DNA电泳常见问题分析
DNA琼脂糖凝胶电泳(原)
凝胶制作过程
1. 根据电泳需要，配臵合适浓度的电泳及制胶缓冲液，一 般为1× TAE或0.5×TBE。
注意：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须是相同的。
2. 根据制胶量及凝胶浓度，在加有一定量的电泳缓冲液 的三角锥瓶中，加入准确称量的琼脂糖粉。
注意：总液体量不宜超过三角锥瓶的50%容量。
3. 在微波炉中加热溶解琼脂糖至清明、透亮。
琼脂糖凝胶电泳操作简单、快速，通过调整其使
用浓度，使得分辨率达到大多数实验的要求，因此成 为分离、鉴定、纯化核酸分子的常用方法。但在实际 的操作过程中经常出现一些问题，如凝胶电泳图谱的 条带模糊不清，条带弯曲变形, 凝胶图谱变形，灌制
凝胶后的点样孔撕裂不整齐等，使得电泳结果的重复
性差。
二、相关概念
上样注意事项
加样时枪头不要碰坏凝胶控壁，否则DNA带型不整齐，加 样前要用枪头吸打凝胶孔中的溶液以赶走样品空中的气泡； 每孔最大上样量取决于DNA样品片段的大小，数目及样品 孔形状与容量； 每孔最大上样容积决定于样品孔体积； DNA marker可在两侧的样品孔均加上。
电压和温度
电泳时电压应该不超过20V/cm，电泳温度应该低
4.在软件界面点击“拍摄”按钮即可。
注：1、尽量减少紫外照射时间，调焦距和位臵时可以用白光。 2、不同凝胶结果对比时，用相同焦距、曝光时间和光圈大小。
如何调节焦距、聚焦、光圈以获得 高质量的图片？
三个最重要的可调参数分别是焦距、聚焦 和光圈。其中焦距调节清晰度，聚焦调节图像 大小，光圈调节明暗。一般先调光圈至适宜的 亮度后，再调聚焦将图像放到最大，最后调节 焦距，在图像较大的情况下焦距比较容易调节 到最清晰状态，然后再把图像缩放在适宜大小 后成像即可。
DNA测序常见问题分析及解决办法总结
请提供详细资料我们会根据结果具体分析。
常见问题
具体情况
可能的原因
处理办法
备注
样品准备问题
菌培养不好或失败
抗性不对或菌已死
核对抗性，尽可能提供载体信息。
或菌培养条件特殊
重新提供菌液，或提供2ug纯化质粒。
质粒提不出
质粒拷贝数极低或
客户自己采取大量提取的方法提供2ug纯化质粒。
培养方式不当
质粒产量很低
低拷贝数质粒或
客户自己采取大量提取的方法提供2ug纯化质粒。
培养方式不当
自带质粒或已纯化PCR产物量极低
是否为电泳法定量，
质粒：电泳检测浓度大于100ng/ul，体积大于20ul。
测OD值法不可靠,电泳检测
总量是否足够
已纯化PCR产物：根据片段长度提供足够量的模板，一般要求是100ng/反应/Kb，进行多个反应的应相应增加量。
测序出现双峰或信号中断
双峰
重复序列，如polyT、polyA或几个碱基重复
质粒产量极低
客户自己提供2ug纯化好的质粒
PCR产物定量极低
重新电泳检测已纯化的PCR产物，确认有足够的量，或提供PCR原液由公司进行纯化
测序结果正常，与预期不符
找不到引物
质粒模板
检测是否为空载体，从其互补链上寻找，克隆位点离测序引物太近，长插入片段未测通。
PCR模板
不可能找到所用的测序引物，短片段可以从互补链上找到另一段的引物，长片段由于测不通，无法找到相应序列想得到全序列，短片段可以从两端进行测序，长片段需要经克隆后进行测序。
用反向引物中出现套峰
可能是样品非单克隆，挑其他克隆测序。
PCR产物测序中，某一点后序列变乱
DNA电泳常见问题分析
DNA电泳常见问题凝胶电泳操作注意事项1、琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。
2、凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶化的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。
倒入板中的凝胶应避免出现气泡，以免影响电泳结果。
3、电泳缓冲液：为保持电泳所需的离子强度和pH，应经常更新电泳缓冲液。
4、样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5μg的DNA量,加样量的多少依据加样孔的大小及DNA 中片段的数量和大小而定.当加样孔大时,样品上样量应相应加大,否则会造成条带浅甚至辨认不清;反之则应适当减少加样量，但是上样量过多会造成加样孔超载，从而导致拖尾或弥散，对于较大的DNA此现象更明显。
5、 DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。
