超过20V/CM，温度＜30℃，巨大DNA链电泳，温度应＜15℃，核查所用电泳缓冲液的缓冲能力，注意经常更换
DNA变性
电泳前勿加热，用20mM Nacl缓冲液稀释DNA
DNA上样量过多
减少凝胶中DNA上样量
DNA含盐过高
电泳前通过乙醇沉淀去除多余盐分
有蛋白污染
电泳前酚抽提去除蛋白
DNA变性
电泳前勿加热，用20mM Nacl缓冲液稀释DNA
出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。
分子大小相近的DNA带不易分辨
增加电泳时间，核准正确凝胶浓度
DNA变性
电泳前勿加热，用20mM Nacl缓冲液稀释DNA
DNA链巨大，常规凝胶电泳不合适
在脉冲凝胶电泳上分析
电泳时Ladder扭曲
配胶的缓冲液和电泳缓冲液不是同时配置
同时配置，电泳缓冲液高出液面1-2mm即可
电泳ห้องสมุดไป่ตู้电压过高
电泳时电压不应超过20V/CM
带弱或无DNA带
DNA上样量不够
增加DNA上样量，聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度高，上样量可适当降低
DNA降解
实验过程避免核酸酶污染
DNA跑出凝胶
缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度
EB染色的DNA，所用光源不合适
应用短波长（254nm）的紫外光源
DNA带缺失
电泳常见问题
Marker参考见解：marker有时会出现这样的问题,应该是时间久了。
新买时跑胶在点样孔没有,过一段时间就会在点样孔出现亮点。
也可能是蛋白，有时DNA提的不纯含有蛋白时就会出现上样孔有条带的现象琼脂糖凝胶电泳检测DNA时,跑出的带后面出现拖尾现象,什么原因造成的?参考见解：DNA带模糊??：1、DNA降解??避免核酸酶污染。
2、DNA上样量过多??减少凝胶中DNA上样量。
3、所用电泳条件不合适??电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃,巨大DNA链，温度应＜15℃，核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。
4、DNA样含盐过高??电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。
5、有蛋白污染??电泳前酚抽提去除蛋白。
6、DNA变性，?电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。
将从组织提取的DNA进琼行脂糖凝胶电泳，用的1.5%的胶加了EB，80V跑1小时，溴酚蓝已经跑到头了，在紫外灯观察什么带也没有，只见孔里面有橘红色的亮光。
好象没跑出来，是怎么回事？参考见解：1、根据目的条带长度来调整凝胶浓度，一般1.5％左右，也不一定。
2、紫外灯下没见带，不一定没有出孔，而是量少看不到，可以测一下浓度看一下，或直接试跑一下PCR。
3、最好加一个marker孔，尤其你第一次跑胶时。
4、电泳时间可能过长，一般75v×30min左右，但是具体看溴酚蓝的离孔距离和目的条带离孔距离。
怎样根据目测条带亮度来判断DNA浓度？参考见解：1、跑胶时候marker 可以加成定量marker，如1kb、100bp等marker，按说明书的量上样电泳，如加500ng量的DNA marker，电泳完毕后，就可将目的DNA条带和MARKER 条带的亮度做个大致的比较，找出两者最接近亮度的条带。
因为marker的各条带都已知所含的DNA浓度（说明书中详细注明），因此根据条带的亮度、大小大致就可推测目的DNA的浓度。
2、在通过目测DNA浓度的时候，最好要把加样量设一个梯度，比如从0。
