人类细胞质RNA提取、RT-PCR的原理、方法、琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用
RT–PCR的原理及实验步骤
RT –PCR的原理及实验步骤一、RT –PCR的原理RT -PCR即逆转录-聚合酶链反应。
原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。
再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：(1)依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；(2)Rnase水解活性：水解RNA:DNA杂合体中的RNA；(3)依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。
该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
二、RT-PCR的准备：1.引物的设计及其原则：(1)引物的特异性决定PCR反应特异性。
因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。
在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA对引物的特异性的影响。
尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。
(2)引物设计原则的把握：引物设计原则包括:a.引物长度:一般为15～30 bp ，引物太短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最适温度，也影响反应的特异性。
b.碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现3个以上的单一碱基。
GC含量（Tm值）：40％～60％，PCR扩增的复性温度一般是较低Tm值减去5～10度。
c.3‘端要求：3’端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。
人类细胞质RNA提取、RT-PCR的原理、方法、琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用 ppt课件
12000rpm离心15min，小心去上清，加入1ml 70%乙醇，震荡数秒， 8000rpm离心5min
小心去上清，室温干燥5min，加入10ul DEPC水，打匀
55℃水浴10分钟助溶
ppt课件
11
提取RNA
（三）、注意事项
1、塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡12h以上，高压灭菌。
2、有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗， 乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水 冲洗，晾干。
ppt课件
20
操作步骤
（三）cNDA合成
（1）两步法RT-PCR a常用的反应体系
10×RT反应缓冲液
2ul
dNTP Mixture（各10mM） 2ul
RNAase inhibitor (40U/ul) 0.5ul
oligo (dT)18
1ul
逆转录酶
1ul
总RNA
0.5~1ug
DEPC－free水
35
电泳
在低电压条件下，线性DNA 分子的电泳迁移率与所用的电压 呈正比。因此为了获得电泳分离 DNA片段的最大分辨率，电场强 度不宜高于5V/cm。
2019/11/8
ppt课件
STEPS
does matter
36
染色与照相
常用荧光染料溴乙锭（EB） 染色，在紫外光下观察DNA条带， 用紫外分析仪拍照，或用凝胶成 像系统输出照片，并进行有关的 数据分析。
2019/11/8
ppt课件
22
操作步骤
（三）cNDA合成
（2）一步法RT-PCR
在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转 录和PCR优化的条件下，在同一管内进行。
人类RNA的提取、RT-PCR技术以及琼脂糖凝胶电泳
DNA降解 DNA跑出凝胶 EB染色的DNA所用光源不合适 DNA DNA跑出凝胶 分子大小相近的DNA带不易分辨 DNA变性 DNA链巨大，常规凝胶电泳不合 适。
电泳时
配胶的缓冲液与电泳的缓冲液 不是同时配制。
电泳时电压过高
同时配制，电泳缓冲液高出胶的1-2mm即 可。
电泳时电压不应超过20V/cm。
二、方法
方法一：反转录-第一链cDNA合成、 PCR合成第二链 方法二：反转录-聚合酶链反应（RTPCR扩cDNA）
part 3
琼脂糖凝胶电泳 结果分析
应用
一、结果分析
琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种 电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳最主要区 别是：它兼有“分子筛”和“电泳技术”的双重作 用。 所谓分子筛，就是它只允许直径比孔径小的分 子进入，因此能将混合物中的分子按大小加以筛分。 电泳，就是溶液中的带电颗粒在电场中朝着与 其自身所带电荷相反的方向移动的现象，利用这种 现象将电场中不同带电颗粒区分的方法就是电泳技 术。 以下为结果分析中常见的问题。