6、 DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。
采用不同浓度的凝胶有可能分辩范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。
小片段DNA的检测应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，以提高分辨率。
7.选择的实验材料要新鲜，处理时间不易过长。
8.在加入细胞裂解缓冲液前，细胞必须均匀分散，以减少DNA团块形成。
9. 提取的DNA不易溶解：不纯，含杂质较多；加溶解液太少使浓度过大。
沉淀物太干燥，也将使溶解变得很困难。
10. 电泳检测时DNA成涂布状：操作不慎；污染核酸酶等。
11.分光光度分析DNA的A280/A260小于1.8；不纯，含有蛋白质等杂质。
在这种情况下，应加入SDS至终浓度为0.5%，并重复步骤2～8。
12.酚/氯仿/异戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸取：含高浓度的DNA，可加大抽提前缓冲液的量或减少所取组织的量DNA电泳常见问题分析之一1 请问配制聚丙烯酰胺凝胶电泳胶时，促凝的是TEMED还是过硫酸铵？胶聚时间很长如何解决？过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所需的自由基，而TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速它俩的聚合。
电泳常见问题
Marker参考见解：marker有时会出现这样的问题,应该是时间久了。
新买时跑胶在点样孔没有,过一段时间就会在点样孔出现亮点。
也可能是蛋白，有时DNA提的不纯含有蛋白时就会出现上样孔有条带的现象琼脂糖凝胶电泳检测DNA时,跑出的带后面出现拖尾现象,什么原因造成的?参考见解：DNA带模糊??：1、DNA降解??避免核酸酶污染。
2、DNA上样量过多??减少凝胶中DNA上样量。
3、所用电泳条件不合适??电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃,巨大DNA链，温度应＜15℃，核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。
4、DNA样含盐过高??电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。
5、有蛋白污染??电泳前酚抽提去除蛋白。
6、DNA变性，?电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。
将从组织提取的DNA进琼行脂糖凝胶电泳，用的1.5%的胶加了EB，80V跑1小时，溴酚蓝已经跑到头了，在紫外灯观察什么带也没有，只见孔里面有橘红色的亮光。
好象没跑出来，是怎么回事？参考见解：1、根据目的条带长度来调整凝胶浓度，一般1.5％左右，也不一定。
2、紫外灯下没见带，不一定没有出孔，而是量少看不到，可以测一下浓度看一下，或直接试跑一下PCR。
3、最好加一个marker孔，尤其你第一次跑胶时。
4、电泳时间可能过长，一般75v×30min左右，但是具体看溴酚蓝的离孔距离和目的条带离孔距离。
怎样根据目测条带亮度来判断DNA浓度？参考见解：1、跑胶时候marker 可以加成定量marker，如1kb、100bp等marker，按说明书的量上样电泳，如加500ng量的DNA marker，电泳完毕后，就可将目的DNA条带和MARKER 条带的亮度做个大致的比较，找出两者最接近亮度的条带。
因为marker的各条带都已知所含的DNA浓度（说明书中详细注明），因此根据条带的亮度、大小大致就可推测目的DNA的浓度。
2、在通过目测DNA浓度的时候，最好要把加样量设一个梯度，比如从0。
DNA电泳常见问题分析
D N A电泳常见问题分析The final revision was on November 23, 2020DNA电泳常见问题凝胶电泳操作注意事项1、琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。
2、凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶化的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。
