学习手册-大肠菌群数测定(精)
微生物综合实验水中细菌总数和大肠菌群的测定(精)
微生物综合实验：水中细菌总数和大肠菌群的测定一实验目的1、学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法。
2、了解水源水的平板菌落计数的原则。
3、学习检测水中大肠菌群的方法，了解大肠菌群数量与水质状况的关系。
二、实验原理水中细菌总数可作为判定被检水样被有机物污染程度的标志。
本实验应用平板计数技术测定水中细菌总数。
由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。
目前一般是采用普通肉膏蛋白胨琼脂培养基。
我国规定1ml自来水中细菌总数不得超过100个。
大肠菌群是一群需氧或兼性厌氧的、在37℃培养24~28h能发酵乳糖产酸与产气的革兰氏阴性无芽孢杆菌，它们普遍存在于肠道中，且具有数量多，与多数肠道病原菌存活期相近，易于培养和观察等特点。
大肠菌群数是指每升水中含有的大肠菌群的近似值。
大肠菌群的检测方法有多管发酵法和滤膜法两种。
本实验采用多管发酵法，它被称为水的标准分析法，即将一定量的样品接种乳糖发酵管，根据发酵反应的结果，确证大肠菌群的阳性管数后在检索表中查出大肠菌群的近似值。
我国规定：每升自来水中大肠菌群数不得超过3个。
三、实验材料和用具：1、培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，乳糖蛋白胨培养基，三倍浓度浓缩乳糖蛋白胨培养基，伊红美兰培养基（EMB培养基）。
2、试剂：无菌水、结晶紫染液、卢氏碘液、95%乙醇、番红染色液。
3、器皿：灭菌三角烧瓶，灭菌的带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管，德汉氏小管，载玻片，无菌空瓶，移液管，接种环，酒精灯，注射器，显微镜等。
四、实验步骤第一周（2008-11-11）1、制备无菌水：取4支试管，向每支试管中加入9ml自来水。
2、配制：牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂15~20g，蒸馏水1000ml，pH 7.2~7.4）乳糖蛋白胨培养基（蛋白胨10g，牛肉膏3g，乳糖5g，NaCl 5g，1．6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml，蒸馏水1000ml，pH 7.2~7.4）三倍浓度浓缩乳糖蛋白胨培养基（将上述乳糖蛋白胨培养基浓缩3倍配制）3、将以上配制的无菌水和培养基全部进行灭菌处理。
大肠菌群的计数实验
大肠菌群计数实验MPN计数法一、设备和材料250ML锥形瓶3个100ML烧杯1个250ML量筒1个1000ML烧杯1个15*150mm试管3个1ML刻度吸管4个18*180mm试管20个杜氏小管玻璃棒1个接种环1个剪刀1把药匙2个均质器天平〔感量0.1g〕电炉洗耳球二、实验准备1、配制培养基：LST培养基的配制：用天平称取17.8gLST培养基于锥形瓶中参加500ML蒸馏水加热煮沸至完全溶解分装于装有杜氏小管的大试管中，每管10ML，共10管高温灭菌备用BGLB培养基的配制：用天平称取20gBGLB培养基于锥形瓶中参加500ML蒸馏水加热煮沸至完全溶解分装于装有杜氏小管的大试管中，每管10ML，高温灭菌备用2、生理盐水取4.25g氯化钠于大烧杯中参加500ML蒸馏水溶解取225ML生理盐水于锥形瓶中分别取9ML生理盐水于3只小试管中将分装好的生理盐水进展高温灭菌3、灭菌：将均质杯、100ML烧杯、刻度吸管、剪刀、接种环、洗耳球高温灭菌备用三、取样在提交的产品中随机抽取三箱，从每箱中随机抽取未翻开包装的产品1袋~3袋，抽取不低于250g的样品作为微生物指标检验试样。
