菌种与种子扩大培养
菌种与种子扩大培养
菌种与种子扩大培养2008-05-11 15:12:43| 分类：默认分类阅读337 评论0 字号：大中小订阅1.1 微生物工业用菌种1.1.1 发酵工业对生产菌种的要求1)能在易得、价廉的原料制成的培养基上迅速生长，且代谢产物产量高（目标产物的产量尽可能接近理论转化率）。
目标产物最好能分泌到胞外，以降低产物抑制并利于产物分离。
2)发酵条件粗放、易于控制，且所需的酶活性高。
3)菌种生长和发酵速度较快，发酵周期短。
发酵周期短的优点在于感染杂菌的机会减少；提高设备的利用率。
4)根据代谢控制的要求，选择单产高的营养缺陷型突变菌株（微生物菌种缺少或丧失了合成某种或多种必需生长因子的能力）或调节突变菌株或野生菌株。
5)抗杂菌、抗噬菌体能力强。
6)菌种纯粹，遗传性状稳定（不易变异退化），以保证发酵生产和产品质量的稳定性。
菌种退化，生产性能下降是生产中常碰到的问题。
7)菌体不是病源菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素（包括抗生素、激素和毒素等），以保证安全。
使用新菌种时更应注意；应用食品领域更需经严格鉴定，如早期酱油生产采用黄曲霉，现已停止。
1.1.2 工业上常用的微生物微生物的共同特性1)个体小、构造简单；2)容易培养、易于代谢；3)生长旺盛、繁殖迅速；4)适应性强、容易变异；5)分布广泛、种类繁多工业上常用的微生物发酵工业上常用的微生物有细菌、酵母菌、霉菌和放线菌四大类群。
要求复习微生物知识，掌握工业上常用微生物的基本形态。
此处介绍其中具有工业价值的主要微生物。
细菌细菌是自然界中分布最广、数量最多、与人类关系最为密切的一类微生物，也是发酵工业上使用最多的一种单细胞生物。
细菌的一般结构包括细胞壁、细胞膜、细胞质、核质体及内含物几部分；特殊结构是某些细菌所特有的，如荚膜、鞭毛、芽胞等，它们在细菌的分类鉴定中有重要的意义。
发酵工业上常用的细菌大多是杆菌，如枯草芽孢杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、乳酸杆菌、梭状芽孢杆菌大肠杆菌等。
微生物菌种的扩大培养技术
微生物菌种的扩大培养技术菌种的扩大培养是发酵生产的第一道工序，该工序又称之为种子制备。
种子制备不仅要使菌体数量增加，更重要的是，经过种子制备培养出具有高质量的生产种子供发酵生产使用。
因此，如何提供发酵产量高、生产性能稳定、数量足够而且不被其他杂菌污染的生产菌种，是种子制备工艺的关键。
种子扩大培养的任务工业生产规模越大，每次发酵所需的种子就越多。
要使小小的微生物在几十小时的较短时间内，完成如此巨大的发酵转化任务，那就必须具备数量巨大的微生物细胞才行。
菌种扩大培养的目的就是要为每次发酵罐的投料提供相当数量的代谢旺盛的种子。
因为发酵时间的长短和接种量的大小有关，接种量大，发酵时间则短。
将较多数量的成熟菌体接入发酵罐中，就有利于缩短发酵时间，提高发酵罐的利用率，并且也有利于减少染菌的机会。
因此，种子扩大培养的任务，不但要得到纯而壮的菌体，而且还要获得活力旺盛的、接种数量足够的菌体。
对于不同产品的发酵过程来说，必须根据菌种生长繁殖速度快慢决定种子扩大培养的级数，抗生素生产中，放线菌的细胞生长繁殖较慢，常常采用三级种子扩大培养。
一般50 t发酵罐多采用三级发酵，有的甚至采用四级发酵，如链霉素生产。
有些酶制剂发酵生产也采用三级发酵。
而谷氨酸及其他氨基酸的发酵所采用的菌种是细菌，生长繁殖速度很快，一般采用二级发酵。
种子制备的过程细菌、酵母菌的种子制备就是一个细胞数量增加的过程。
细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方，牛肉膏、蛋白胨常用作有机氮源。
细菌培养温度大多数为37 ℃，少数为28 ℃，细菌菌体培养时间一般1～2天，产芽孢的细菌则需培养5～10天。
霉菌、放线菌的种子制备一般包括两个过程，即在固体培养基上生产大量孢子的孢子制备和在液体培养基中生产大量菌丝的种子制备过程。
⒈ 孢子制备孢子制备是种子制备的开始，是发酵生产的一个重要环节。
孢子的质量、数量对以后菌丝的生长、繁殖和发酵产量都有明显的影响。
不同菌种的孢子制备工艺有其不同的特点。
菌种保藏及种子扩大培养
2. 菌种性能的改变
(1) 菌种的外在特征改变
异核现象导致微生物群体发 生变异
自发突变导致菌种遗传性 能改变
回复突变 降低(衰；2退代) 菌谢菌株能种的力特降的点低生：；个发理体酵状或周况群期体延改特长变征；发抗生不变良化环；境生能产力能降力低。
2020/5/28
3 . 防止菌种衰退的措施
2020/5/28
Байду номын сангаас
一、 种子扩大培养阶段
A： 实验室种子的制备： e.g 产黄青霉菌(P.chrysogonum)
原始菌种
斜面试管
250ml 茄子瓶（大米或小米） 25 ~28°C ，4~14天
成熟
（在真空下抽去水分，使水分含量在10%以下，于4 °C冰箱保存）