倒入板中的凝胶应避免出现气泡，以免影响电泳结果。
3、电泳缓冲液：为保持电泳所需的离子强度和pH，应经常更新电泳缓冲液。
4、样品加入量：一般情况下，宽的梳子可加μg的DNA量,加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定.当加样孔大时,样品上样量应相应加大,否则会造成条带浅甚至辨认不清;反之则应适当减少加样量，但是上样量过多会造成加样孔超载，从而导致拖尾或弥散，对于较大的DNA此现象更明显。
5、DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。
6、DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。
采用不同浓度的凝胶有可能分辩范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。
小片段DNA的检测应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，以提高分辨率。
7.选择的实验材料要新鲜，处理时间不易过长。
8.在加入细胞裂解缓冲液前，细胞必须均匀分散，以减少DNA团块形成。
9. 提取的DNA不易溶解：不纯，含杂质较多；加溶解液太少使浓度过大。
沉淀物太干燥，也将使溶解变得很困难。
10. 电泳检测时DNA成涂布状：操作不慎；污染核酸酶等。
11.分光光度分析DNA的A280/A260小于；不纯，含有蛋白质等杂质。
在这种情况下，应加入SDS至终浓度为%，并重复步骤2～8。
12.酚/氯仿/异戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸取：含高浓度的DNA，可加大抽提前缓冲液的量或减少所取组织的量DNA电泳常见问题分析之一1 请问配制聚丙烯酰胺凝胶电泳胶时，促凝的是TEMED还是过硫酸铵胶聚时间很长如何解决过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所需的自由基，而TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速它俩的聚合。
DNA测序结果中常见的几个问题
1 、为什么开始一段序列的信号很杂乱，几乎难以辨别这主要是因为残存的染料单体造成的干扰峰所致，该干扰峰和正常序列峰重叠在一起；另外，测序电泳开始阶段电压有一个稳定期，所以经常有20-50 bp 的紧接着引物的片段读不清楚，有时甚至更长。
2 、为什么在序列的末端容易产生 N 值，峰图较杂由于测序反应的信号是逐渐减弱的，所以序列末端的信号会很弱，峰图自然就会杂乱，加上测序胶的分辨率问题，如果碱基分不开，就会产生 N 值，正常情况下ABI377测序仪能正确读出500个碱基的有效序列。
3 、测序结果怎么找不到我的引物序列如果找不到测序所用的引物序列。
这是正常的，因为引物本身是不被标记的，所以在测序报告中是找不到的；如果找不到克隆片段中的扩增引物，可能是您克隆的酶切位点距离您的测序引物太近，开始一段序列很杂，几乎难以辨别，有可能看不清或看不到扩增引物；另外插入片段的插入方向如果是反的，此时需找引物的互补序列。
4 、测序结果怎么看不到我克隆的酶切位点可能的原因同上，您克隆的酶切位点距离您的测序引物太近，开始一段序列很杂，几乎难以辨别，有可能看不清或看不到酶切位点。
通常我们会尽量选择距离酶切位点远点的引物，当然，若是样品出现意外原因，如空载、载体自连等，克隆的酶切位点也是看不到的。
5 、你测出的结果与我预想的不一致，给我的结果与我需要的序列有差距，这是怎么回事首先，我们会核实给您的测序结果是否对应您的样品编号，如果对应的是您的样品，由于不知您的实验背景，测得的序列是否与您预想的结果一致我们无法判断，我们能做到的是检查发送给您的测序结果和您提供来的样品是否一致。
6 、序列图为什么会有背景噪音(杂带)是否会影响测序结果序列图的背景杂带是由荧光染料引起，如果太强会影响测序结果，要看信噪比，我们给的结果信噪比大都在98%以上。
7 、测序结果为什么与标准序列有差别原因可能有：样品个体之间的差别、测序准确率的问题，自动测序仪分析序列的准确并非100%，建议至少测一次双向，通过双向测序可以最大限度减少测序的错误。
琼脂糖凝胶电泳条带不清晰的原因
琼脂糖凝胶电泳条带不清晰的原因琼脂糖凝胶电泳是一种常用的分析和分离生物大分子的方法。
然而，有时候在进行琼脂糖凝胶电泳实验时，我们可能会遇到条带不清晰的问题，这给结果的解读和分析带来了困扰。