四、检验程序36℃±1℃48h±2h36℃±1℃48h±2h 五、操作步骤初发酵试验1、称取25g 样品，放人盛有225m生理盐水的无菌均质杯，8 00or/min-10 000r/min 均质1 min-2 min ，制成1:10 的样品匀液。
2、用1ml无菌吸管吸取1:10 样品匀液1ml，沿管壁缓缓注人9ml生理盐水的无菌试管中〔注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面〕，振摇试管，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。
3、换一只新的1ml无菌吸管吸取1:100样品匀液1ml，沿管壁缓缓注人9ml生理盐水的无菌试管中〔注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面〕，振摇试管，使其混合均匀，制成1:1000 的样品匀液。
大肠菌群检测操作规范培训
大肠菌群检测操作规范培训一、引言大肠菌群是指肠道内的一类细菌，包括大肠埃希菌、变形杆菌、埃斯特菌、摩根氏菌等，是人体健康的重要指标之一。
大肠菌群检测是一种常见的临床检验项目，可以用于判断肠道菌群的平衡状况，对于排查肠道疾病、调节肠道菌群平衡等具有重要的临床意义。
本文旨在对大肠菌群检测相关的操作规范进行培训，以确保检测结果的准确性和可靠性。
二、前期准备1. 实验室环境准备：（1）实验室应当保持清洁整洁，操作台面应当有足够的空间进行操作。
（2）实验室空气应当流通良好，保持适宜的温度和湿度。
（3）实验室内应当配备必要的实验仪器和设备，如PCR仪、离心机、冰箱、显微镜等。
（4）实验室内应当配备必要的耗材和试剂，如离心管、移液器、试剂盒等。
2. 人员准备：（1）参与大肠菌群检测的工作人员应当接受相关的培训，了解操作规范和实验流程。
（2）工作人员应当穿着符合卫生要求的工作服和手套，避免交叉感染。
三、操作规范培训1. 样本采集：（1）样本采集应当在临床医生指导下进行，严格按照采集标本的要求进行操作。
（2）采集的样本应当尽快送交实验室进行检测，避免样本长时间保存导致细菌数量的改变。
2. 样本处理：（1）收到样本后，应当立即进行处理，避免样本受到外界污染。
（2）样本应当在无菌条件下进行离心、抽提DNA等处理工作，避免外来细菌的干扰。
3. PCR扩增：（1）PCR扩增是大肠菌群检测的关键步骤，应当严格按照PCR扩增试剂盒说明书进行操作。
（2）PCR扩增反应体系应当准确配制，避免试剂用量不足或过量导致扩增失败或者非特异性扩增。
4. 扩增产物检测：（1）扩增产物检测应当使用准确的方法，如琼脂糖凝胶电泳或者实时荧光定量PCR。
（2）扩增产物的检测结果应当与正对照和负对照比较，确保结果的准确性。
5. 数据分析：（1）检测结果应当由专门的人员进行数据分析，避免结果的误解和错误解读。
（2）对于阳性结果的样本，应当进行多次重复检测以确认结果的可靠性。
大肠菌群检测操作规范培训
详细描述
采样时，应选取有代表性的样品，如选取多个部位、多种类 型的食物进行采样。同时，采样工具应清洁无菌，避免交叉 污染。
试剂污染或失效
总结词
试剂是进行大肠菌群检测的必要物质，其质量和有效性对检测结果有很大影响。
详细描述
试剂应存放在阴凉、干燥、避光的地方，并在规定的有效期内使用。使用前应检 查试剂是否过期或变质。
确保检测设备齐全、功能 正常，校准合格证在有效 期内。
设备清洗
使用无菌棉球或纱布蘸取 75%乙醇或无水乙醇，擦 拭设备表面和内部，干燥 后进行下一步操作。
设备校准
根据设备说明书进行校准 ，确保检测结果的准确性 。
试剂配制与储存
试剂清单
列出所需试剂的名称、规格和数量，并核对试剂 的有效期。
配制方法
按照试剂说明书进行配制，注意配制环境和卫生 条件。
需根据菌落形态、革兰氏染色和生化反应等指标综合判断，以确定是否存在大肠菌 群。