2020/5/28
e.g. （ Glutamic acid-producer ）
2020/5/28
复壮的措施
• 通过分离达到复壮 在琼脂平板划线、涂布或与琼脂培养基混 合培养再分离，达到—菌落纯 采用单细胞或单孢子分离法达到—细胞纯
• 通过寄主体达到复壮 将菌株接种到寄主细胞进行繁殖达到复壮 。
•202淘0/5/2汰8 已衰退的个体达到复壮
三、菌种保藏（strain preservation）
保藏应注意的问题：
菌体状态：休眠体
基质：营养贫乏
操作过程：不应对细胞造成伤害
2020/5/28
国内外菌种保藏机构
• 中国微生物菌种保藏管理委员会（CCCCM ）
1979年成立，下设6个菌种保藏管理中心 CCGMC 普通微生物菌种保藏管理中心 ACCC 中国农业微生物菌种保藏管理中心 CICC 工业微生物菌种保藏管理中心 CMCC 医学微生物菌种保藏管理中心 CACC 抗菌素菌种保藏管理中心 CVCC 2020/5/28 兽医微生物菌种保藏管理中心
微生物工业菌种的扩大培养
微生物工业菌种的扩大培养微生物工业菌种的扩大培养来源：青岛海博菌种的扩大培养就是把保藏的菌种，即砂土管，冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化，再经过扁瓶或药瓶和种子罐，逐级扩大培养后达到一定的数量和质量的纯种培养过程。
这些纯种的培养物称为种子。
作为生产用的种子，必须具备如下的条件：①菌种细胞的生长活力强，接种后在发酵罐中能迅速生长；②生理性状稳定；③菌体总量和浓度能满足大容量发酵罐的要求；④无杂菌污染（不带杂菌）；⑤生产能力稳定。
一、种子的制备过程种子制备的过程大致可分为实验室种子制备阶段和生产车间种子制备阶段。
实验室种子制备阶段是指琼脂斜面至固体培养基扩大培养（如茄子瓶斜面培养）或液体摇瓶培养；生产车间种子制备阶段是种子罐扩大培养。
（一）、实验室种子的制备实验室种子的制备一般采用两种方式：固体孢子培养法和液体种子培养法。
对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作简便，不易污染杂菌；对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用液体培养法。
１、孢子的制备（1）细菌的制备细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方，培养温度一般为37?C。
细菌菌体培养时间一般为1~2天，产芽孢的细菌培养则需要5~10天。
（2）霉菌孢子的制备霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基，培养的温度一般为25~28?C，培养时间一般为4~14天。
（3）放线菌孢子的制备放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等，培养温度一般为28?C，培养时间为5~14天。
２、液体种子制备（1）好氧培养：对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用摇瓶液体培养法。
将孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇瓶机上恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子。
试管→三角瓶→摇床→种子罐。
一菌种与种子扩大培养
奥尔兰醋杆菌 啤酒、醋酸
氧化醋杆菌 酒类
巴氏醋杆菌 醋酸、山梨糖
恶臭醋杆菌 醋、山梨糖、二羟基丙酮
弱氧化醋杆菌 5-酮基葡糖酸、丙酮酸、山梨糖
拟胶醋杆菌 丙酮酸、山梨糖、纤维素
大肠杆菌
赖氨酸、苏氨酸、精氨酸、色氨酸、酪 氨酸、
天冬氨酸、高丝氨酸、谷氨酸脱羧酶、 酰胺酶、
天冬酰氨酶、丙酮酸、酮戊二酸，腺苷 酸、大肠菌素
简便
沙土保藏法 冷冻干燥法
干燥、无营养 产孢子微生物
1~10年
干燥、无氧、低 温、有保护剂
各大类
5~15年以上
简便有效 设备
划线培养后的细菌菌落
酿酒酵母
霉菌孢子
国内外菌种保藏机构：
菌种保藏机构的任务：广泛收集科研和生产菌种、
菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不衰、 不乱以及便于研究、交换和使用的目的。
一菌种与种子扩大培养
从微生物分类学的角度，分为：
细菌类：
短杆菌：氨基酸发酵（谷氨酸）
枯草芽孢杆菌：淀粉酶（BF7658）、碱性蛋白
酶等
地衣芽孢杆菌：耐高温α-淀粉酶)
苏云金芽孢杆菌：BT生物农药
梭状芽孢杆菌：丙酮、丁酸等发酵
酵母菌：
啤酒酵母：酿酒酵母、辅酶类物质的发酵
酒精酵母：酒精
汉逊酵母：食品工业，用于乙酸乙酯的发酵
属名 诺卡氏菌属 拟无枝酸菌属 分枝杆菌属
工业常用的微生物：放线菌
