菌种与种子扩大培养
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种子的扩大培养 (2)
学习目标
了解基本概念、种子培养的一般过程及培养各阶段 的目的要求；
理解种子培养的各种影响因素； 掌握接种方法、种子质量控制方法、种子培养中的
问题分析及处理手段。
1
第一节 基本概念
◆种子培养 指提供给种子适宜的生长繁殖条件，使种子能够 迅速生长成合格的菌体的过程。
◆种子的扩大培养 休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后， 再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质 量纯种的过程。
22
3.菌丝结团 （现象？） ◆主要原因：①搅拌；②通气；③孢子量小；④
泡沫大等 ◆处理方式：分析原因，对症解决
4.种子罐泡沫大 ◆主要原因：①玉米浆的质量有波动； ②消沫剂的质量有问题； ◆处理方式：间歇搅拌，提高罐压，加大空气翻
腾液面压泡，待菌丝长起来后泡沫即可减小
23
养易于被菌体直接吸收和利用，成分适当，氮源、维 生素含量较高。
②营养成分要尽可能和发酵培养基接近，且略稀 薄为宜。 （2）培养条件
①温度 温度高，细胞中的生化反应快，生长速率 快；菌体蛋白质、核酸等对温度较敏感，温度过高可 能被破坏。微生物生长温度在-10～95℃。发酵菌株 生长最适温度为20～40℃。
19
②pH值 影响微生物对营养物质的吸收、酶的形成及 其活力等。大多数为pH4～9，少数在pH<2或>10。
③通气量 保证菌种代谢对氧的需求，提高种子的质 量。
④搅拌 保证溶氧及种子罐内各处条件均一，利于种 子的培养。可避免菌丝结团、粘壁等现象发生。
20
二、常见问题及其处理手段
1.种子生长缓慢： ◆主要原因：①原材料质量的波动； ②接种孢子量不足；
利用两端压力差，液体从高压流向低压的接种方法。 ①孢子悬液接种 ②种醪接种
了解基本概念、种子培养的一般过程及培养各阶段 的目的要求；
理解种子培养的各种影响因素； 掌握接种方法、种子质量控制方法、种子培养中的
问题分析及处理手段。
1
第一节 基本概念
◆种子培养 指提供给种子适宜的生长繁殖条件，使种子能够 迅速生长成合格的菌体的过程。
◆种子的扩大培养 休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后， 再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质 量纯种的过程。
22
3.菌丝结团 （现象？） ◆主要原因：①搅拌；②通气；③孢子量小；④
泡沫大等 ◆处理方式：分析原因，对症解决
4.种子罐泡沫大 ◆主要原因：①玉米浆的质量有波动； ②消沫剂的质量有问题； ◆处理方式：间歇搅拌，提高罐压，加大空气翻
腾液面压泡，待菌丝长起来后泡沫即可减小
23
养易于被菌体直接吸收和利用，成分适当，氮源、维 生素含量较高。
②营养成分要尽可能和发酵培养基接近，且略稀 薄为宜。 （2）培养条件
①温度 温度高，细胞中的生化反应快，生长速率 快；菌体蛋白质、核酸等对温度较敏感，温度过高可 能被破坏。微生物生长温度在-10～95℃。发酵菌株 生长最适温度为20～40℃。
19
②pH值 影响微生物对营养物质的吸收、酶的形成及 其活力等。大多数为pH4～9，少数在pH<2或>10。
③通气量 保证菌种代谢对氧的需求，提高种子的质 量。
④搅拌 保证溶氧及种子罐内各处条件均一，利于种 子的培养。可避免菌丝结团、粘壁等现象发生。
20
二、常见问题及其处理手段
1.种子生长缓慢： ◆主要原因：①原材料质量的波动； ②接种孢子量不足；
利用两端压力差，液体从高压流向低压的接种方法。 ①孢子悬液接种 ②种醪接种
(完整版)发酵工艺作业答案
第一章菌种与种子扩大培养1、能源问题是全球面临的问题，生物工程将如何解决？答：利用微生物或酶工程技术从生物体生产生物燃料，主要表现在沼气发酵、酒精发酵、氢燃料的研发、生物柴油等方面，另外在石油开发中，利用微生物作为二次采油、石油精炼等手段也是一定程度上缓解能源问题。
并且利用生物工程技术在能源资源的回收利用等方面也是可行的方法。
2、比较固体培养与液体培养的优缺点。
答：⑴固体培养（曲法培养）特点：酶活力高，但劳动强度大，曲层需翻动。
⑵液体培养特点：培养条件易控制，如温度，pH等，但易染菌，要求无菌。
3、菌种扩大培养的目的和意义是什么？答：目的：为每次发酵罐的投料提供相当数量的、代谢旺盛的种子意义：有利于缩短发酵时间，提高发酵罐的利用率，也有利于减少染菌的机会4、工业生产用菌种的基本要求有什么？答：①培养基原料来源广、廉价；②培养条件易控制；③发酵周期短；④菌株高产；⑤抗病毒（噬菌体）能力强；⑥菌株性状稳定，不易变异退化；⑦菌体本身不能是病原菌；5、种子罐级数的选择取决于那些因素？答：①种子的性质（生长繁殖性能）；②孢子瓶中孢子的密度（密度大则级数少）；③孢子发芽及菌丝繁殖速度；④发酵罐中种子的最低接种量（一般10%）；⑤种子罐与发酵罐的容积比；6、简述加大接种量的优缺点。