总RNA的提取,RT-PCR实验报告
生物化学实验报告姓名：学号：专业年级：组别：第二实验室生物化学与分子生物学实验教学中心实验名称总RNA的提取与RT-PCR实验日期2019-11-22 实验地点第二实验室合作者指导老师评分XX 教师签名李某某批改日期2013-06-03 一、实验目的1. 掌握从细胞中提取总RNA的方法2. 熟悉离心机的基本操作3. 掌握RT-PCR基因扩增的原理和过程4. 熟悉电泳法鉴定所得RNA二、实验原理1. 细胞总RNA的提取及定量1)每个细胞内大概有10-5mg RNA（主要有rRNA，tRNA，mRNA三种）2)mRNA 3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)结构，可用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA 3)对RNA进行分离有异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。
4)目前常用的是Trizol法，能快速地从细胞组织中分离出RNA，适用于小量样品也使用于大量样品5)在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在上层水相中。
6)取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA ，用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质2. 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。
再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达三、材料与方法：以流程图示意材料总RNA的提取RT-PCR1. 微量加样枪，灭菌超薄PCR反应管， 1.基因扩增仪、微量加样枪、灭菌超2. Trizol试剂，氯仿，异丙醇，75%乙醇，无RNase的水或0.5%SDS（溶液均用DEPC 处理过的水配置）薄PCR反应管2.提取的总RNA3.第一链cDNA合成试剂盒（含有逆转录酶、RNA酶抑制剂、缓冲液）4.dNTP mix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2 mmol/L四、结果与讨论：①结果：实验数据、现象、图谱；②讨论：以结果为基础的逻辑推论，并得出结论。
人类DNA、RNA提取、核酸内切酶切割、琼脂糖凝胶电泳
RT-PCR
PCR基本步骤：
A、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单 链DNA； B、退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模 板结合。 C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退 火引物沿5‘ 3’方向延伸。 以上三步为一个循环，如此反复。
人类基因组DNA提取
3．加等体积饱和酚，轻摇混匀10分钟，2000rpm离 心10分钟，去除蛋白和SDS的沉淀。 • 4.小心移上清至另一离心管，加等体积氯仿混匀5分 钟，室温2000rpm离心5分钟。 • 5.小心移上清，若上清不清亮透明，则用等体积氯 仿再抽提一次。
人类基因组DNA提取
• 6.将上清移入另一离心管中，沿离心管壁向DNA溶 液中加入2.5倍体积的无水乙醇，轻轻摇动离心管混 和至体系完全均一，见白色絮状DNA。用移液器吸 头挑出DNA沉淀，在新配制的70%乙醇洗二次，室 温干燥5分钟，再将DNA溶于20-100 μl TE中，测OD 值。 • 7. TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求长 期保存，则需加2倍体积无水乙醇置-70℃保存。
注意事项
•
人类基因组DNA提取
1.酚抽提时如果上清液太黏，不能和蛋白质分开時 ，可加入适量STE稀释，然后再用酚抽提。 • 2.保温可在45~55℃范围内进行。 • 3.真核生物的DNA分子很大，机械张力极易引起 DNA分子的断裂，因此抽提DNA时动作不可过猛； 溶液转移次数要尽量减少，而且转移时一定要用粗 口径滴管，以防机械力（震动）将DNA分子打得太 碎。
RT-PCR及琼脂糖凝胶电泳原理与结果
实验原理
PCR是在合适条件下的这种循环的不断重复。PCR按照底 物（即模板DNA）的来源和引物的特点可分为经典PCR、 逆转录PCR（RT-PCR）和免疫PCR（IM-PCR）。其中， RT-PCR较常用。在这个反应体系中，被检物为RNA，如 mRNA，需借助逆转录酶的逆转录作用，转变为相应的互 补链DNA（cDNA）才能进行PCR。为此，逆转录和PCR 分两步进行，先作逆转录获得cDNA，再以此为模板作 PCR。
RT-PCR反应体系
Volume(µl) 8(1µg) 4 2 1 0.4 1.0 Components R.T.Product 10xPCR buffer MgCl2(25mmol/L) Volume(µ l 5.0 2.5 2.5
Primer1
Primer2 Taq DNA polymerase ddH2O Total
琼脂糖凝胶电泳的操作过程