种名 珊瑚色诺卡氏菌 小球诺卡氏菌 鼠白诺卡氏菌 暗色诺卡氏菌 石蜡诺卡氏菌 嗜石油诺卡氏菌 东方诺卡氏菌 地中海拟无枝酸菌 黄色分枝杆菌 甲烷分枝扦菌 石蜡分枝杆菌
耻垢分技杆菌 结核分核杆菌
用
途
正烷烃→2，2-二甲基粘康酸
生物工业菌种与种子的扩大培养
II. 划线分离法
斜线法 曲线法 方格法 放射法 四格法
产品鉴定及筛选
从两个角度出发：产物角度、形态角度 I. 从产物角度出发
也就是在培养时以产物的形成来有目的的设计 培养基。 例：醛肟水解酶的筛选
在培养基中加入0.05%的Z-PAOx，每隔2-3天移去 一半培养物，补充新鲜培养基，不断分析样品。
第二节 工业微生物菌种的选育与改良
一、工业微生物菌种的选育
4. 诱变育种 正突变 对生产有利的突变称为正突变。
突变方向 负突变 造成菌株衰退及生产质量下降 的突变称为负突变。
菌株发生正突变的概率低。 诱变育种的关键： ①以合适的诱变剂处理大量而均匀分散的微生物细
胞悬浮液，使个别存活的个体中DNA碱基变异频 率大幅提高；
(b) 预处理：1g土样溶于99ml去离子水中，振荡均匀， 过滤，得菌悬液
(c) 增殖培养： 经80℃，30分钟预处理
第二节 工业微生物菌种的选育与改良
一、工业微生物菌种的选育
实例：碱性纤维素酶产生菌的筛选 自然选育过程： (d) 分离纯化：固体分离培养基采用CMC为唯一碳源
，pH 10.5条件下涂布培养3-4天 (e)鉴定筛选：选择有凹陷圈的菌落，而且越大越
诱变
2. 诱变机理 这种变化包括：DNA链的断裂，DNA分子内和分子 间的交联形成嘧啶二聚体。
诱变
3. 诱变仪器 265nm的紫外光，对应于功率为15W的紫外灯
4. 诱变操作 (1) 将10ml菌悬液放在直径为9cm的培养皿中，液 层厚度约为2mm，启动磁力搅拌器；
(2) 使用15W的紫外灯管，照射距离为30cm左右， 照射时间以几秒至数十分钟为宜，具芽孢的菌株 需处理10min左右。
菌种与种子扩大培养
决定发酵工业生产水平三要素：
生产菌种性能； 发酵过程的工艺及设备； 产物提取过程的工艺及设备
一、工业微生物
从自然界分离：目前土壤中已分离的微生物约为自然 界总数的1-5%，微生物的多样性仍然是以后若干年的研 究重点； 诱变育种：诱变是工业发酵稳产高产的重要保证； 基因重组：基因定向改造技术大大加快了生物产品 开 发的进程。
•
红链霉菌（红霉素）
•
红小单胞菌（庆大霉素）
•
委内瑞拉链霉菌（氯霉素）
•
卡那链霉菌（卡那霉素）
3 单细胞真菌 ---- 酵母(Yeast)
• 形状和大小：单细胞，卵圆形，圆形或圆柱形；比细菌大， 直径约1～5微米，长约5～30微米。
• 生长与繁殖：酵母分有性和无性繁殖，以无性繁殖为主。无 性繁殖分为芽殖和裂殖，以芽殖为主。
止菌种衰退
纯菌种
自发突变
传代增殖
不纯菌种
突变个体
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原始个体
工业微生物菌种保藏技术
几种常用菌种保藏方法的比较
方法名称
主要措施 适宜菌种 保藏期 评价
冰箱保藏法（斜面） 冰箱保藏法（半固体）
石蜡油封藏法* 沙土保藏法
低温 低温 低温、缺氧 干燥、无营养
各大类 细菌、酵母菌
各大类** 产孢子微生物
从自然界中分离菌种的一般过程
分离思路 • 新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照
生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法， 快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。
• 实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必 须重新进行分离纯化。
新种分离与筛选的步骤
• 定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生 长培养特性。
生物工业菌种与种子的扩大培养
第四章生物工业菌种与种子的扩大培养第一节工业微生物菌种的衰退、复壮与保藏一、微生物菌种的衰退⒈ 菌种衰退的原因菌种衰退的原因有两个方面：一是菌种保藏不妥；二是菌种生长的条件要求没有得到满足，或是遇到不利的条件，或是失去某些需要的条件。
此外还有经诱变得来的新菌株发生回复突变，从而丧失新的特征等情况。
菌种连续传代是菌种发生衰退的直接原因。
由于连续传代使菌种经常处于旺盛的生长状态，且每次传代时营养和环境等培养条件都是在不断地变化，与处于休眠状态的菌种相比，细胞的自发突变率要高得多。
因此，菌株经过连续传代后，含突变基因的个体在数量上逐渐占优势，退化现象就逐渐显露出来。
⒉ 菌种性能的改变⑴ 菌种遗传特性的改变从菌种遗传机理这一微观角度来看，菌种遗传特性的改变主要有如下三个原因。
① 异核现象导致微生物群体发生变异。
② 自发突变导致菌种遗传特性改变。