答：优点：缩短发酵周期；减少染菌机会；提高设备利用率缺点：种子培养费时；增加级数；代谢废物多7、简述防止菌种衰退的方法。
答：①尽可能满足其营养条件、培养条件，避免有害因素影响；②尽量减少传代次数；③采用幼龄菌种；第二章培养基及其制备1.微生物发酵培养基的碳源主要有哪几种？答：碳酸气、淀粉水解糖、糖蜜、亚硫酸盐纸浆废液等、醋酸、甲醇、乙醇等死哟偶化工产品功能：提供能量、构成菌体、代谢产物的物质基础；2.微生物发酵培养基的氮源主要有哪几种？答：豆饼或蚕蛹水解液、味精废液玉米浆、酒糟水等有机氮尿素、硫酸铵、氨水、硝酸盐等无机氮、气态氮功能：构成菌体、含氮代谢物；3.淀粉的水解方法主要有什么？试进行优缺点比较？答：（1）.酸解法：以酸为催化剂，高温高压转化优点：简单、设备少、时间短缺点：设备易腐蚀、要耐高温高压，有副反应；淀粉粒小、浓度不能太高。
发酵工程第五章
培养基特点：有利于菌体的生长，所使用 的原料已经基本接近于发酵培养基
发酵工程
3.一级种子培养 培养基：水解糖2.5%，尿素0.5%，玉米 浆 2.5%，K2HPO4 0.1%, ph7.0
培养条件：在种子罐中培养, 32℃培养7-10个小时
培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基
发酵工程
最终发酵 培养基成分：水解糖2.5%；尿素0.5%，玉米
对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶 段的种子扩培最终是获得一定数量和质量的菌 体。
如： 谷氨酸的种子培养。
发酵工程
b.对于产孢子的微生物 获得一定数量和质量的孢子 在固体培养基上产生大量孢子
获得一定数量和质量的菌丝体 在液体培养基中生产大量菌丝
发酵工程
2.2培养基选择的原则
培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对 孢子培养基应该是有利于孢子的生长。
发酵工程
根据文献记载，多数微生物，如病毒、 细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等 都能冻干保藏。许多菌种用此法可保 藏10年以上。
发酵工程
5. 液氮超低温保藏法
几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液 氮超低温保藏。只有少量对低温损伤敏感 的微生物例外。
发酵工程
液氮超低温保藏过程是将菌种悬浮液封存 于圆底安瓿管或塑料的液氮保藏管(材料应 能耐受较大温差骤然变化)内，放到-150～ -196℃的液氮罐或液氮冰箱内保藏。操作 过程中一大原则是“慢冻快融”。
发酵工程
为了减轻冷冻损伤程度，可采用保护剂。 如甘油和二甲亚砜。
发酵工程
注意：
液氮冷冻保藏管应严格密封。若有液氮渗 入管内，在从液氮容器中取出时，管中液 氮的体积将膨胀680倍，具很强的爆炸力， 必须特别小心。
发酵工程
3.一级种子培养 培养基：水解糖2.5%，尿素0.5%，玉米 浆 2.5%，K2HPO4 0.1%, ph7.0
培养条件：在种子罐中培养, 32℃培养7-10个小时
培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基
发酵工程
最终发酵 培养基成分：水解糖2.5%；尿素0.5%，玉米
对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶 段的种子扩培最终是获得一定数量和质量的菌 体。
如： 谷氨酸的种子培养。
发酵工程
b.对于产孢子的微生物 获得一定数量和质量的孢子 在固体培养基上产生大量孢子
获得一定数量和质量的菌丝体 在液体培养基中生产大量菌丝
发酵工程
2.2培养基选择的原则
培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对 孢子培养基应该是有利于孢子的生长。
发酵工程
根据文献记载，多数微生物，如病毒、 细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等 都能冻干保藏。许多菌种用此法可保 藏10年以上。
发酵工程
5. 液氮超低温保藏法
几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液 氮超低温保藏。只有少量对低温损伤敏感 的微生物例外。
发酵工程