在进行菌落计数时，需遵循无菌操作原则，并对各个稀释度的平板进行计数，以计 算出每克或每毫升样品中的大肠菌群数。
结果报告内容与格式
报告中需包含样品名称、来源、 检测日期、检测方法等信息。
应提供每个稀释度平板上的菌落 数及计算得出的大肠菌群数。
根据检测结果，给出样品是否符 合国家或行业标准的判定结论。
结果审核与确认
对检测结果进行审核，确保数 据的准确性和可靠性。
如发现异常数据或疑问，需要 进行复检或重新实验以确认结 果。
审核无误后，由检测人员签署 报告，并报送相关部门或客户 。
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常见问题与解决方案
大肠菌群的测定实验报告
大肠菌群的测定实验报告
《大肠菌群的测定实验报告》
实验目的：通过实验测定大肠菌群的数量，了解其在肠道中的分布情况，并探讨其与健康的关系。
实验方法：我们采集了一组健康人群的粪便样本，并使用培养基和平板计数法对大肠菌群进行测定。
首先，我们将粪便样本均匀涂抹在培养基上，然后将培养皿放入恒温箱中进行培养。
培养后，我们对培养皿上的菌落进行计数，并根据计数结果得出大肠菌群的数量。
实验结果：经过实验测定，我们发现健康人群的大肠菌群数量在正常范围内，平均值约为10^8 CFU/g。
同时，我们还发现不同个体之间的大肠菌群数量存在一定的差异，但总体上呈现出稳定的分布情况。
实验分析：大肠菌群在肠道中起着重要的作用，它能够帮助人体消化食物、产生维生素等。
同时，大肠菌群的数量与肠道健康密切相关，过多或过少都可能导致肠道问题。
因此，通过测定大肠菌群的数量，可以帮助我们了解肠道健康状况，及时采取相应的调节措施。
结论：通过本次实验测定，我们得出了健康人群大肠菌群数量的正常范围，并认识到了大肠菌群在肠道健康中的重要作用。
希望通过这一实验结果，能够为人们提供更多关于肠道健康的参考信息，促进人们更加关注和重视肠道健康。
大肠菌群测定方法
大肠菌群测定方法 Company number：【0089WT-8898YT-W8CCB-BUUT-202108】大肠菌群及检验一、大肠菌群介绍大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。
大肠菌群分布较广，在温血动物粪便和自然界广泛存在。
调查研究表明，大肠菌群细菌多存在于温血动物粪便、人类经常活动的场所以及有粪便污染的地方，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因。
粪便中多以典型大肠杆菌为主，而外界环境中则以大肠菌群其他型别较多。
大肠菌群是作为粪便污染指标菌提出来的，主要是以该菌群的检出情况来表示食品中有否粪便污染。
大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危害性的大小。
粪便是人类肠道排泄物，其中有健康人粪便，也有肠道患者或带菌者的粪便，所以粪便内除一般正常细菌外，同时也会有一些肠道致病菌存在（如沙门氏菌、志贺氏菌等），因而食品中有粪便污染，则可以推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，必须看作对人体健康具有潜在的危险性。
大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一，目前已被国内外广泛应用于食品卫生工作中。
二、大肠菌群检验方法：由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，即：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。
目前国内采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有国家标准和原国家商检局制订的行业标准。