琼脂糖凝胶电泳条带不清晰的原因
琼脂糖凝胶电泳条带不清晰的原因琼脂糖凝胶电泳是一种常用的分析和分离生物大分子的方法。
然而，有时候在进行琼脂糖凝胶电泳实验时，我们可能会遇到条带不清晰的问题，这给结果的解读和分析带来了困扰。
下面我将介绍一些可能导致琼脂糖凝胶电泳条带不清晰的原因。
1. DNA样品质量不佳琼脂糖凝胶电泳的前提是获得高质量的DNA样品。
如果DNA样品质量不佳，比如存在脏带、降解或者污染，都会导致条带不清晰。
因此，在进行实验之前，我们需要对DNA样品进行质控，确保其质量符合要求。
2. 样品预处理不当在进行琼脂糖凝胶电泳之前，我们通常需要对DNA样品进行一些预处理，比如酶切、PCR扩增或者纯化等。
如果预处理过程中存在问题，比如酶切反应时间过长、PCR扩增过程中出现非特异性扩增等，都会导致条带不清晰。
3. 聚丙烯酰胺凝胶浓度选择不当琼脂糖凝胶电泳中，聚丙烯酰胺凝胶的浓度是影响条带清晰度的重要因素之一。
一般来说，较低浓度的凝胶适用于较大的DNA片段分离，而较高浓度的凝胶适用于较小的DNA片段分离。
如果选择的凝胶浓度不合适，就会导致条带模糊不清。
4. 电泳条件设置不当电泳条件的设置也是影响琼脂糖凝胶电泳结果的重要因素。
比如，电泳电压、电泳时间和电泳缓冲液的配制等都会影响条带的清晰度。
如果电压过高或者电泳时间过长，都会导致条带模糊不清。
此外，如果电泳缓冲液的配制不正确，比如pH值不稳定或者离子浓度不合适，也会影响条带的清晰度。
5. 负载样品量过多或过少在进行琼脂糖凝胶电泳时，负载样品量的选择也是非常关键的。
如果负载样品量过多，会导致条带扩散，模糊不清；如果负载样品量过少，条带可能会变得非常弱或者根本看不到。
因此，在进行负载样品时，需要根据实验的需要选择适当的样品量。
琼脂糖凝胶电泳条带不清晰的原因可能是多方面的，包括DNA样品质量不佳、样品预处理不当、聚丙烯酰胺凝胶浓度选择不当、电泳条件设置不当以及负载样品量过多或过少等。
在进行琼脂糖凝胶电泳实验时，我们需要仔细检查每一个步骤，确保实验条件的准确性和合理性，从而获得清晰可靠的结果。
琼脂糖凝胶电泳实验报告思考题
琼脂糖凝胶电泳实验报告思考题
当涉及琼脂糖凝胶电泳实验时，有许多思考题可以涉及。
以下是一些可能的思考题：
1. 实验目的是什么？为什么要使用琼脂糖凝胶电泳？
2. 实验中使用的琼脂糖凝胶是什么成分？它是如何制备的？
3. 实验中使用的样品是什么？为什么选择这些样品进行电泳分析？
4. 实验中使用的电泳条件是什么？包括电场强度、电泳时间等参数。
5. 在实验中观察到的电泳结果是什么？是否有预期的结果？有无异常结果？
6. 实验中的控制组是什么？它们的作用是什么？
7. 实验中可能存在的误差来源是什么？如何减少这些误差？
8. 实验结果与预期结果是否一致？如果不一致，可能的原因是什么？
9. 实验结果对理论或实际应用有何意义？是否可以推广到其他领域？
10. 未来实验中可以改进的地方是什么？有无可能的进一步研究方向？
以上思考题可以帮助读者更深入地理解琼脂糖凝胶电泳实验，并引发更多的讨论和思考。
琼脂糖凝胶电泳
DNA琼脂糖凝胶电泳跑胶即走电泳，是DNA 和protein 最基本的定性定量方法。
一般是琼脂糖胶或page 胶，琼脂糖胶一般是检测DNA的，可以检验一下你到底提到dna没过确定你提dna分子量的大小：page胶一般是检测蛋白特性的，通过page胶里marker的分子量大小来确定你需要的目的蛋白分子量大小，如果有杂带那就可以判断那条带是你需要的目的条带，如果想知道蛋白浓度，还可以在page胶里带上一条定量marker，通过条带粗细，来判断你需要蛋白的浓度。
二者原理一致，小分子量用大浓度的胶，大分子量用小浓度的胶，特别小的DNA 用丙烯酰胺凝胶。
一、基本原理当把一个带净电荷(q)的颗粒放入电场，便有一个电场力(F)作用于其上。
