菌种保藏及种子扩大培养
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如果菌种已经发生退化，产量下降，则要进 行分离复壮。
菌种的分离: 因为在菌种发生衰退 的同时，并不是所有的菌体都衰退，其中
未衰退的菌体往往是经过环境条件考验的
，具有更强生命力。
•
因此，对于已衰退的菌株采用单细胞
菌株分离的措施，即用稀释平板法或用平
2020/5/28
如对芽孢杆菌(Bacillus)，可先将菌液
• 国外菌种保藏机构 • 美国典型菌种保藏中心ATCC • 美国农业研究菌种保藏中心
NRRL • 英国的国家典型菌种保藏所
NCTC • 德国微生物菌种保藏中心 DSMZ
……
2020/5/28
美国ATCC采用的两种保藏方法
• 即保藏期一般达5~15年的冷冻干燥保藏法 保藏期一般达20年以上的液氮保藏法
讲菌种的保藏与种子扩大培养
2020/5/28
衰退 复壮 保藏 种子扩大培养
一、菌种衰退
• 1.衰退的原因 • (1) 菌种保藏不妥; • (2) 菌种生长的要求没有得到满足，或
是遇到不利的条 件，或是失去某些需要 的条件； • (3) 经诱变获得的新菌株发生回复突变 ，从而丧失新的特征的情况。 • (4) 连续传代。
2020/5/28
2. 菌种性能的改变
(1) 菌种的外在特征改变
异核现象导致微生物群体发 生变异
自发突变导致菌种遗传性 能改变
回复突变 降低(衰；2退代) 菌谢菌株能种的力特降的点低生：；个发理体酵状或周况群期体延改特长变征；发抗生不变良化环；境生能产力能降力低。
2020/5/28
3 . 防止菌种衰退的措施
基本原理： 根据菌种的生理、生化特点，人工地创造条件，使菌种的
代谢活动处于不活波状态。 要求： 维持菌种的存活和减少菌种的变异，尽量使菌种保持原来
优良的生产性能。 保藏时首先选择优良纯菌种，最好是它们的休眠体如孢
子（ spore）、芽孢 (gemma)等； 要创造一个有利于休眠的环境条件，如低温、干燥、缺
2020/5/28
一、 种子扩大培养阶段
A： 实验室种子的制备： e.g 产黄青霉菌(P.chrysogonum)
原始菌种
斜面试管
250ml 茄子瓶（大米或小米） 25 ~28°C ，4~14天
成熟
（在真空下抽去水分，使水分含量在10%以下，于4 °C冰箱保存）
2020/5/28
e.g. （ Glutamic acid-producer ）
2020/5/28
复壮的措施
• 通过分离达到复壮 在琼脂平板划线、涂布或与琼脂培养基混 合培养再分离，达到—菌落纯 采用单细胞或单孢子分离法达到—细胞纯
• 通过寄主体达到复壮 将菌株接种到寄主细胞进行繁殖达到复壮 。
•202淘0/5/2汰8 已衰退的个体达到复壮
三、菌种保藏（strain preservation）
氧和缺乏营养物质的，即可达到降低其代谢活动，延长其保
。 存202期0/5/的28 目的
保存方法：
应能较长期地保存原有菌种的优良性能，使菌种稳定，同时也要 考虑到方法本身的经济简便。不同的菌种有不同的保存方法，以便长 期保藏。
酵母菌：定期移植斜面低温保藏法。也可采用石蜡油封保藏法。 霉菌：沙土管保藏法。 细菌和放线菌：一般细菌以采用冷冻干燥保藏法为佳。 放线菌可 用沙土或冷冻保藏法保藏。
5-10 L卡氏罐(15 °C-20 °C ，3-5天）
2020/5/28
B：生产车间种子制备 种子罐的作用：使
有限数量的孢子发芽、 生长、并繁殖成大量的 菌丝体，满足发酵罐的 需要。（菌体生长和产 物形成）。
2020/5/28
种子罐级数的确定
• 种子罐级数是指制备种子逐级扩培 的次数。 依据：菌种生长特性 孢子发芽及菌体繁殖的速度 所用的种发子酵罐(罐se的ed容ing积ta。nk)的级数
固体试管斜面（32 °C ，18~24小时） 小三角瓶培养（摇床）
谷 氨 酸 生 产 菌
2020/5/28
大三角瓶培养（摇床）
• e.g. yeast：
原始菌种（出发菌种）
10mL 麦汁试管 （25 °-27 °C ，3天）
250mL 三角瓶培养（25°C， 2天）
1000mL 三角瓶培养（25°C， 2天）
用沸水处理几分钟，再用平板进行分离， 从所剩下的孢子中挑选出最优的菌体。
如果遇到某些菌株即使进行单细胞分 离，仍不能达到复壮的效果，则可改变培 养条件，达到复壮的目的。
如AT3.942栖土曲霉(Aspergillus terricola)的产孢子能力下降，可适当提高
2020/5/28
防止衰退的措施
保藏应注意的问题：
菌体状态：休眠体
基质：营养贫乏
操作过程：不应对细胞造成伤害
2020/5/28
国内外菌种保藏机构
• 中国微生物菌Biblioteka Baidu保藏管理委员会（CCCCM ）
1979年成立，下设6个菌种保藏管理中心 CCGMC 普通微生物菌种保藏管理中心 ACCC 中国农业微生物菌种保藏管理中心 CICC 工业微生物菌种保藏管理中心 CMCC 医学微生物菌种保藏管理中心 CACC 抗菌素菌种保藏管理中心 CVCC 2020/5/28 兽医微生物菌种保藏管理中心
• 菌种的分离 • 菌种的复壮 • 提供良好的环境
条件
• 使用优良的保存 方法
2020/5/28
二、菌种的复壮
• 菌种的复壮 狭义的复壮和广义的复壮 • 狭义的复壮 指菌种已经发生衰退后，再
通过纯种分离和性能测定等方法，从衰退的 群体中找出尚未衰退的少数个体，以达到恢 复改菌种原有典型性状的一种措施。 • 广义的复壮 指的是一种积极的措施，即 在菌种的生产性能尚未衰退前就经常有意识 地进行纯种分离和生产性能的测定工作，使 菌种的生产性能逐步提高。
产物的品种 生产规模 工艺条件
2020/5/28
种子罐级数越少越好：
简化生产工艺和控制
减少接种带来的染菌机会
2020/5/28
3 种子扩大培养
目的：为发酵罐的投料提供相当数量的代谢旺盛的种子。 原因：发酵时间的长短和接种量的大小有关，接种量大，发 酵时间则短。将较多数量的成熟菌体接入发酵罐中，就有利于缩 短发酵时间，提高发酵罐的利用率，并且也有利于减少染菌的机 会。 种子扩大培养的任务，不但要得到纯 而壮的培养物，还要获得活力旺盛的、接 种数量足够的培养物。
菌种的分离: 因为在菌种发生衰退 的同时，并不是所有的菌体都衰退，其中
未衰退的菌体往往是经过环境条件考验的
，具有更强生命力。
•
因此，对于已衰退的菌株采用单细胞
菌株分离的措施，即用稀释平板法或用平
2020/5/28
如对芽孢杆菌(Bacillus)，可先将菌液
• 国外菌种保藏机构 • 美国典型菌种保藏中心ATCC • 美国农业研究菌种保藏中心
NRRL • 英国的国家典型菌种保藏所
NCTC • 德国微生物菌种保藏中心 DSMZ
……
2020/5/28
美国ATCC采用的两种保藏方法
• 即保藏期一般达5~15年的冷冻干燥保藏法 保藏期一般达20年以上的液氮保藏法
讲菌种的保藏与种子扩大培养
2020/5/28
衰退 复壮 保藏 种子扩大培养
一、菌种衰退
• 1.衰退的原因 • (1) 菌种保藏不妥; • (2) 菌种生长的要求没有得到满足，或
是遇到不利的条 件，或是失去某些需要 的条件； • (3) 经诱变获得的新菌株发生回复突变 ，从而丧失新的特征的情况。 • (4) 连续传代。
2020/5/28
2. 菌种性能的改变
(1) 菌种的外在特征改变
异核现象导致微生物群体发 生变异
自发突变导致菌种遗传性 能改变
回复突变 降低(衰；2退代) 菌谢菌株能种的力特降的点低生：；个发理体酵状或周况群期体延改特长变征；发抗生不变良化环；境生能产力能降力低。
2020/5/28
3 . 防止菌种衰退的措施
基本原理： 根据菌种的生理、生化特点，人工地创造条件，使菌种的
代谢活动处于不活波状态。 要求： 维持菌种的存活和减少菌种的变异，尽量使菌种保持原来
优良的生产性能。 保藏时首先选择优良纯菌种，最好是它们的休眠体如孢
子（ spore）、芽孢 (gemma)等； 要创造一个有利于休眠的环境条件，如低温、干燥、缺
2020/5/28
一、 种子扩大培养阶段
A： 实验室种子的制备： e.g 产黄青霉菌(P.chrysogonum)