用移液器吸取PCR产物10μl于封口膜上，再 加入2μl 的6X载样缓冲液，混匀后，小心 加入点样孔。 打开电源开关，调节电压至50-100V，可 见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳 约30min-60min。
将凝胶置于凝胶成像系统，打开紫外灯， 可见到发出荧光的DNA条带。
琼脂糖凝胶电泳的操作过程
1g 琼脂糖加入100ml 1×TAE电泳缓冲液 中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全 溶解。（冷却到60℃，加入5μl的goldview， 并摇匀。） 装好制胶板，插入适当梳子，将溶解的琼 脂糖（约50℃）倒入，室温冷却凝固。 充分凝固后，小心垂直向上拔出梳子，将 凝胶置入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液 至液面覆盖凝胶1-2mm。
琼脂糖凝胶电泳的原理
琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定核酸片段的有效方法， 琼脂糖溶化再凝固后能形成带有一定孔隙的固体 基质的特性，利用电荷效应，在电场的作用下及 中性pH的缓冲条件下，带负电的核酸分子向正极
DNA,RNA提取原理方法和琼脂糖凝胶电泳,PCR技术,限制性内切酶简介
二、概念
核酸酶：催化核酸酯键的水解 核酸外切酶：作用于核酸链的末端（3’端或5’ 端）逐个水解下核苷酸 核酸内切酶：从核酸分子内部切断3’,5’-磷酸 二酯键 限制性核酸内切酶：在细菌细胞内存在的一类能 识别并水解外源双链DNA的核酸内切酶
三、限制性核酸内切酶的分类
1、第一型（Type I）： 既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基 化的DNA的水解； 2、第二型（Type II）： 只催化非甲基化的DNA的水解，其切割位 点可知、固定是，是最常用的限制性核酸内切酶； 3、第三型（Type III）： 同时具有修饰及认知切割的作用
CTAB法原理（植物DNA提取经典方法） CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide， 十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂， 可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。 具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖 的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留 在溶液里 该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶 的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等 杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
CTAB提取缓冲液的经典配方
Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境，使DNP（脱氧核糖核蛋白 ）。CTAB溶解细胞 膜，并结合核酸，使核酸便于分离； β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易 去除
SDS法流程图 （以动物组织为例）
其它方法
浓盐法：利用RNA和DNA在盐溶液中溶解度不同， 将二者分离
有机溶剂抽提法：有机溶剂作为蛋白变性剂，同时 抑制核酸酶的降解作用
RTPCR的实验原理与操作步骤
提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。
再以cDNA为模板进行PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
RT-PCR使测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。
该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。
(一) 反转录酶的选择1. Moloney鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。
最适作用温度为37℃。
2. 禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。
最适作用温度为42℃。
3. Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2 存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。
4. MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。
此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的m模板合成较长cDNA。
(二) 合成cDNA引物的选择1. 随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。