F的大小取决于颗粒静电荷量及其所处的电场强度(E)，它们之间的关系可以表示成：F=E×q。
由于F的作用，使带电颗粒在电场中向一定方向泳动。
此颗粒在泳动的过程中还受到一个相反方向的摩擦力(f*v)阻挡。
当这两种力相等时，颗粒则以速度(v)向前泳动：v=F/f,其中f为摩擦系数。
根据Stoke公式，阻力大小取决于带电颗粒的大小、形状以及所处介质的粘度，即f=6πγη, γ为颗粒半径，η为介质粘度。
该公式指球形颗粒所受的阻力。
代入F＝E×q得到: v=E×q/6πγη.从这个公式可以看出，带电颗粒在电场中泳动的速度与电场强度和带电颗粒的净电荷量成正比，与颗粒半径和介质粘度成反比。
带电颗粒在电场中泳动的速度常用泳动度(m)或者迁移率以下列公式表示：m＝μ/E=d*l/V*td为带电颗粒泳动的距离(cm)，l为支持物的有效长度(cm)，t为通电时间(s)，V为加在支持物两端的电压。
在一定条件下，任何带电颗粒都具有自己特定的泳动度。
它是胶体颗粒的一个物理常数，可用其鉴定蛋白质、核酸等物质的纯度，还可以用其来研究蛋白质、核酸等物质的一些理化性质。
影响泳动度的因子有颗粒的性质、电场强度、溶液的性质等。
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琼脂糖凝胶电泳常见问题分析
DNA 凝胶电泳简介
一、实验原理
DNA电泳是基因工程中最基本的技术，DNA制备及浓度测定、目的DNA片段的分离，重组子的酶切鉴定等均需要电泳完成。
根据分离的DNA大小及类型的不同，DNA电泳主要分两类：
1 、聚丙烯酰胺凝胶电泳适合分离1kb 以下的片段，最高分辨率可达1bp ，也用于分
离寡核苷酸，在引物的纯化中也常用此中凝胶进行纯化，也称PAGE纯化。
2 、琼脂糖凝胶电泳可分离的DNA片段大小因胶浓度的不同而异，胶浓度为
0.5 ～0.6%的凝胶可以分离的DNA片段范围为20bp～50kb。
电泳结果用溴化乙锭（EB）染色后可直接在紫外下观察，并且可观察的DNA条带浓度为纳克级，而且整个过程一般 1 小时
即可完成。
由于该方法操作的简便和快速，在基因工程中较常用。
二、琼脂糖凝胶
琼脂糖是从琼脂中分离得到，由1，3 连接的吡喃型b-D- 半乳糖和1，4 连接的3，6 脱水吡喃型阿a-L- 半乳糖组成，形成相对分子量为104～105 的长链。
琼脂糖加热溶解后分子呈随机线团状分布，当温度降低时链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接，形成孔径结构，而随着琼脂糖浓度不同形成不同大小的孔径。
表 1 给出了不同浓度凝胶对DNA片段的线性分离范围。
表 1 不同类型琼脂糖分离DNA片段大小的范围
由于琼脂糖凝胶是通过氢键的作用，因此过酸或过碱等破坏氢键形成的方法常用于凝胶的再溶化，象NaClO4 能用于凝胶的裂解，一般的凝胶回收试剂盒利用的也是这一原理。
随着实验技术的发展，也针对不同用途开发了各种类型的琼脂糖凝胶：（1）
低熔点琼脂糖凝胶，用于DNA片段的回收，且由于该种凝胶中无抑制酶，可在胶中进行酶切、连接等；（2）高熔点凝胶，可分离小于1kb 的DNA片段，专用于PCR产物的分析；（3）快速凝胶，电泳速度比普通凝胶中快一倍，可节省实验时间；（4）适用于DNA大片段的分
离。
（5）其它类型。
各生产商还开发很多类型的凝胶，可根据实验要求选择不同类型的，选择原则是考虑合适的机械强度和熔点。
三、DNA电泳影响因素
DNA为碱性物质，在电泳（缓冲液pH=8）时带负电荷，在一定的电场力作用下向正极
泳动。
而DNA链上的负电荷伴随着DNA分子量的增加而增加，荷质比是一常数，故电泳中DNA的分离类似分子筛效应。
电泳中影响DNA分子泳动的因素很多，主要分两方面：DNA分