③ 突变所产生的变种或杂交重组所形成的杂种往往不稳定，容易发生回复突变或产生分离子，以致在菌种这一群体中形成具有不同基因型（亦称遗传型）的个体。
⑵ 菌种生理状况的改变⒊ 防止菌种衰退的措施⑴ 菌种的分离⑵ 菌种的复壮狭义的复壮指的是菌种已经发生衰退后，再通过纯种分离和性能测定等方法，从衰退的群体中找出尚未衰退的少数个体，以达到恢复该菌种原有典型性状的一种措施。
而广义的复壮应该是一种积极的措施，即在菌种的生产性能尚未衰退前就经常有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，使菌种的生产性能逐步提高，所以，这实际上是一种利用自发突变(正突变)从生产中不断进行选种的工作。
⑶ 提供良好的环境条件⑷ 用优良的保藏方法⑸ 定期纯化菌种二、菌种的复壮⑴ 纯种分离⑵ 通过寄主体进行复壮⑶ 淘汰已衰退的个体三、菌种的保藏⒈ 菌种保藏的原理⒉ 菌种保藏方法⑴ 斜面低温保藏法⑵ 液体石蜡封存保藏法⑶ 固体曲保藏法⑷ 砂土管保藏法⑸ 冷冻干燥法⑹ 液氮超低温保藏法⒊ 菌种保藏的注意事项⑴ 菌种在保藏前所处的状态⑵ 菌种保藏所用的基质⑶ 操作过程对细胞结构的损害第二节工业微生物菌种的选育一、自然选育自然选育包括从自然界分离获得菌株和根据菌种的自发突变进行筛选而获得菌种。
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• 复筛过程中，要结合培养条件进行。 培养条件包括：培养基 pH值 发酵温度 供氧量等。
菌种与种子扩大培养
（5）菌种鉴定
❖ 经典分类鉴定方法：形态特征、生理生化特 征、血清学试验等。
❖ 现代分类鉴定方法：遗传特性、细胞化学组 分、计算机数值分析。
菌种与种子扩大培养
2、菌种保藏的原理
➢ 菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点人工创造 条件使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减 少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低 水平缺氧状态，干燥和低温，使菌种处于“体眠”状 态，抑制其繁殖能力。
➢ 一种好的保藏方法首先应能长期保持菌种原有的优 良性状不变，同时还需考虑到方法本身的简便和经 济，以便生产上能推广使用。
线菌少；在植物残体枯枝落叶下的土壤中较多含有拮抗
性真菌。
❖ 离地面5~20cm处的土壤通气良好、不受阳光直射，含
菌量最高。
❖ 采土季节以春秋两季最好。
❖ 采土方法：选择适当地点、铲除表土、取土样数十克，
盛入事先准备的无菌防水纸袋中，其上记录采土时间、
地点、植被情况等。
❖ 多点采土、混合分离，可以代表每一地块上的微生物分
一厘米，然后保存在冰箱中。此法可通用于不能利用石蜡油作碳源的细菌、 霉菌、酵母等微生物的保存。保存期约一年左右。
菌种与种子扩大培养
C 沙土管保藏法（细菌，霉菌，防线菌 ）
第二章 菌种与种子扩大培养
菌种与种子扩大培养
本章讲述内容
❖ 第一节 微生物工业用菌种 ❖ 第二节 种子扩大培养
菌种与种子扩大培养
第一节 微生物工业用菌种
一、菌种的分离筛选 1、菌种的来源 ❖ 根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂
或菌种保藏部门索取或购买； ❖ 从大自然中分离筛选新的微生物菌种。
菌种与种子扩大培养
2、分离思路
❖ 新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照 生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法， 快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。
❖ 实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必 须重新进行分离纯化。
❖ 有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合 理先进的设备与之配合。
菌种与种子扩大培养
注意：必须要做多个浓度的稀释分离平板。
菌种与种子扩大培养
• 划线分离法——平板划线法
菌种与种子扩大培养
（4）筛 选
分初筛复筛。
Ⅰ、初筛：从分离得到的大量微生物中，将目标微生物 筛选出来的过程。
一般采用平板筛选。
常用的初选方法：
• 水解酶产生菌的筛选： 将酶的作用底物加在培 养基中，接种后适温培 养，根据菌苔周围是否 产生水解圈筛选出水解 酶产生菌。
二、菌种的保藏与复壮
（一）菌种的保藏 1、菌种保藏的意义
菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料， 特别是利用微生物进行有关生产如抗生素、氨基酸、 酿造等工业，更离不开菌种。所以菌种保藏是进行 微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。 其任务首先是使菌种不致死亡，同时还要尽可能设 法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转 化。