用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。
通常用此引物合成的cDNA中96%来源于 rRNA。
2. Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。
因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA被转录。
由于Poly(A )RNA仅占总RNA 的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。
3. 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
STEPS
does matter
2014-12-19
样品配制与加样
DNA样品用适量Tris-EDTA缓 冲液溶解，缓冲液内含有0.25%溴 酚蓝或其他指示染料，含有10%15%蔗糖或5%~10%甘油，以增加 其比重，使样品集中。
STEPS
does matter
2014-12-19
电泳
在低电压条件下，线性DNA 分子的电泳迁移率与所用的电压 呈正比。因此为了获得电泳分离 DNA片段的最大分辨率，电场强 度不宜高于5V/cm。
2014-12-19
实验前的准备
RNA实验失败的主要原因是RNA酶的污 染。由于RNA酶广泛存在而稳定，可耐受多 种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等， 只要存在少量的RNA酶就会引起RNA的降解 ，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接 影响RNA分析的结果，所以建立一个无RNA 酶的环境对于制备RNA很重要。
incipe
1.5
2.0
3-0.2 2-0.05
does matter
2014-12-19
pr
选择电泳类型 选择电泳缓 冲体系
染色和照相
电泳
琼脂糖凝胶 的制备
2014-12-19
样品的制备 与加样
选择电泳类型
STEPS
does matter
用于分离核酸的琼脂糖凝 胶电泳可分为垂直型及水平型 （平板型）。
2014-12-19
实验原理
Trizol试剂盒是一种苯酚与异硫氰酸胍 (GTC)的混合物，异硫氰酸胍可裂解细胞，促 使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离。 加入氯仿可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚促 使RNA进入水相，离心后，RNA保留在水相 中，DNA和蛋白质保留在有机相中。转移水 相，加入异丙醇沉淀RNA，从而得到纯化的 总RNA。
RNA
2014-12-19
主要内容
◆人类细胞质RNA提取 ◆RT-PCR的原理、方法 ◆琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用
2014-12-19
人类细胞质RNA提取
提取总RNA
电泳
合成cDNA第 一链
2014-12-19
PCR
真核细胞RNA的种类
真核细胞总RNA主要由rRNA（80-85%）、 tRNA和核内小分子RNA(10-15%)、mRNA（15%）组成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于细 胞质中。 大多数真核细胞mRNA在其3'端均有一多 聚A(Poly A)尾巴。
实验原理
1、琼脂糖为链状多糖 →绳状琼脂 琼脂糖浓度与 DNA分离范围 糖束→大网孔型凝胶 ——分离、 1.0 1.2 琼脂糖浓度 鉴定、纯化 DNA /% 0.5 0.7 线状DNA 大小/kb 30-1 120.8 分 10-0.5 7-0.4 2、影响DNA 迁移率的因素： DNA 子的大小、构象，凝胶浓度，电 压，电泳缓冲液的组成
2014-12-19
提取RNA
（一）、准备试剂
• 氯仿 • 异丙醇 • 75℅乙醇 • 无RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC处 理过的水配制)
2014-12-19
提取RNA
（二）、操作步骤
取材:用生理盐水漱口后，含生理盐水约2~3min，用15ml离心管（
4000rpm 5min）收集细胞(同管多次离心)，弃上清
2014-12-19
操作步骤
（二） RNA的提取
2014-12-19
操作步骤
（二） RNA的提取
2014-12-19
操作步骤
（三）cNDA合成
（1）两步法RT-PCR a常用的反应体系
10×RT反应缓冲液 2ul dNTP Mixture（各10mM） 2ul RNAase inhibitor (40U/ul) 0.5ul oligo (dT)18 1ul 逆转录酶 1ul 总RNA 0.5~1ug DEPC－free水 补足体系至20ul
2014-12-19
常用的RNA酶抑制剂
1、焦磷酸二乙酯（DEPC）：与RNA酶的活性 基团组氨酸的咪唑环结合，进而使RNA酶失 活，有高致癌性。（实验准备阶段使用） 2、异硫氰酸胍、氯仿：提取RNA同时也使 RNA酶失活。 3、RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠 肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。（合 成cDNA阶段使用）
