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A/O法活性污泥中氨氧化菌群落的动态与分布摘要：我们研究了在厌氧—好氧序批式反应器（SBR）中氨氧化菌群落（AOB）和亚硝酸盐氧化菌群落（NOB）的结构活性和分布。

在研究过程中，分子生物技术和微型技术被用于识别和鉴定这些微生物。

污泥微粒中的氨氧化菌群落结构大体上与初始的接种污泥中的结构不同。

与颗粒形成一起，由于过程条件中生物选择的压力，AOB的多样性下降了。

DGGE测序表明，亚硝化菌依然存在，这是因为它们能迅速的适应固定以对抗洗涤行为。

DGGE更进一步的分析揭露了较大的微粒对更多的AOB种类在反应器中的生存有好处。

在SBR反应器中有很多大小不一的微粒共存，颗粒的直径影响这AOB和NOB的分布。

中小微粒（直径<0.6mm）不能限制氧在所有污泥空间的传输。

大颗粒（直径>0.9mm）可以使含氧量降低从而限制NOB的生长。

所有这些研究提供了未来对AOB微粒系统机制可能性研究的支持。

关键词：氨氧化菌（AOB），污泥微粒，菌落发展，微粒大小，硝化菌分布，发育多样性1.简介在浓度足够高的条件下，氨在水环境中对水生生物有毒，并且对富营养化有贡献。

因此，废水中氨的生物降解和去除是废水处理工程的基本功能。

硝化反应，将氨通过硝化转化为硝酸盐，是去除氨的一个重要途径。

这是分两步组成的，由氨氧化和亚硝酸盐氧化细菌完成。

好氧氨氧化一般是第一步，硝化反应的限制步骤：然而，这是废水中氨去除的本质。

对16S rRNA的对比分析显示，大多数活性污泥里的氨氧化菌系统的跟ß-变形菌有关联。

然而，一系列的研究表明，在氨氧化菌的不同代和不同系有生理和生态区别，而且环境因素例如处理常量，溶解氧，盐度，pH，自由氨例子浓度会影响氨氧化菌的种类。

因此，废水处理中氨氧化菌的生理活动和平衡对废水处理系统的设计和运行是至关重要的。

由于这个原因，对氨氧化菌生态和微生物学更深一层的了解对加强处理效果是必须的。

当今，有几个进阶技术在废水生物处理系统中被用作鉴别、刻画微生物种类的有价值的工具。

目前，分子生物技术的应用能提供氨氧化菌群落的详细分类说明。

如今，主要由于其细胞固定策略，好氧污泥颗粒处理已经成为传统废水处理的替代工艺。

颗粒有更加彻底的紧密结构和快速适应速率。

因此，颗粒污泥系统比传统活性污泥法有更高的混合悬浮固体浓度浓度(MLSS)和更长的污泥龄(SRT)。

更长的污泥龄能提供足够长的时间让时代时间长的微生物生长(例如氨氧化菌)。

有些研究表示，硝化颗粒可以在富铵离子废水中培养出来，并且颗粒的直径很小。

其他研究报告说，大直径颗粒已经在序批式反应器(SBR)中人工合成的有机废水里培育出来了。

污泥颗粒里的大量不同微生物共存，并去除COD和氮磷。

然而，对于直径大于0.6mm的大颗粒来说，由于氧传递被限制不能到达颗粒核心，外部好氧壳和内部厌氧地带共存。

这些特性表明，大颗粒污泥内部环境不适合氨氧化菌的生长。

有些研究表明，颗粒大小和密度导致了氨氧化菌、亚硝酸氧化菌和反硝化菌的分布和优势种群。

虽然不少研究力求评估废水处理系统中氨氧化菌的生态生理，但是至今仍然被污泥颗粒化过程的水力学、分布、氨氧化菌群落的数量化限制着。

2.原理和方法2.1反应器设置和操作污泥颗粒被接种在有效体积为4L的实验室规模的SBR里。

反应器有效直径和高度分别为10cm和51cm。

水力停留时间设为8h。