液氮超低温保藏过程是将菌种悬浮液封存 于圆底安瓿管或塑料的液氮保藏管(材料应 能耐受较大温差骤然变化)内，放到-150～ -196℃的液氮罐或液氮冰箱内保藏。操作 过程中一大原则是“慢冻快融”。
发酵工程
为了减轻冷冻损伤程度，可采用保护剂。 如甘油和二甲亚砜。
发酵工程
注意：
液氮冷冻保藏管应严格密封。若有液氮渗 入管内，在从液氮容器中取出时，管中液 氮的体积将膨胀680倍，具很强的爆炸力， 必须特别小心。
第三章发酵工程与食品产业第四节 菌种的活化与扩大培养
2. 种子罐级数的确定
依据: 依据 菌种的性质和菌体生长速度及发酵设备的合理应用 种子制备目的: 形成一定数量和质量的菌体。 种子制备目的 形成一定数量和质量的菌体。 发酵的目的: 发酵的目的 获得大量的发酵产物 并达到一定生长阶段后形成的， 产物是在菌体大量形成 并达到一定生长阶段后形成的， 需要在大型发酵罐内才能进行。 需要在大型发酵罐内才能进行。同时若干发酵产物的产生 菌其不同生长阶段对营养和培养条件的要求有差异。因此， 菌其不同生长阶段对营养和培养条件的要求有差异。因此，将 两个目的不同、 两个目的不同、工艺要求有差异的生物学过程放在一个大罐 内进行，既影响发酵产物的产量，又会造成动力和设备的浪费。 内进行，既影响发酵产物的产量，又会造成动力和设备的浪费。
2.2 生产车间种子制备
1.种子罐种子制备 种子罐种子制备 种子罐种子制备的工艺过程，因菌种不同而异，一般 种子罐种子制备的工艺过程，因菌种不同而异， 可分为一级种子、二级种子和三级种子的制备。 可分为一级种子、二级种子和三级种子的制备。 1) 孢子 或摇瓶菌丝)被接入到体积较小的种子罐中，经培 孢子(或摇瓶菌丝 被接入到体积较小的种子罐中 或摇瓶菌丝 被接入到体积较小的种子罐中， 养后形成大量的菌丝，这样的种子称为一级种子. 养后形成大量的菌丝，这样的种子称为一级种子 把一级种子转入发酵罐内发酵，称为二级发酵。 把一级种子转入发酵罐内发酵，称为二级发酵。 2) 如果将一级种子接入体积较大的种子罐内，经过培养形 如果将一级种子接入体积较大的种子罐内， 成更多的菌丝，这样制备的种子称为二级种子. 成更多的菌丝，这样制备的种子称为二级种子 将二级种子转入发酵罐内发酵，称为三级发酵。 将二级种子转入发酵罐内发酵，称为三级发酵。 同样道理，使用三级种子的发酵，称为四级发酵。 同样道理，使用三级种子的发酵，称为四级发酵。
发酵工程(2)第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养
淀粉酶活力极强，多作糖 化酶使用；具有较强的蛋白质 分解能力，可用于制造腐乳。
华根霉 ( Rhizopus chinentis )
酿酒所必须的重要霉菌，也是 酸性蛋白酶和腐乳生产中的重要菌 种。
2、毛霉 ( Mucor )
鲁氏毛霉 ( Mucor rouxianus ) 能糖化淀粉且能生成少量酒精；能产生
6、醋酸菌 (Acetobacter)
➢ 不形成芽孢，G－，好气性 ➢ 可生产醋酸.
7、棒状杆菌 (Corynebacterium) ➢ 是谷氨酸和其他氨基酸的高产菌.
8、短杆菌 (Brevibacterium)
氨基酸、核苷酸工业生产中常用的菌种，也是酶法 合成生产辅酶A的菌种.
9、黄单胞菌 (Xanthomonas)
5、假丝酵母 (Candida)
➢能形成假丝，液体培养时能 形成浮膜。 ➢可生产SCP、甘油、脂肪酶。
6、红酵母 (Rhodotorula)
➢有明显的红色或黄色色 素，很多种因生荚膜而形 成粘质状菌落。 ➢可由菌体提取大量脂肪、 -胡萝卜素。
7、棉病针孢酵母 ( Nematspora gossypii )
2、葡萄汁酵母 (Saccharomyces uvarum)
与酿酒酵母相似，主要的区别在于葡萄汁酵母能发酵 棉子糖和蜜二糖。
3、汉逊酵母 (Hansenula)
此属酵母多能产生乙酸乙酯，从而增加产品的香 味，可用于酿酒和食品工业。
4、球拟酵母 (Toruiopsis)
此属酵母有些种能产生不同比例的甘油、赤藓 糖、阿拉伯糖；有的能利用烃类生产蛋白质。
复筛 不纯 第四次平板分离
第三次菌种保藏
第四次原种斜面
初步工艺条件摸索
再复筛
华根霉 ( Rhizopus chinentis )
酿酒所必须的重要霉菌，也是 酸性蛋白酶和腐乳生产中的重要菌 种。
2、毛霉 ( Mucor )
鲁氏毛霉 ( Mucor rouxianus ) 能糖化淀粉且能生成少量酒精；能产生
6、醋酸菌 (Acetobacter)
➢ 不形成芽孢，G－，好气性 ➢ 可生产醋酸.
7、棒状杆菌 (Corynebacterium) ➢ 是谷氨酸和其他氨基酸的高产菌.
8、短杆菌 (Brevibacterium)
氨基酸、核苷酸工业生产中常用的菌种，也是酶法 合成生产辅酶A的菌种.