两个标准方法在检测程序上略有不同。
（一）国家标准：国家标准采用三步法，即：乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。
大肠菌群测定课件
大肠菌群测定
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关于新国标大肠菌群MPN表的理解问题
关于和产品标准对应的问题。
从这个意义上讲，稀释度的选择是根据产品 要求进行的，理论上：
如果要求得到每克产品菌群含量，加样量应该 是0.333克比较合适。
如果要求得到每10克产品菌群含量，加样量 应该是3.33克比较合适。
如果要求得到每100克产品菌群含量，加样量 应该是33.3克比较合适。
GB4789.3-2010 大肠菌群测定
大肠菌群测定
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GB4789.3-2010 大肠菌群测定
定义：大肠菌群：一群在36℃培养48h可发 酵乳糖、产酸产气的需氧和
兼性厌氧革兰氏染色阴性
无芽孢杆菌。该菌主要来
源自人畜粪便，作为粪便
污染指标评价食品的卫生
状况，推断
食品中肠道致
病菌污染的可能。
大肠菌群测定
大肠菌群测定
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关于新国标大肠菌群MPN表的理解问题
关于和产品标准对应的问题。
这样的话，就需要增加加样量，变成加样量 为3.33克，如果全部是阴性0-0-0，得到结果为 <0.3/克，或者是<3/10克，或者是 <30/100克。这样的结果才能符合要求。
如果更精确的操作，应该是加样量为33.3克。 这样如果全部是阴性0-0-0，得到<3/100克， 结果为2-1-0，得到MPN 15/100克，也是合 格产品。
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关于新国标大肠菌群MPN表的理解问题
改变加样量的问题。 在实际操作中，因为一些原因需要改变加样
量，一般是10倍增加或者降低，同样使用本表， 得到的数值需要做10倍调整。
比如： 加样量为3.33克（这样的情况一般 是十倍稀释液用3管，每管10毫升，需要用双料 管。十倍百倍稀释液，各用三管，每管1毫升）。
大肠菌群计数检验指导
例： 10-4样品稀释液1mL ，在VRBA平板上有100个典 型和可疑菌落 ，挑取其中10个接种BGLB肉汤管 ，证 实有6个阳性管 ，则该样品的大肠菌群数为：
100×6/10×104/g（ mL）=6.0×105CFU/g（ mL）。
· 胆盐可以抑制其它细菌生长繁殖。 · 分解乳糖产酸产气的大肠菌群 ，看小倒管中的气体。
杜氏发酵管产气情况
1 产气
2
不产气
第四天： 大肠菌群计数报告
第一法： 确证大肠菌群LST阳性管数 ， 检索
MPN表（见附录） ，报告每g（mL）样 品中大肠菌群的MPN值。
第二法： 经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以结晶
· 从10-2取样1ML+9 ML生理盐水=1：1000，从10-3取 样1ML ，接种到3管LST中。
第二法： 检样稀释与平板计数
检样稀释： 同上。 平板计数： 1 、每个稀释度接种2个无菌平皿 ，每皿1mL稀
释样品 ， 另外一个平皿加1mL生理盐水作空 白对照。 2 、及时将15—20mLVRBA（结晶紫中性红胆 盐琼脂） 倾注每个平皿中。 3 、待琼脂凝固后 ，再加3—4mLVRBA覆盖表 层 。翻转平板培养。
· MPN： 表示食品中大肠菌群数是以每100ML或克检样内大肠菌 群最大可能数 。一般采用9管法.