下面我将介绍一些可能导致琼脂糖凝胶电泳条带不清晰的原因。
1. DNA样品质量不佳琼脂糖凝胶电泳的前提是获得高质量的DNA样品。
如果DNA样品质量不佳，比如存在脏带、降解或者污染，都会导致条带不清晰。
因此，在进行实验之前，我们需要对DNA样品进行质控，确保其质量符合要求。
2. 样品预处理不当在进行琼脂糖凝胶电泳之前，我们通常需要对DNA样品进行一些预处理，比如酶切、PCR扩增或者纯化等。
如果预处理过程中存在问题，比如酶切反应时间过长、PCR扩增过程中出现非特异性扩增等，都会导致条带不清晰。
3. 聚丙烯酰胺凝胶浓度选择不当琼脂糖凝胶电泳中，聚丙烯酰胺凝胶的浓度是影响条带清晰度的重要因素之一。
一般来说，较低浓度的凝胶适用于较大的DNA片段分离，而较高浓度的凝胶适用于较小的DNA片段分离。
如果选择的凝胶浓度不合适，就会导致条带模糊不清。
4. 电泳条件设置不当电泳条件的设置也是影响琼脂糖凝胶电泳结果的重要因素。
比如，电泳电压、电泳时间和电泳缓冲液的配制等都会影响条带的清晰度。
如果电压过高或者电泳时间过长，都会导致条带模糊不清。
此外，如果电泳缓冲液的配制不正确，比如pH值不稳定或者离子浓度不合适，也会影响条带的清晰度。
5. 负载样品量过多或过少在进行琼脂糖凝胶电泳时，负载样品量的选择也是非常关键的。
如果负载样品量过多，会导致条带扩散，模糊不清；如果负载样品量过少，条带可能会变得非常弱或者根本看不到。
因此，在进行负载样品时，需要根据实验的需要选择适当的样品量。
琼脂糖凝胶电泳条带不清晰的原因可能是多方面的，包括DNA样品质量不佳、样品预处理不当、聚丙烯酰胺凝胶浓度选择不当、电泳条件设置不当以及负载样品量过多或过少等。
在进行琼脂糖凝胶电泳实验时，我们需要仔细检查每一个步骤，确保实验条件的准确性和合理性，从而获得清晰可靠的结果。
DNA琼脂糖凝胶电泳
DNA琼脂糖凝胶电泳一,实验原理琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA 片段的常用技术.把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质(琼脂糖凝胶)的样品孔中,并置于静电场上.由于DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基,因此在电场中向正极移动.在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应.具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样,因而可依据DNA分子的大小来使其分离.凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA, 也可以分离相对分子质量相同,而构型不同的DNA分子.在电泳过程中可以通过示踪染料或相对分子质量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测.相对分子质量标准参照物相对可以提供一个用于确定DNA片段大小的标准.在凝胶中加入少量溴化乙锭(ethidium bromide, EB),其分子可插入DNA的碱基之间,形成一种络合物,在254～365nm波长紫外光照射下,呈桔红色荧光,因此也可对分离的DNA进行检测.一般琼脂糖凝胶电泳适用于大小在0.2kb～50kb范围内的DNA 片段.本实验介绍琼脂糖凝胶的制备以及琼脂糖凝胶电泳在DNA片段分离中的应用方法.琼脂糖凝胶浓度（%）线状DNA分子分离范围（kb）0.3 5--600.6 1--200.9 0.5--71.2 0.4--61.5 0.2--32.0 0.1--2琼脂糖凝胶电泳是用于分离纯化和鉴定核酸的方法，根据琼脂糖的溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖。
低熔点琼脂糖的熔点为62--65,溶解后在37下维持液体状态约数小时,主要用于DNA片断的回收、质粒与外源性DNA的快速连接等。
DNA在琼脂糖凝胶中的迁移速度与琼脂糖浓度、DNA分子量及其构象、电泳缓冲液、电场强度等因素有关，一般说来，DNA片断越大或者琼脂糖浓度越大，其迁移速率越大；而电场强度越高，其迁移速率越大。
不同浓度琼脂糖凝胶DNA分离范围见上图表。