子特性和电泳条件。
1 、DNA分子大小：DNA分子越大在胶中的摩擦阻力就越大，泳动也越慢，迁
移速率与线状DNA分子质量的对数值成反比。
2 、DNA分子构型：对于质粒DNA分子即使具有相同分子质量，因构型不同也
会造成电泳时受到的阻力不同，最终造成泳动速率的不同。
常规电泳中质粒DNA分子的3
种构型泳动速率：超螺旋最快、线状分子次之，开环分子最慢。
3 、不同的胶浓度：对于同种DNA分子胶浓度越高，电泳速率越慢。
不同胶浓度对于DNA片段呈线性关系有所区别，浓度较稀的胶线性范围较宽，而浓的胶对小分子DNA 片段呈现较好的线性关系。
所以常规实验中对于小片段DNA分子的分离采用高浓度的胶分
离（有时甚至用2％的凝胶），而对于分离大片段则用低浓度的凝胶。
4、电场强度：电泳时为了尽快得到实验结果，所用的电场强度约为5V/cm，这样的场
强下虽能得到结果，但分辨率不高。
在精确测定DNA分子大小时，应降低电压至1V/cm。
电
场强度偏高时电泳分离的线性范围会变窄，电压过高时也会由于电泳中产生的大量热量导致DNA片段的降解。
实验中要根据需要选择合适电压，如对于DNA大片段的分离可适当选
择较低电压进行（在Southern 杂交中的DNA电泳），避免托尾现象的产生；而对于小分子DNA，由于其在凝胶中的快速扩散会导致条带模糊，可选用相对较高的电泳以缩短电泳时间。
5 、溴化乙锭：简称EB，电泳中的染色剂，具有扁平结构，能嵌入到DNA碱基
对间，对线状分子与开环分子影响较小而对超螺旋态的分子影响较大。
当DNA分子中嵌入
的EB 分子逐渐增多时，原来为负超螺旋状态的分子开始向共价闭合环状转变，电泳迁移速度由快变慢；当嵌入的EB 分子进一步增加时，DNA分子由共价闭合环状向正超螺旋状态转变，这时电泳迁移速率又由慢变快。
这个临界点的游离EB 质量浓度为0.1g/ml~0.5g/ml ，
即电泳时所加的浓度。
因此一般电泳可以忽略此因素，而对于特殊电泳，消除此因素影响可采用电泳后染色。
6 、电泳缓冲液：目前有 3 种缓冲液适用于天然双链DNA的电泳：TAE、TBE 和TPE，其组成及特点见表2。
一般常用的DNA电泳选用TAE较多，其电泳时间较快，而且成本比较低，但是其缓冲容量较低，需经常更换电泳液。
表 2 常用DNA电泳缓冲液
四、DNA上样缓冲液
电泳中DNA点样前必须加入一定量的上样缓冲液，主要作用如下：
1、螯合Mg2+，防止电泳过程中DNA被降解，一般上样缓冲液中含10mmol/L 的EDTA。
2、增加样品密度以保证DNA沉入加样孔内，一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油或蔗糖，这样可以增加样品的比重。
而在大片段电泳中采用Ficoll （聚蔗糖），可减少DNA 条带的弯曲和托尾现象。
3 、指示剂监测电泳的行进过程，一般加入泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿，它的速率约与300bp 的线状双链DNA相同。
目前厂商提供的限制性内切酶中都有赠送的上样缓冲液，一般为10×上样缓
冲液，DNA样品中仅需加入1/10 的量即可，加入过多的上样缓冲液会造成电泳轻微的托尾现象。
五、DNA上样量的控制
在分析性电泳中，一般样品投入量达50～100ng/ 带即可观察到清晰结果，而对于珍贵
DNA样品则上样量达电泳的最低分辨率5～10ng/带也可。
而对于一定量的DNA，当电泳时采
用较薄的梳子制胶，则电泳时DNA条带相对较窄，观察较清晰；而随着电泳时间的延长，
由于DNA分子本身有一定的扩散，电泳条带也会变浅。
对于染色体DNA的酶切片段包含各种大小的条带，上样量即使超过10mg 条带也不会托尾，
而单一条带（>10 kb）当上样量超过200ng 就有可能产生托尾现象。