· 一般样品25ML（克）+225ML生理盐水=1： 10，从 10-1取样1ML ，接种到3管LST（月桂基硫酸盐胰蛋白 胨肉汤） 中。
· 从10- 1取样1ML+9 ML生理盐水=1：100，从10-2取样 1ML ，接种到3管LST中。
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学习手册
《子情境：大肠菌群数测定》引导文-单元设计-实训指导书
引导文
微生物学检测-大肠菌群数测定
阅读材料
大肠菌群主要包括肠杆菌科中的埃希氏菌属、柠檬酸细菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。
这些属的细菌均来自于人和温血动物的肠道，需氧与兼性厌氧，不形成芽孢，在35～37℃条件下，48h内能发酵乳糖产酸产气，革兰氏阴性。
大肠菌群中以埃希氏菌属为主，埃希氏菌属被俗称为典型大肠杆菌。
大肠菌群都是直接或间接地来自人和温血动物的粪便。
本群中典型大肠杆菌以外的菌属，除直接来自粪便外，也可能来自典型大肠杆菌排出体外7~30d后在环境中的变异。
所以食品中检出大肠菌群，表示食品受到人和温血动物的粪便污染，其中典型大肠杆菌为粪便近期污染，其他菌属则可能为粪便的陈旧污染。
材料二：抑菌剂
大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。
抑菌剂的主要作用是抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。
国家标准中乳糖胆盐发酵管利用胆盐作为抑菌剂，行业标准中LST肉汤利用十二烷基硫酸钠作为抑菌剂，BGLB肉汤利用煌绿和胆盐作为抑菌剂。
抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠菌群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。
有些抑菌剂用量甚微，称量时稍有误差，即可对抑菌作用产生影响，因此抑菌剂的添加应严格按照标准方法进行
回答下面问题？
大肠菌群数？_________
材料一 、测定方法
由于大肠菌群指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，即：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
因此大肠菌群的检测一般都是按照它的定义进行。
目前国内采用的进出口食品大肠菌群检测方法主要有国家标准和原国家商检局制订的行业标准。
两个标准方法在检测程序上略有不同。
国家标准：国家标准采用三步法，即：乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。
乳糖发酵试验：样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。
36±1℃培养48±2h ，观察是否产气。
分离培养：将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，36±1℃培养18-24h ，观察菌落形态。
证实试验：挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。
同时接种乳糖发酵管36±1℃培养24±2h ，观察产气情况。
报告：根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN 表，报告每100ml （g ）大肠菌群的MPN 值。
具体操作参见GB4789.3-94 《中华人民共和国国家标准 食品卫生微生物学检验 大肠菌群测定》
相关资料
材料二、微生物学检验大肠菌群数的测定
一、原理
大肠菌群系指一群能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。
它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。
食品中大肠菌群数系以每100g（或ml）检样内大肠菌群最近似数（the most probable number 简称MPN）表示。
二、培养基及试剂
单料乳糖胆盐发酵管、双料乳糖胆盐发酵管、乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂（EMB）、革兰氏染色液、蛋白陈水、靛基质试剂、麦康凯(MA) 其它设备和材料温箱(36土1)℃、水浴锅(44土0.5)℃、天平、显微镜、均质器或乳钵、温度计、平皿、试管、发酵管、吸管、载玻片、接种针。
三、实验步骤
(一)检验程序
大肠菌群检验程序见图5—2
(二)操作步骤
1．采样及稀释
①以无菌操作将校样25g(或25mL)放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。
固体检样最好用无菌均质器，以800r／mjn—1000r ／min的速度处理1min，做成1：10的稀释液。
②用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇混匀，做成1：100的稀释液，换用1支lmL灭菌吸管，按上述操作依次作10倍递增稀释液。
③根据食品卫生要求或对检验样品污染情况的估计按种3管。
也可直接用样品接种。
2．乳糖初发酵试验
即通常所说的假定试验。
其目的在于检查样品中有无发酵乳糖产生气体的细菌。
将待校样品接种子乳糖服盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管1mL及1mL以下者，用单料乳糖发酵管。
每一个稀释度接种3管，置(36土1)℃培养箱内，培养(24土2)h，的所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，勿有产生者，则按下列程序进行。
如有产生者，则按下列程序进行。
3．分离培养
将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂板或麦康凯琼脂平板上，置(36土1)℃温箱内，培养18h一24h，：然后取出，观察菌落形态并作革兰氏染色镜检和复发酵试验。
4．乳糖复发酵试验
即通常所说的证实试验，其目的在于证明从乳糖初酪管试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰氏阴性无芽孢杆菌，确能发酵乳糖产生气体。
在上述的选择性培养基上，挑取可疑大肠菌群1—2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置(36士l)℃的温箱内培养(24土2)h，观察产气情况。
凡乳糖发酵管产气．革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌，即报告为大肠杆菌阳性糖发酵管不产气或革兰氏染色为阳性，则报告为大肠杆菌为阴性。
完成以下信息！
大肠菌群数的测定学习情境设计方案
天津现代职业技术学院
实训计划。