9、黄单胞菌 (Xanthomonas)
5、假丝酵母 (Candida)
➢能形成假丝，液体培养时能 形成浮膜。 ➢可生产SCP、甘油、脂肪酶。
6、红酵母 (Rhodotorula)
➢有明显的红色或黄色色 素，很多种因生荚膜而形 成粘质状菌落。 ➢可由菌体提取大量脂肪、 -胡萝卜素。
7、棉病针孢酵母 ( Nematspora gossypii )
2、葡萄汁酵母 (Saccharomyces uvarum)
与酿酒酵母相似，主要的区别在于葡萄汁酵母能发酵 棉子糖和蜜二糖。
3、汉逊酵母 (Hansenula)
此属酵母多能产生乙酸乙酯，从而增加产品的香 味，可用于酿酒和食品工业。
4、球拟酵母 (Toruiopsis)
此属酵母有些种能产生不同比例的甘油、赤藓 糖、阿拉伯糖；有的能利用烃类生产蛋白质。
复筛 不纯 第四次平板分离
第三次菌种保藏
第四次原种斜面
初步工艺条件摸索
再复筛
菌种扩大培养的一般流程
菌种扩大培养的一般流程菌种扩大培养是微生物学实验中常见的一项操作，其目的是在较小的培养基中培养并扩大菌种数量，以满足后续实验的需要。
下面将介绍一般的菌种扩大培养流程，以帮助读者了解和掌握这一技术。
第一步：选择适当的培养基菌种扩大培养的第一步是选择适当的培养基。
不同的菌种对培养基的要求不同，因此选择合适的培养基是非常重要的。
一般来说，培养基应包含适当的营养物质，如碳源、氮源、矿物质和水等，以满足菌种生长的需要。
第二步：制备培养基制备培养基是菌种扩大培养的关键步骤之一。
一般情况下，制备培养基需要将适量的培养基粉末溶解在适量的蒸馏水中，并进行加热煮沸，以杀灭其中的细菌和其他微生物。
然后，将煮沸的培养基倒入无菌培养皿或试管中，并在冷却后加入适量的菌种。
第三步：接种菌种接种菌种是菌种扩大培养的关键步骤之一。
接种菌种时，首先需要将菌种从原始培养基中转移到新的培养基中。
这可以通过采用无菌的接种环、接种针等工具，将菌种从原始培养基中接种到新的培养基中完成。
为了确保接种的无菌性，可以在接种后进行密封和贴标。
第四步：培养菌种在接种菌种后，需要将培养基置于适当的环境条件下进行培养。
一般来说，菌种的生长需要适宜的温度、湿度和氧气条件。
因此，在培养过程中需要注意保持适宜的培养环境，并定期观察菌落的生长情况。
第五步：检测菌种的生长情况在培养一定时间后，需要检测菌种的生长情况。
这可以通过肉眼观察菌落的形态、颜色和大小等特征来判断。
同时，也可以采用显微镜观察菌落的细胞形态和结构，以进一步确定菌种的生长情况。
第六步：收获菌种在菌种生长到一定程度后，可以进行菌种的收获。
一般来说，菌种可以通过离心、过滤和冻干等方法进行收获。
收获后的菌种可以用于后续的实验操作或保存在冷冻库中。
菌种扩大培养的一般流程包括选择适当的培养基、制备培养基、接种菌种、培养菌种、检测菌种的生长情况和收获菌种等步骤。
通过掌握和熟练操作这一流程，可以有效地扩大菌种数量，并满足后续实验的需要。
6 种子制备及扩大培养
12
3+湿度
制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量和质量 有较大的影响。
相对湿度 （%） 15~19 25~30 40~45 活孢子计数 （亿/支） 1.2 2.3 5.7
斜面外观 上部稀薄、下部稠略黄 上部薄、中部均匀发白 一片白，孢子丰富，稍皱
13
3+湿度
例如土霉素生产菌种龟裂链霉菌，孢子制备时发现：
种子制备及扩大培养
一、定 义
将保存的生产菌种接入试管斜面 活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐 逐级放大培养过程而获得一定数量和 质量的纯种。
1
（一）种子的要求
性能： 活力旺盛、生理形状稳定； 数量： 能满足大容量发酵罐的要求； 无杂菌污染； 保持稳定的生产能力。
2
（二）种子的制备过程
3
1.实验室阶段
9
2.种龄与接种量
种龄需经过多种实验来确定。
嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶， 12小时最好。
10
2.种龄与接种量
大接种量可以缩短发酵罐中菌 丝繁殖的时间，使产物的形成 提前到来，并可减少杂菌的生 长机会。
接种量过大会引起溶氧不足，影响 产物合成；而且会过多移入代谢废 物，也不经济；
过小会延长培养时间，降低发酵罐 的生产率。
(与目的产物的产量有一定关联的)酶活力
21
谷氨酸种子制备举例
2， 一级种子培养 目的：大量繁殖活力强的菌体， 培养基组成应以少含糖分，多含有机氮为主，培养 条件从有利于长菌考虑。 (1) 培养基组成 葡萄糖 2.5％ 尿素 0.5％ 硫酸镁 0.04％ 磷酸氢二钾 0.1％ 玉米浆 2.5~3.5％(按质增减) 硫酸亚铁、硫酸锰 各2ppm PH 7.0
19
确定种子罐级数需注意的问题
6 种子的扩大培养【发酵工程】
不产孢子的镰刀赤霉菌，也可以用大米固体培养基置于 茄子瓶中培养菌丝体用作种子罐种子
C、产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种：
可以用摇瓶液体培养法，孢子接入液体培养基，振荡 培养，获得菌丝体，作为种子。
例如：灰色链霉菌、卡那链霉菌。
D、不产孢子的细菌： 生产上一般采用斜面营养细胞保藏法。 斜面菌种于32C，培养18—24小时，即可移入250 mL
6 种子扩大培养
种子扩大培养概念：
指将保存在砂土管、冷凉干燥管中处休眠状态的生 产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子 耀逐级扩大培养，获得一定数量和质量的纯种过程。
目前发酵灌容积已达几十或几百立方米。如按10 ％的种子计算，就要投入几或几十立方米的种子，要 从试管中的菌种逐级扩大为生产用种子，是一个由实 验室制备到车间生产的过程。其生产方法与条件随不 同的生产品种和菌种种类而异。