二,仪器及试剂1.仪器及耗材:水平电泳槽,电泳仪,凝胶成像分析系统,微波炉,微量移液器,透明胶带,点样或parafilm,100 ml或250 ml锥形瓶,量筒,吸头等.2.试剂及配制:50×TAE缓冲液的配制:2 mol/L Tris-乙酸,0.05 mol/L EDTA(pH 8.0)配制1000 mlTris 242 g冰乙酸 57.1 ml0.5 mol/L EDTA 100 ml加入600 ml去离子水后搅拌溶解,将溶液定容至1 L后.高温高压灭菌,室温保存.1×TAE缓冲液的配制:称量20 ml的50×TAE缓冲液,再加入980 ml的去离子水.溴化乙啶贮存液:10 mg/ml 溴化乙啶配制:100 ml称取1 g溴化乙啶,置于100 ml烧杯中,加入80 ml去离子水后搅拌溶解.将溶液定容至100 ml后,转移到棕色瓶中.室温保存.6×上样缓冲液:0.25%溴酚蓝,0.25%二甲苯青FF,30%甘油.配制:10 ml溴酚蓝 25 mg二甲苯青FF 25 mg甘油 3 ml用6×TAE缓冲液定溶至10 ml,分装成1 ml/管.-20℃保存.其它试剂:DNA样品,DNA Ladder ,琼脂糖三,操作步骤1. 制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml):称取0.7 g(0.5g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70 ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝胶液.2. 胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止.3. 加样:在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X.用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.(注意:加样前要先记下加样的顺序).4. 电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳. (5)电泳完毕后,取出凝胶,用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1×TAE溶液染色约20 min,再用清水漂洗10 min.(6)观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带,采用凝胶成像系统拍照保存.四,常见问题及注意事项1.配琼脂糖时应使其完全熔化后方可制胶.2.琼脂糖凝胶易于破碎,操作时要轻缓.3.电泳时应注意电源线路,预防触电.4.溴化乙淀具有致癌作用,配制及使用时应带乳胶或一次性塑料手套.并在专门的实验室内使用.5.紫外线对人体有损伤作用,开灯时间不宜太长,注意防护.6.DNA带形状模糊:DNA加样过多;电压太高;凝胶中有气泡.7.质粒DNA的存在形式有3种,①共价闭环DNA(cccDNA),常以超螺旋形式存在;②开环DNA(ocDNA),此种质粒DNA的两条链中有一条发生一处或多处断裂,因此可以自由旋转从而消除张力,形成松弛的环状分子;③线状DNA,因质粒DNA的两条链在同一处断裂而造成.因此质粒DNA电泳的结果中有可能出现三条泳带,它们的泳动速度为: cccDNA > 线状DNA > ocDNA.添加来自TIANGEN的资料:1,琼脂糖:不同厂家＼不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同,影响DNA的迁移及其荧光背景的强度,应有选择的使用.2,凝胶的制备:凝胶中所加的缓冲液应该与电泳槽中的相一致,溶化的凝胶应该及时倒入板中,避免倒入之前凝固结块,倒入板中的凝胶应该避免出现气泡,以免影响电泳结果.3,电泳缓冲液:为保持电泳所需的离子强度和PH,应经常更新电泳缓冲液.4,样品加入量:一般情况下,0.5CM宽的梳子可加0.5微克的DNA量,加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片断的数量和大小而定.当加样孔大时,样品上样量应相应加大,否则会造成条带浅甚至辨认不清楚;反之,则应该适当减少加样量,但是上样量过多会造成加样孔超载,从而导致拖尾或扩散,对于较大的DNA此现象更明显.5,DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率,平行对照样品中应该使用同样的缓冲条件以消除这种影响.6,DNA迁移率取决于琼脂糖的浓度,迁移分子的形状及其大小.采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子,制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度.小片断DNA的检测应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳,以提高分辨率.。