菌种与种子扩大培养
（3）培养分离
❖ 尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物 的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这— 步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用， 而且控制得细一点，好一点。纯种分离的方法有划 线分离法、稀释分离法。
菌种与种子扩大培养
• 稀释倒 平板法
稀释分离法
• 平板 涂布法
菌种与种子扩大培养
3、菌种保藏的方法
菌种保藏的方法很多，一般有下面几种： A 斜面冰箱保藏法（酵母）
斜面保藏是一种短期、过渡的保藏方法，用新鲜斜面接种后，置最适条 件下培养到菌体或孢子生长丰满后，放在4℃冰箱保存。一般保存期为三个 月到六个月。
B 石蜡油封存法（酵母） 向培养成熟的菌种斜面上，倒入一层灭过菌的石蜡油，用量要高出斜面
3、新种分离与筛选的步骤
❖ 定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特 性。
❖ 采样：有针对性地采集样品。 ❖ 增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖
培养后，在数量上占优势。 ❖ 分离筛选：采用选择性培养基利用分离技术得到纯种目
的菌。 ❖ 发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、
培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品 品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最 适pH值、提取工艺等。
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（1）采样
❖ 采样对象：以采集土壤为主。 ❖ 采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为
好。
菌种与种子扩大培养
采取土壤样品要考虑的几个问题
❖ 土质肥，微生物含量高，特别肥沃的土壤中细菌多，放
布平均情况
菌种与种子扩大培养
（2）增殖培养
❖ 含有目的菌较多的土样不需要富集培养 ❖ 如果原有样品中目的菌含量低，可以人为地添加相应的
基质，培养使之以较其它微生物更快的速度生长繁殖， 从而提高它们在样品中的比例，便于分离。 ❖ 富集培养的一般方法：采用有利于目的菌种而不利于无 关微生物的营养和培养条件，以达到使目的菌种在群体 中比例上升的目的。 ❖ 例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或 者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这 一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可 能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。 ❖ 一些有特定物质产生能力的菌种，不容易富集，只有通 过大量艰苦的工作筛选取得。
• 拮抗菌的筛选—对峙培养： 将病原指示菌与待测菌株 相对接种在平板上适温培 养，根据病原菌的生长情 况筛选出拮抗性菌株。
菌种与种子扩大培养
菌种与种子扩大培养
2）摇瓶发酵筛选：将待测菌株进行液体振荡培养，取 发酵滤液进行活力测定。
菌种与种子扩大培养
Ⅱ、复筛：在初筛的基础上，进一步鉴定有希望菌株的 生产能力强弱的过程。
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（6）毒性试验
❖ 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将 其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有 关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中 除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆 菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食 用，均需通过两年以上的毒性试验。
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