MYPG培养基：3克麦芽浸出物，3克酵母浸出物，5克 蛋白胨、10克葡萄糖和20克琼脂于l升水中。
二、生产车间种子制备
种子罐培养原则： 采用易被菌利用的成分，如葡萄糖、玉米桨、磷酸盐
等，同时还需供给足够的无菌空气并不断搅拌，使菌丝体 在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。
接种方法：
孢子悬浮液：一般采用微孔接种法。 摇瓶菌丝体种子：可在火焰保护下接入种子罐或采用压 差法接入。 种子罐之间或发酵罐间的移种：主要采用压差法，由种 子接种管道进行移种，移种过程中要防止接受罐表压降 至零，否则会引起染菌。
1、生长快的细菌，种子用量少，种子罐相应也少。
例如：谷氨酸生产中，茄子瓶种子接入种子罐子 32C培养7一10小时，即可按入发酵罐作为种子，这称为 一级种子罐扩大培养，也称二级发酵。
2、生长较慢的菌种，种子用量大，种子罐相应也多。
C、产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种：
可以用摇瓶液体培养法，孢子接入液体培养基，振荡 培养，获得菌丝体，作为种子。
例如：灰色链霉菌、卡那链霉菌。
D、不产孢子的细菌： 生产上一般采用斜面营养细胞保藏法。 斜面菌种于32C，培养18—24小时，即可移入250 mL
6 种子扩大培养
种子扩大培养概念：
指将保存在砂土管、冷凉干燥管中处休眠状态的生 产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子 耀逐级扩大培养，获得一定数量和质量的纯种过程。
目前发酵灌容积已达几十或几百立方米。如按10 ％的种子计算，就要投入几或几十立方米的种子，要 从试管中的菌种逐级扩大为生产用种子，是一个由实 验室制备到车间生产的过程。其生产方法与条件随不 同的生产品种和菌种种类而异。
MYPG培养基：3克麦芽浸出物，3克酵母浸出物，5克 蛋白胨、10克葡萄糖和20克琼脂于l升水中。
二、生产车间种子制备
种子罐培养原则： 采用易被菌利用的成分，如葡萄糖、玉米桨、磷酸盐
等，同时还需供给足够的无菌空气并不断搅拌，使菌丝体 在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。
接种方法：
孢子悬浮液：一般采用微孔接种法。 摇瓶菌丝体种子：可在火焰保护下接入种子罐或采用压 差法接入。 种子罐之间或发酵罐间的移种：主要采用压差法，由种 子接种管道进行移种，移种过程中要防止接受罐表压降 至零，否则会引起染菌。
1、生长快的细菌，种子用量少，种子罐相应也少。
例如：谷氨酸生产中，茄子瓶种子接入种子罐子 32C培养7一10小时，即可按入发酵罐作为种子，这称为 一级种子罐扩大培养，也称二级发酵。
2、生长较慢的菌种，种子用量大，种子罐相应也多。
种子扩大培养 种子扩大培养的原则
4 种子扩大培养
4.3 种子扩大培养的原则
种子扩大培养的原则
1、种子罐级数的确定
种子罐级数是指制备种子需逐级扩大培养的次数。
取决于：①菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度； ②所采用发酵罐的容积。
为简化工艺和控制，减少染菌机会，种子罐级数越 少越好。但种子级数太少，接种量小，发酵时间延长， 会降低发酵罐的生产效率。虽然种子罐级数随产物的 品种及生产规模而定，但也与所选用工艺条件有关。 如改变种子罐的培养条件，加速孢子发芽及菌体的繁 殖，也可相应地减少种子罐的级数。
种子扩大培养的原则
1、种子罐级数的确定
细菌的生长速度快，种子用量比较少，故种子罐相应也少，采用一级种 子罐扩大培养，也称二级发酵。
即：茄子瓶→种子罐→发酵罐
霉菌的生长较慢，如青霉菌，一般采用二级种子罐扩大培养，为三级发酵。 即：孢子悬浮液→一级种子罐( 27 ℃, 40h孢子发芽，产生菌丝)→二级种子罐
种子扩大培养的原则
2、接种龄
总结：
种龄短：菌体太少； 种龄长：易老化。
原则:
对数生长期末，细胞活力强，菌 体浓度相对较大，但是最终由实 验结果定。
种子扩大培养的原则
3、接种量
定义：
接种量是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。
概述：
接种量的大小取决于生产菌种在发酵罐中的生长繁殖速度。 采用较大的接种量，可以缩短发酵罐中菌体繁殖到达高峰的时间，使产物的形 成提前到来。但是，如果接种量过多，往往使菌丝生长过快，培养液黏度增加，造 成溶解氧供应不足而影响产物合成。而接种量过少，除了延长发酵周期外，往往还 会引起其他不正常情况。 在丝状菌发酵生产中，最适接种量多为7～15%，而细菌发酵中接种量相对较小， 一般为1～2%。总之，对每一个生产菌种，要进行多次试验才能确定其最适接种量。
4.3 种子扩大培养的原则
种子扩大培养的原则
1、种子罐级数的确定
种子罐级数是指制备种子需逐级扩大培养的次数。
取决于：①菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度； ②所采用发酵罐的容积。
为简化工艺和控制，减少染菌机会，种子罐级数越 少越好。但种子级数太少，接种量小，发酵时间延长， 会降低发酵罐的生产效率。虽然种子罐级数随产物的 品种及生产规模而定，但也与所选用工艺条件有关。 如改变种子罐的培养条件，加速孢子发芽及菌体的繁 殖，也可相应地减少种子罐的级数。
种子扩大培养的原则
1、种子罐级数的确定
细菌的生长速度快，种子用量比较少，故种子罐相应也少，采用一级种 子罐扩大培养，也称二级发酵。
即：茄子瓶→种子罐→发酵罐
霉菌的生长较慢，如青霉菌，一般采用二级种子罐扩大培养，为三级发酵。 即：孢子悬浮液→一级种子罐( 27 ℃, 40h孢子发芽，产生菌丝)→二级种子罐
种子扩大培养的原则
2、接种龄
总结：
种龄短：菌体太少； 种龄长：易老化。
原则:
对数生长期末，细胞活力强，菌 体浓度相对较大，但是最终由实 验结果定。