2014-12-19
RNA保存
溶解在无RNase的水或TE中，在-70℃或更低温度中保存 时间在一年以内，但避免反复冻融，应分装保存。 从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需 溶解在去离子甲酰胺中存于-70℃，至少可以保存一年。需使 用RNA时，可以加入NaAc至终浓度0.3M，12000×g离心5分钟 ，70%乙醇洗涤后再用无RNase的水或TE溶解。
结果分析
（二）、常见问题的原因和解决
常见问题 原因 DNA上样量不够 DNA降解 DNA跑出凝胶 对策 增加DNA上样量，聚丙烯酰胺 凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度高 ，上样量可适当降低。 实验过程中应避免核酸酶污染。 缩短电泳时间，降低电压，增加 凝胶浓度。
带弱或无 DNA带
EB染色的DNA所用光源 应用短波长（254nm）的紫外光 不合适 源。
2014-12-19
结果分析
（二）、常见问题的原因和解决
常见问题 原因 出现片状拖 酶量多或者酶的质量差， 带或涂抹带 dNTP浓度高，Mg2+浓度 高，退火温度过低，循环 次数多。 电泳条件不合适 不规则DNA 带迁移 DNA变性
2014-12-19
对策 减少酶量或更换酶，减少dNTP浓 度，适当降低Mg2+浓度，增加模 板量，减少循环次数。
2014-12-19
操作步骤
（六） 产物的电泳和结果的测定
根据产物长度制作适宜浓度的琼脂糖凝胶（不 同长度产物所需凝胶浓度）。 取适量PCR产物，加上样缓冲液充分混合，点 样于事先做好的琼脂糖凝胶点样孔中，10V/cm电 泳45－60min。成像系统成像分析。
2014-12-19
琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用
（三）cNDA合成 （2）一步法RT-PCR
· • • 0.1-1ug 总RNA 200一500 umol/L的dNTP (每种) 0.5umol／L 基因特异引物（上下游）
•
• •
200 U
AMV逆转录酶
1×Taq聚合酶缓冲液 0.5-15mmol／L MgCI2
•
•
2014-12-19
1 mmo1／L DTT
电泳时电压不应超过20V/cm，温 度<30℃，巨大DNA链电泳， 温 度<15℃，检查所用电泳缓冲液的 缓冲能力，注意经常更换。 电泳前勿加热，用20mM NaCl缓 冲液稀释DNA。
沉淀中加入1ml TRIzol ，旋涡震荡10 s 重悬沉淀，加样枪打匀溶液后转
移至1.5ml EP管，15~30℃放置5min
加入0.2 ml氯仿，用手摇晃15 s，15~30℃放置5min
12000rpm离心15min
2014-12-19
提取RNA
（二）、操作步骤
小心吸取上清，转移至新的1.5ml Ep管，加入等体积的异丙醇，15~30℃
2014-12-19
逆转录酶
DNA-RNA 杂化双 链
RNase降解RNA
Taq酶
RT-PCR
单链DNA
DNA聚合酶
cDNA
操作步骤
（一） 引物设计
1、引物的特异性决定PCR反应特异性。 2、引物设计原则的把握：
（1）引物长度:一般为15～30bp （2）碱基分布 （3）3‘端要求 （4）引物自身二级结构 （5）引物之间的二级结构 （6）同源序列 （7）5’端无严格限制
操作步骤
（三）cNDA合成 （2）一步法RT-PCR
在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转 录和PCR优化的条件下，在同一管内进行。 优势：在处理大量样品时易于操作；减少残余 污染；可以得到更高的灵敏度。 缺点：无法优化反应条件；一旦失败，必须重 新提取总RNA。
2014-12-19
操作步骤
常见问题 原因 DNA跑出凝胶 分子大小相近的DNA带 不易分辨 DNA变性 对策 缩短电泳时间，降低电压，增加 凝胶浓度。 增加电泳时间，核准正确凝胶浓 度 电泳前勿加热，用20mM NaCl缓 冲液稀 释DNA。 在脉冲凝胶电泳上个分析。
DNA带缺 尖
2014-12-19
DNA链巨大，常规凝胶 电泳不合适。
2014-12-19
RT-PCR的原理、方法
实验原理
1、单拷贝基因表达存在逐步放大 机制。 2、PCR技术，即聚合酶链式反应。 反应分三步：变性，退火，延伸。 3、逆转录酶。可以以RNA为模板合 成cDNA第一条链，或者以第一条 DNA链为模板合成互补的双链 cDNA。
可见，RT-PCR是一种将cDNA 合成与PCR技术结合分析基因表达 的快速灵敏的方法。
2014-12-19
操作步骤
（三）cNDA合成 （1）两步法RT-PCR b操作
在发给每人一份的已制备分装的逆转录反应管里加入8ul 总RNA溶液 ↓ 0.2ml Ep管，迷你离心机离心数秒，放置PCR仪中
↓
42℃ 30min（合成cDNA第一链）
85℃ 5min（灭活逆转录酶）
2014-12-19
STEPS
does matter
2014-12-19
染色与照相
常用荧光染料溴乙锭（EB） 染色，在紫外光下观察DNA条带， 用紫外分析仪拍照，或用凝胶成 像系统输出照片，并进行有关的 数据分析。
STEPS
does matter
2014-12-19
结果分析
（一）、影响琼脂糖凝胶电泳的因素