原始菌种
斜面试管
250ml 茄子瓶（大米或小米） 25 ~28°C ，4~14天
成熟
（在真空下抽去水分，使水分含量在10%以下，于4 °C冰箱保存）
2020/5/28
e.g. （ Glutamic acid-producer ）
2020/5/28
复壮的措施
• 通过分离达到复壮 在琼脂平板划线、涂布或与琼脂培养基混 合培养再分离，达到—菌落纯 采用单细胞或单孢子分离法达到—细胞纯
• 通过寄主体达到复壮 将菌株接种到寄主细胞进行繁殖达到复壮 。
•202淘0/5/2汰8 已衰退的个体达到复壮
三、菌种保藏（strain preservation）
氧和缺乏营养物质的，即可达到降低其代谢活动，延长其保
。 存202期0/5/的28 目的
保存方法：
应能较长期地保存原有菌种的优良性能，使菌种稳定，同时也要 考虑到方法本身的经济简便。不同的菌种有不同的保存方法，以便长 期保藏。
酵母菌：定期移植斜面低温保藏法。也可采用石蜡油封保藏法。 霉菌：沙土管保藏法。 细菌和放线菌：一般细菌以采用冷冻干燥保藏法为佳。 放线菌可 用沙土或冷冻保藏法保藏。
5-10 L卡氏罐(15 °C-20 °C ，3-5天）
2020/5/28
B：生产车间种子制备 种子罐的作用：使
有限数量的孢子发芽、 生长、并繁殖成大量的 菌丝体，满足发酵罐的 需要。（菌体生长和产 物形成）。
2020/5/28
种子罐级数的确定
• 种子罐级数是指制备种子逐级扩培 的次数。 依据：菌种生长特性 孢子发芽及菌体繁殖的速度 所用的种发子酵罐(罐se的ed容ing积ta。nk)的级数
固体试管斜面（32 °C ，18~24小时） 小三角瓶培养（摇床）
谷 氨 酸 生 产 菌
2020/5/28
大三角瓶培养（摇床）
• e.g. yeast：
原始菌种（出发菌种）
10mL 麦汁试管 （25 °-27 °C ，3天）
250mL 三角瓶培养（25°C， 2天）
1000mL 三角瓶培养（25°C， 2天）
用沸水处理几分钟，再用平板进行分离， 从所剩下的孢子中挑选出最优的菌体。
如果遇到某些菌株即使进行单细胞分 离，仍不能达到复壮的效果，则可改变培 养条件，达到复壮的目的。
如AT3.942栖土曲霉(Aspergillus terricola)的产孢子能力下降，可适当提高
2020/5/28
防止衰退的措施
保藏应注意的问题：
菌体状态：休眠体
基质：营养贫乏
操作过程：不应对细胞造成伤害
2020/5/28
国内外菌种保藏机构
• 中国微生物菌Biblioteka Baidu保藏管理委员会（CCCCM ）
1979年成立，下设6个菌种保藏管理中心 CCGMC 普通微生物菌种保藏管理中心 ACCC 中国农业微生物菌种保藏管理中心 CICC 工业微生物菌种保藏管理中心 CMCC 医学微生物菌种保藏管理中心 CACC 抗菌素菌种保藏管理中心 CVCC 2020/5/28 兽医微生物菌种保藏管理中心
• 菌种的分离 • 菌种的复壮 • 提供良好的环境
条件
• 使用优良的保存 方法
2020/5/28
二、菌种的复壮
• 菌种的复壮 狭义的复壮和广义的复壮 • 狭义的复壮 指菌种已经发生衰退后，再
通过纯种分离和性能测定等方法，从衰退的 群体中找出尚未衰退的少数个体，以达到恢 复改菌种原有典型性状的一种措施。 • 广义的复壮 指的是一种积极的措施，即 在菌种的生产性能尚未衰退前就经常有意识 地进行纯种分离和生产性能的测定工作，使 菌种的生产性能逐步提高。
产物的品种 生产规模 工艺条件
2020/5/28
种子罐级数越少越好：
简化生产工艺和控制
减少接种带来的染菌机会
2020/5/28
3 种子扩大培养
目的：为发酵罐的投料提供相当数量的代谢旺盛的种子。 原因：发酵时间的长短和接种量的大小有关，接种量大，发 酵时间则短。将较多数量的成熟菌体接入发酵罐中，就有利于缩 短发酵时间，提高发酵罐的利用率，并且也有利于减少染菌的机 会。 种子扩大培养的任务，不但要得到纯 而壮的培养物，还要获得活力旺盛的、接 种数量足够的培养物。