种子扩大培养的原则
3、接种量
定义：
接种量是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。
概述：
接种量的大小取决于生产菌种在发酵罐中的生长繁殖速度。 采用较大的接种量，可以缩短发酵罐中菌体繁殖到达高峰的时间，使产物的形 成提前到来。但是，如果接种量过多，往往使菌丝生长过快，培养液黏度增加，造 成溶解氧供应不足而影响产物合成。而接种量过少，除了延长发酵周期外，往往还 会引起其他不正常情况。 在丝状菌发酵生产中，最适接种量多为7～15%，而细菌发酵中接种量相对较小， 一般为1～2%。总之，对每一个生产菌种，要进行多次试验才能确定其最适接种量。
发酵工程 5 种子制备
种子扩大培养应根据菌种的生理特性，选
择合适的培养条件来获得代谢旺盛、数量足
够的种子。
优良的种子可以缩短生产周期、稳定产量、 提高发酵效率和设备利用率。
1、菌种的扩大培养的目的
接种量的需要；
菌种的驯化；
缩短发酵时间，提高发酵罐的利用率，以及减
少染菌。
2、作为种子必须具备的条件
1）生命力旺盛，移至发酵罐后能迅速生长，
峰的时间，但接种量过多往往使菌丝生长过快，
培养液粘度增加造成溶解氧供应不足而影响产物
的合成。
6、影响种子质量的因素
1）种子培养基原材料质量：不同产地、不同批 次的麸皮、大（小）米、琼脂等。 2）培养条件：温度、湿度、通气量、搅拌强度、
pH、泡沫等。
3）斜面冷藏时间：斜面冷藏对孢子质量的影响
与孢子成熟程度有关，冷藏时间对孢子的生产
生产过程中通常测定的参数有： 1）检测种子液的pH是否在种子的要求范围内；
2）检测种子液中的糖、氨基氮、磷酸盐的含量；
3）检查种子液中的菌丝形态、菌丝浓度和培养液外
观（色泽、气味、浑浊度、颗粒等）；
4）检查有无杂菌污染；
5）其他参数，如接种前某些酶的活力、种子罐的溶
氧和尾气（CO2、O2）等。
4、种子制备的流程
8、种子异常分析
1）菌种生长发育缓慢或过快
这与孢子质量及种子罐的培养条件有关，一般情
况下，通入种子罐的无菌空气温度低、培养基灭 菌质量差是种子生长、代谢缓慢的主要原因。 2）菌丝结团
菌丝在液体培养条件下成团或菌球。这会影响菌
丝的呼吸及对营养物质的吸收。这与通气搅拌相 关，加入某些表面活性剂如吐温80可促进菌丝 分散。
能力也有影响，通常冷藏时间越长，生产能力 下降越多。
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可重复使用的多孔材 料，严格控制营养条 件，结束后挤压培养 液抽提产物 将营养生长期与生产 期分开，分别控制不 同条件 兼具固体培养法与液体 可培养霉菌、 培养法的优点 酵母、放线菌 等 工艺可达到最优 过程繁琐 氨基酸生产
两步法 液体深 层培养
2.2 影响种子质量的因素
• • • • • • • • 培养基 秧龄与接种量 温度 pH值 通气与搅拌 泡沫 染菌的控制 种子罐级数
2 种子扩大培养
种子：将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产 菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐 级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯 种培养物称为种子。
种子扩培的目的
接种量的需要 菌种的驯化 缩短发酵时间、保证生产水平
种子的要求：
总量及浓度能满足要求
(2) 对这一特定菌种的遗传生化的认识程度 (3) 经济费用
• 如果对特定菌种的基本性状及其工艺知晓甚少，则多半采用随机
• 如果对其遗传及生物化学方面的性状已有较深的认识，则可选择
一些常用工业微生物
抗生素生产有关的微生物
放线菌（链霉素四 环素；红霉素等） 真菌（青霉素、头孢等）
一些产芽孢的细菌 植物或动物来源
4．混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70℃超低温冰箱
超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1-2℃／min。一些
• 传代保藏：斜面培养基，平行传代，普通冰箱，三个月 • 载体保藏：麦壳，砂土灭菌后可用作载体
• 矿物油保藏：将琼脂斜面或液体培养物浸入矿物油中于
防止菌种衰退
• • • •
衰退的表现：生长，代谢（产品） 衰退的原因：保藏不妥，不利环境，回复突变等 防止衰退的方法：合理培养条件，减少传代次数 复壮：分离单细胞，抗性筛选，苛刻条件
第一章 菌种与种子扩大培养
1 微生物工业用菌 2 种子扩大培养
2.1 工业微生物的培养方法 2.2 影响种子质量的因素 2.3 种子扩培的实例
1 工业微生物
• 菌种的来源 自然界中有目的微生物分离的原则 菌种选育、分子育种 工业微生物的要求 常用工业微生物 菌种保藏
• • •
菌种来源
从自然界分离：目前土壤中已分离的微生物不到总数
种子的质量要求：
• • • • 一定的浓度 形态 （生长处于某个阶段、均匀等等） 理化指标：C、N、P的含量，pH，酶活等 无污染
2.3 种子扩大培养举例
例一、谷氨酸生产的种子制备
斜面菌种
→一级种子培养
→二级种子培养
→发酵
1、斜面 (AS1.299)
培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.5 琼脂 2%， pH 7.0-7.2
工业微生物的要求
能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成
产物 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的 可操作性要强 遗传性能要相对稳定
不易感染它种微生物或噬菌体 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病