来自全尺寸污泥处理设置(中国天津污水处理厂)的活性污泥被作为反应器的种污泥，其MLSS初始浓度为3876mg/L。

反应器操作6小时为一循环，由2分钟的进水时间，90分钟厌氧混合，240反正抛弃阶段和5分钟出水阶段组成。

在20天80个SBR循环后，污泥沉降时间逐渐从10分钟降到5分钟，并且只有沉降速度大禹4.5m/h的颗粒才能在反应器中停留。

入流中的主要化合物包括NaAc(450mg/L)，NH4Cl(100mg/L)，(NH4)2SO4(10mg/L)，KH2PO4(20mg/L)，MgSO4·7H2O(50mg/L)，KCl(20mg/L)，CaCl2(20 mg/L)，FeSO4·7H2O(1mg/L)，pH 7.0-7.5，and 0.1 mg/L元素示踪剂。

分析方法-TOC、TN、TP、MLSS、SVI都根据标准方法定期检测。

污泥大小分布由筛法决定。

4个干净的直径为5cm钢制筛，筛孔直径分别0.9,0.6,0.45,和0.2mm，这4个筛子被全程监控。

用友刻度的圆柱从反应器中取100mL的污泥，然后放到0.9mm筛孔的筛子上。

随后用蒸馏水冲洗，直径小于0.9mm的颗粒通过这个筛子，到达筛孔更小的筛子上。

冲洗过程要重复几次，以分开污泥团。

不同面上收集到的颗粒恢复用蒸馏水反冲洗。

每一部分都手机在不同的烧杯里，然后用量化的滤纸过滤来测定TSS。

一旦留在各个筛子上TSS的数量确定了，就可以确定不同大小的颗粒占污泥总重的比例了。

2.2DNA提取和PCR-DGGE来自大约8mg的MLSS种的污泥被转化成1.5mL的Eppendorf管，然后在14000g条件下离心10分钟。

移除上清液，向其中加入1mL磷酸钠缓冲液，然后在无菌条件下研磨以分离颗粒。

使用E.Z.N.A.Soil DNA工具，离心物种DNA染色体被分离。

为了放大氨氧化菌特征16s rRNA来进行DGGE，一个巢式PCR被用为先前描述。

30µl的巢式PCR放大剂被加载并被在聚丙烯酰胺凝胶上的加了线性分布为35%-55%的变性剂DGGE分开。

这个胶体在维持60度、140V、1×TAE缓冲液中(通用突变检测系统)运行 6.5h。

电泳结束后，银染色和胶体的发展表现正如Sanguinetti所表述。

接下来是空气干燥和用凝胶成像分析系统扫描。

凝胶扫描图像用Quantity One分析，版本号4.31。

成对群落相似性的色子指数是计算评估氨氧化菌群落在DGGE中线路相似性的。

这个用Quantity One测出的指数范围从0%(无共同频带)到100%(频带相同)。

Shannon多样性指数（H）是用来衡量将一个菌群中每个菌种的丰富度和比例加入考虑的微生物多样性。

H用下列等式计算：H=−∑(n iN)log⁡(n iN)其中，ni/N表示i菌种占总群落的比例(i条带亮度在条带总亮度中的比例)。

微生物系统树图模板相似性使用Quantity One不用非加权配对组算术平均数（UPGMA法）算法就能计算出来。

突出的DGGE条带被切除并溶解在30mL Milli-Q水中过夜，温度维持4摄氏度。

在冷冻解冻3次后凝胶中的DNA被回收。

目标DNA片段的克隆及测序按照既定的方法（Zhang等，2010）进行。

2.3硝化细菌的分布为了调查AOB和NOB在颗粒中的空间分布，3种大小([0.2-0.45],[0.45-0.6],>0.9 mm)的颗粒在第180天被选定做FISH分析。

2mg的污泥样品被固定在在4摄氏度下的4％多聚甲醛溶液16-24 h，然后用磷酸钠缓冲液冲洗两次；样本分别在在50%，80%和100%的乙醇中脱水10分钟。

在室温下，将颗粒在乙醇—二甲苯体积比分别为3:1，1:1，1:3然后100%二甲苯的溶液中连续浸泡，每次10分钟后，颗粒中的乙醇然后完全被二甲苯取代。

随后，将颗粒在二甲苯与石蜡体积比为1:1的60度溶液中浸泡30分钟，接着再在100%石蜡溶液中浸泡30分钟，颗粒被石蜡嵌入。

在石蜡固化后，切为8mm厚的片，放置在涂了明胶的显微镜上。

将切片在二甲苯和乙醇中各浸泡30分钟，石蜡被去除，然后将切片干燥。

三个寡核苷酸探针被用于杂交：FITC标记为Nso190，指明了大多数AOB；TRITC标记为NIT3，指明了硝化sp。

所有的探针序列，杂交条件，以及洗涤条件都在表1中给出。

寡核苷酸的合成以及荧光标记都来自Takara公司。

杂交是在包含了各个标记了的探针(5ng µ/L)的46摄氏度度杂交缓冲液(0.9M NaCl,甲酰胺的百分比见表1，20mM Tris/ HCl，pH值8.0，0.01% SDS)下进行了2小时。

杂交后，未被结合的寡核苷酸由一个严格的洗涤步骤去除：在48度与洗涤液含有相同化合物的缓冲液中洗涤15分钟。

为了所有DNA的探测，DAPI被用甲醇最终稀释到浓度为1ng µ/L。

将切片用DAP-Iemethanol覆盖并保持恒温37度15分钟。

然后将切片用甲醇清洗一次，再用蒸馏水简单清洗，完了立刻空气干燥。

使用Vectashield(媒介实验室)以防止照片变白。

使用激光共聚焦显微镜来抓拍杂交图像(CLSM,Zeiss 710)。

每种颗粒大小的每个探头都各自一共拍了10张图像。

最后使用Adobe PhotoShop选出代表图像和最终图像的评价。

表1：用于不同大小颗粒的寡核苷酸探针图1：生物量和SVI10在整个操作过程中的变化3.结果3.1SBR性能及颗粒特征在启动阶段，反应器能高效去除TOC以及氨氮。

98%的氨氮和100%的TOC 分别在第3天和第5天从入流中被去除(图S2，S3)。

这一期间总氮和总磷的去除率不高，虽然总磷的去除率逐渐提高，在第33天达到100%(图S4)。

为了确定污泥颗粒的污泥体积指数，沉淀时间由10分钟代替30分钟，因为颗粒污泥在60分钟和5分钟后有一个相似的SVI数值。

接种污泥的SVI值是108.2Ml/g。

在连续操作中MLSS和SVI10的变化如图1所示。

污泥沉降性在设置阶段明显提升。

图2反应了污泥颗粒的慢速形成，从流动态到颗粒状态。

3.2DGGE技术分析：AOB的群落结构在污泥颗粒化中的变化巢式PCR的结果在图S1中显示。

在GSBR的操作中，较好显示的DGGE条带被在代表性点上得到，那些条带揭示AOB群落的结构在污泥颗粒化和稳定化过程中是动态的(图3)。

实验结束时的菌群结构与初始接种污泥的菌群结构是不同的。

AOB群落在第一天和GSBR操作的最后仅有40%的相似度，指明接种污泥和形成的颗粒污泥中AOB群落有重大变化。

通过计算Shannon指数H分析DGGE 模板得出的生物多样性见图5.图2：污泥中颗粒大小分布在操作过程中的变化图3：AOB群落在污泥颗粒化过程中DGGE分析(顶部表示取样时间)。

主要条带已用数字标出(条带1-15)在污泥接种阶段(在第38天前)，指数H由于反应器中一些菌种的消失明显下降。

虽然几种接种污泥中的优势菌种(条带2,7,10,11)得以保留，但是许多条带削弱或消失了(条带3,4,6,8,13,14,15)。

在第45天后，多样性指数趋于稳定，并且显示流动性变小(从0.72到0.82)。

模板条带相似性利用UPGMA程序分析。

UPGMA分析显示三个组菌落群相似度约为67%-78%，群体内部约为44%-62%。