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DNA电泳常见问题凝胶电泳操作注意事项1、琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。
2、凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶化的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。
倒入板中的凝胶应避免出现气泡，以免影响电泳结果。
3、电泳缓冲液：为保持电泳所需的离子强度和pH，应经常更新电泳缓冲液。
4、样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5μg的DNA量,加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定.当加样孔大时,样品上样量应相应加大,否则会造成条带浅甚至辨认不清;反之则应适当减少加样量，但是上样量过多会造成加样孔超载，从而导致拖尾或弥散，对于较大的DNA此现象更明显。
5、DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。
6、DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。
采用不同浓度的凝胶有可能分辩范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。
小片段DNA的检测应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，以提高分辨率。
7.选择的实验材料要新鲜，处理时间不易过长。
8.在加入细胞裂解缓冲液前，细胞必须均匀分散，以减少DNA团块形成。
9. 提取的DNA不易溶解：不纯，含杂质较多；加溶解液太少使浓度过大。
沉淀物太干燥，也将使溶解变得很困难。
10. 电泳检测时DNA成涂布状：操作不慎；污染核酸酶等。
11.分光光度分析DNA的A280/A260小于1.8；不纯，含有蛋白质等杂质。
在这种情况下，应加入SDS至终浓度为0.5%，并重复步骤2～8。
12.酚/氯仿/异戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸取：含高浓度的DNA，可加大抽提前缓冲液的量或减少所取组织的量DNA电泳常见问题分析之一1 请问配制聚丙烯酰胺凝胶电泳胶时，促凝的是TEMED还是过硫酸铵？胶聚时间很长如何解决？过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所需的自由基，而TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速它俩的聚合。
胶聚合时间长可能是TEMED失效了，过硫酸铵固体时间过久也会失效的。
一个让PAGE胶很快聚合的方法：不要先配AP（过硫酸铵）溶液，因为AP很容易变质。
在保证TEMED和AP质量的情况下，每次配胶时，直接称一定量的AP粉剂溶入液体状态的PAGE中，这样可以保证AP的催化能力，而且可以多加一点。
配25ml的PAGE胶，加0.03克AP粉剂，最后加入25ulTEMED，20分钟左右就可以凝固（当然这个时候拔梳子，会有少量未凝固的PAGE在孔里形成丝状干扰，使加的样品看起来不太漂亮，但一般不影响跑胶效果和条带的形状和位置）。
2 DNA电泳的MARKER怎么是扭曲的？1、配制胶时的缓冲液需要和电泳缓冲液不是同时配制的.最好是同时配制.电泳时缓冲液高过液面1－2mm即可。
2、电泳时电压过高,可以在电泳前15分钟用较低电压(3V/cm),等条带出孔后比较漂亮了.然后再调电压。
3、上样时尽量慢慢加样,等样品自然沉降后再加电压。
3 跑出的DNA带模糊？1、DNA降解：避免核酸酶污染。
2、电泳缓冲液陈旧:电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。