菌无关） 生产特性要符合工艺要求
工业微生物菌种保藏技术
2.1 工业微生物培养方法
静置培养法：嫌气发酵，如酒精、丙酮、丁醇、乳酸等 固体 深层 通气培养法 液体 固体 液体
浅层
工业微生物常见培养方法及其特点
解释 固体培 养 即曲法培养，源于传 统制曲技术 特点 酶活力高 可调温湿度 适用范围 酿造业
液体深 层培养
载体培 养
液体培养，深层通风 可调节各种环境因素： 几乎所有好气 营养物浓度，温湿度等； 发酵：如有机 无菌操作要求高 酸、氨基酸等
(1) 低温冷冻保藏； (2) 转接培养或斜面传代保藏；
(3) 矿物油保藏；
(4) 土壤或陶瓷珠等载体干燥保藏。 保藏原理：创造休眠环境 保藏要求：保持菌种优良特性，经济方便
保藏后需再次检测和确定保藏菌种的形态学和生化
冷冻保藏：-20℃以下冷冻，使微生物代谢活动停止
分类：普通冷冻保藏(-20℃) 超低温冷冻保藏(-60一-80℃) 液氮冷冻保藏 冻干保藏 特点：简单有效 培养物运输较困难
生理状况稳定，个体与群体
活力强，移种至发酵后，能够迅速生长
无杂菌污染
种子扩培的两个阶段
实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等 实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室 完成，因此将其称为实验室阶段的种子培养。 培养基：保证培养基的质量，有利于菌体的生长 减少传代次数 孢子培养时注意湿度，子斜面使用一般不超过1个月 生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工厂归发 酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。 培养基：控制成本，驯化；营养比发酵培养基丰富。
培养条件：32℃，生长18-24小时
培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细 生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过 3次
2. 一级种子（摇瓶）
培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5%， K2HPO4 0.1%
氨基酸生产有关的微生物
氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚， 代谢途径比较简单
谷氨酸发酵的菌种： 棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小 杆菌属的棒型细菌 其它氨基酸生产菌： 常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌 选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯 草芽孢杆菌
食品工业微生物
试验，目前已同意 使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。 α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌 和地衣牙孢杆菌
的1%，微生物的多样性仍然是以后若干年的研究重点；
诱变育种：诱变是工业发酵稳产高产的重要保证； 基因重组：基因定向改造技术大大加快了生物产品开
发的进程。
从自然界中分离菌种的一般过程
采样 → 预处理 → 培养 → 菌落的选择 → 产品的鉴定
选择育种方法时综合考虑的因素
(1) 待改良性状的本质及与发酵工艺的关系
冻干保藏：是通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水
特点： • 冻干状态下一般可保藏10年不丧失活力 • 冻干后的菌株可常温保存，便于运输 • 必须使用冷冻保护剂，常用脱脂乳、蔗糖等
在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是：
1．离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞
2．用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞； 3．加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜；
两步法 液体深 层培养
2.2 影响种子质量的因素
• • • • • • • • 培养基 秧龄与接种量 温度 pH值 通气与搅拌 泡沫 染菌的控制 种子罐级数
2 种子扩大培养
种子：将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产 菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐 级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯 种培养物称为种子。
种子扩培的目的
接种量的需要 菌种的驯化 缩短发酵时间、保证生产水平
种子的要求：
总量及浓度能满足要求
(2) 对这一特定菌种的遗传生化的认识程度 (3) 经济费用
• 如果对特定菌种的基本性状及其工艺知晓甚少，则多半采用随机
• 如果对其遗传及生物化学方面的性状已有较深的认识，则可选择
一些常用工业微生物
抗生素生产有关的微生物
放线菌（链霉素四 环素；红霉素等） 真菌（青霉素、头孢等）
一些产芽孢的细菌 植物或动物来源
4．混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70℃超低温冰箱
超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1-2℃／min。一些