建议经常更换电泳缓冲液。
3、所用电泳条件不合适:电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃；巨大DNA链电泳，温度应＜15℃；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。
4、DNA上样量过多：减少凝胶中DNA上样量。
5、DNA样含盐过高：电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。
6、有蛋白污染：电泳前酚抽提去除蛋白。
7、DNA变性：电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。
4 有不规则DNA带迁移?1、对于λ/Hind III片段cos位点复性：电泳前于65℃加热DNA 5分钟，然后在冰上冷却5分钟。
2、电泳条件不合适：电泳电压不超过20V/cm；温度＜30℃；经常更换电泳缓冲液。
3、DNA变性：以20mM NaCl Buffer稀释DNA，电泳前勿加热。
5 跑出的DNA条带带弱或无DNA带？1、DNA的上样量不够：增加DNA的上样量；聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高，上样量可适当降低。
2、DNA降解：避免DNA的核酸酶污染。
3、DNA走出凝胶：缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度。
4、对于EB染色的DNA，所用光源不合适??应用短波长（254nm）的紫外光源。
6 跑出的DNA带缺失不完整是怎么回事?1、如果是小DNA带走出凝胶，可以缩短电泳时间或降低电压或增强凝胶浓度。
2、分子大小相近的DNA带不易分辨??增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度。
3、DNA 变性：电泳前请勿高温加热DNA链，以20mM NaCl Buffer稀释DNA。
DNA链巨大，常规凝胶电泳不合适??在脉冲凝胶电泳上分析。
7 做PCR电泳后跑电泳，目的基因是489BP的，结果每次切胶回收后再跑电泳就变成500多了，快到600了？为什么？有时只靠电泳结果判断是不准确的，同样的片段每次跑的远近会有不同。
有经验显示目的片段是1300多，结果就跑到1000的marker下面去了，后来证实片段没有问题。
也有做的一个片段也是这样，是490BP.理论上两个条带一样，可是PCR结果显示就是大小不一致。
然后回收以后的检测结果又全部都一样了，后来又拿去做了下一个测序，才知道根本没有问题。
8：为什么marker条带非常模糊，无法辨别具体条带？A：出现上述情况，可能有以下几个原因：1. marker条带出现了降解。
请确保在使用过程中避免核酸酶污染；2. 电泳缓冲液陈旧。
电泳缓冲液多次使用后，离子浓度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果，建议经常更换电泳缓冲液；3. 电泳条件不合适。
电泳时电压应不超过20V/cm，温度应低于30℃；4. marker上样量过多。
请根据说明书选用合适上样量；5. 凝胶质量不好。
建议使用质量较好的琼脂糖；此外，凝胶凝固不均匀也会导致条带模糊。
9：为什么marker条带出现不规则的条带（如哑铃状等）？A：出现上述情况，多与以下几个原因有关：1. 电泳缓冲液陈旧。
老化的电泳缓冲液离子浓度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果，建议经常更换电泳缓冲液；2. 电泳条件不合适。
电泳时电压应不超过20V/cm，电压太高可能也会导致marker条带出现不规则现象。
此外，凝胶质量差以及凝胶冷却时凝固不均匀也会导致该现象出现。
10为什么marker条带非常弱或者根本没有条带？A：出现上述情况可能是：1. marker上样量较低，可适当增加上样量；2. 凝胶质量较差或凝胶凝固不均匀也会导致电泳条带弱或根本没有条带；3. 电泳时间过长导致marker条带跑出凝胶，可缩短电泳时间，降低电压，增加凝胶浓度。
11：为什么marker缺带？A：对于含有较小片段的marker，如果出现缺带现象，可能是因为：1. 小条带跑出凝胶或分子量大小非常相近的条带不易辨认所致，可适当缩短电泳时间，降低电压，同时增加凝胶浓度；2. 凝胶中EB含量过低，导致大片段结合EB量太少或没有，在紫外光下亮度太低，可适当增加EB用量。
问题原因解决办法DNA带模糊DNA降解避免核酸酶污染电泳缓冲液陈旧电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。
建议经常更换电泳缓冲液所用电泳条件不合适电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃；巨大DNA链电泳，温度应＜15℃；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力DNA上样量过多减少凝胶中DNA上样量DNA样含盐过高电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐有蛋白污染电泳前酚抽提去除蛋白DNA变性电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA不规则DNA带迁移对于λ/Hind III片段cos位点复性电泳前于65℃加热DNA 5分钟，然后在冰上冷却5分钟电泳条件不合适电泳电压不超过20V/cm；温度＜30℃；经常更换电泳缓冲液DNA变性以20mM NaCl Buffer稀释DNA，电泳前勿加热带弱或无DNA带DNA的上样量不够增加DNA的上样量；聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高，上样量可适当降低DNA降解避免DNA的核酸酶污染DNA走出凝胶缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度对于EB染色的DNA，所用光源不合适应用短波长（254nm）的紫外光源DNA带缺失小DNA带走出凝胶缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度分子大小相近的DNA带不易分辨增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度DNA 变性电泳前请勿高温加热DNA链，以20mM NaCl Buffer稀释DNADNA链巨大常规凝胶电泳不合适在脉冲凝胶电泳上分析问题可能原因解决方法DNA Marker降解核酸酶污染每次吸取时更换灭菌枪头，勿将电泳缓冲液带入管中；用后密闭4°C保存保存不当4°C 或-20°C保存，避免多次反复冻融；不可加热DNA Marker无法正确分离琼脂糖质量差使用质量可靠的琼脂糖制胶电泳缓冲液多次使用后失效更换缓冲液条带黯淡核酸浓度过低增加上样量核酸降解使用不含核酸酶的试剂和耗材制备样品DNA条带被示踪染料掩盖提高上样量；避免使用与目的片段迁移率相同的示踪染料条带模糊或弥散电泳缓冲液多次使用后失效更换缓冲液核酸部分降解使用不含核酸酶的试剂和耗材制备样品核酸样品纯度差，含有DNA结合蛋白或高浓度的盐份酚/仿抽提或乙醇沉淀去除蛋白、盐份等杂质电压过低，电泳时间过长根据凝胶大小和电泳缓冲液类型，使用适当的电压进行电泳染色时间过长或拍照前放置过久，DNA条带弥散电泳结束后及时观察、拍照条带缺失DNA条带分子量过大使用脉冲凝胶电泳分子量接近的DNA条带没有分开选择适当的凝胶浓度进行电泳电泳缓冲液使用不当SD和TBE缓冲液适于分析较小分子量的DNA片段，大片段分子不能完全分离；TAE缓冲液不适于分离很小的DNA片段电泳时间过长或电压过高，DNA走出凝胶缩短电泳时间，调整电压电极插反，DNA走出凝胶正确连接电极方向条带大小不正确核酸降解或形成聚合物加热处理或重新制备样品λDNA酶切Marker的cos位点复性电泳前65°C加热5分钟，冰上冷却5分钟以后再上样相同分子量的DNA片段由于结构或序列的差异而有不同的迁移率判断DNA分子是否有特殊结构，如缺口、超螺旋、二聚体等；富含AT碱基的DNA迁移率比同分子量富含GC碱基的DNA片段慢梳子变形，点样孔不在同一水平线上使用完好的梳子制胶带型异常不同样本的上样条件不同选用相同的上样缓冲液，上样量尽可能接近上样量过大或过小选择合适大小的上样孔，样品应完全覆盖点样孔底部核酸样品纯度差，含有DNA结合蛋白或高浓度的盐份酚/仿抽提或乙醇沉淀去除蛋白、盐份等杂质电泳缓冲液未完全浸没凝胶上样和电泳时，确保缓冲液始终能完全覆盖凝胶电压过高或电泳时间过长致使凝胶过热和DNA变性根据凝胶大小和电泳缓冲液类型，使用适当的电压进行电泳凝胶中加入EB造成染色不均加入EB时充分混匀或电泳结束后再染色凝胶中有气泡或污染物使用纯水和洁净容器制胶；缓慢灌胶，并赶除气泡点样孔质量差待凝胶完全凝聚后再取出梳子；。