• 传代保藏：斜面培养基，平行传代，普通冰箱，三个月 • 载体保藏：麦壳，砂土灭菌后可用作载体
• 矿物油保藏：将琼脂斜面或液体培养物浸入矿物油中于
防止菌种衰退
• • • •
衰退的表现：生长，代谢（产品） 衰退的原因：保藏不妥，不利环境，回复突变等 防止衰退的方法：合理培养条件，减少传代次数 复壮：分离单细胞，抗性筛选，苛刻条件
第一章 菌种与种子扩大培养
1 微生物工业用菌 2 种子扩大培养
2.1 工业微生物的培养方法 2.2 影响种子质量的因素 2.3 种子扩培的实例
1 工业微生物
• 菌种的来源 自然界中有目的微生物分离的原则 菌种选育、分子育种 工业微生物的要求 常用工业微生物 菌种保藏
• • •
菌种来源
从自然界分离：目前土壤中已分离的微生物不到总数
种子的质量要求：
• • • • 一定的浓度 形态 （生长处于某个阶段、均匀等等） 理化指标：C、N、P的含量，pH，酶活等 无污染
2.3 种子扩大培养举例
例一、谷氨酸生产的种子制备
斜面菌种
→一级种子培养
→二级种子培养
→发酵
1、斜面 (AS1.299)
培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.5 琼脂 2%， pH 7.0-7.2
工业微生物的要求
能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成
产物 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的 可操作性要强 遗传性能要相对稳定
不易感染它种微生物或噬菌体 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病
菌无关） 生产特性要符合工艺要求
工业微生物菌种保藏技术
2.1 工业微生物培养方法
静置培养法：嫌气发酵，如酒精、丙酮、丁醇、乳酸等 固体 深层 通气培养法 液体 固体 液体
浅层
工业微生物常见培养方法及其特点
解释 固体培 养 即曲法培养，源于传 统制曲技术 特点 酶活力高 可调温湿度 适用范围 酿造业
液体深 层培养
载体培 养
液体培养，深层通风 可调节各种环境因素： 几乎所有好气 营养物浓度，温湿度等； 发酵：如有机 无菌操作要求高 酸、氨基酸等
(1) 低温冷冻保藏； (2) 转接培养或斜面传代保藏；
(3) 矿物油保藏；
(4) 土壤或陶瓷珠等载体干燥保藏。 保藏原理：创造休眠环境 保藏要求：保持菌种优良特性，经济方便
保藏后需再次检测和确定保藏菌种的形态学和生化
冷冻保藏：-20℃以下冷冻，使微生物代谢活动停止
分类：普通冷冻保藏(-20℃) 超低温冷冻保藏(-60一-80℃) 液氮冷冻保藏 冻干保藏 特点：简单有效 培养物运输较困难
生理状况稳定，个体与群体
活力强，移种至发酵后，能够迅速生长
无杂菌污染
种子扩培的两个阶段
实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等 实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室 完成，因此将其称为实验室阶段的种子培养。 培养基：保证培养基的质量，有利于菌体的生长 减少传代次数 孢子培养时注意湿度，子斜面使用一般不超过1个月 生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工厂归发 酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。 培养基：控制成本，驯化；营养比发酵培养基丰富。
培养条件：32℃，生长18-24小时
培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细 生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过 3次
2. 一级种子（摇瓶）
培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5%， K2HPO4 0.1%
氨基酸生产有关的微生物
氨基酸生产菌的要求：代谢途径比较清楚， 代谢途径比较简单
谷氨酸发酵的菌种： 棒杆菌属，短杆菌属、节杆菌属或小 杆菌属的棒型细菌 其它氨基酸生产菌： 常规菌种一般也是以谷氨酸生产菌 选育而成；工程菌，大肠杆菌，枯 草芽孢杆菌
食品工业微生物
试验，目前已同意 使用的仅仅少数微生物能用于生产食品用酶。 α—淀粉酶：黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌 和地衣牙孢杆菌
的1%，微生物的多样性仍然是以后若干年的研究重点；
诱变育种：诱变是工业发酵稳产高产的重要保证； 基因重组：基因定向改造技术大大加快了生物产品开
发的进程。
从自然界中分离菌种的一般过程
采样 → 预处理 → 培养 → 菌落的选择 → 产品的鉴定
选择育种方法时综合考虑的因素
(1) 待改良性状的本质及与发酵工艺的关系
冻干保藏：是通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水
特点： • 冻干状态下一般可保藏10年不丧失活力 • 冻干后的菌株可常温保存，便于运输 • 必须使用冷冻保护剂，常用脱脂乳、蔗糖等
在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是：
1．离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞
2．用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞； 3．加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜；