遗传育种学第十七章 分子育种详解
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园艺育种学-分子育种
多种几丁质酶已被克隆并转入烟草、番茄中，转基因植株表 现了抗真菌的特性。
B：植物抗毒素是植物产生的对一些不同种类 的病原菌具有毒性的物质，亦称植保素。
目前已鉴定了 200 多种植保素，其中以类黄酮 与类萜类植保素研究最多。从葡萄中分离出的 一种植物抗毒素3,4,5-三羟芪合成酶基因导入烟 草后，转基因植株与对照相比表现出对病原菌 （Botrytis cinerea）更强的抗性。 此外导入植物的核糖体灭活蛋白（ RIP ）抗真 菌性病害也有报道。
2 基因工程的作用
（1） 抗病基因工程：抗病毒、抗细菌及抗真菌 抗病毒：研究发展最快，主要采用向植物导入病毒外壳蛋白 （Coat Protein, CP） 基因。 自从1986年Beachy等将烟草花叶病毒的外壳蛋白基因（TMVCP）导入烟草中，发现转基因植株发病时间明显延迟或病害 的症状明显减轻后，已对多种植物病毒进行了试验，将这些 植物病毒的外壳蛋白基因导入植物以增强其抗病毒能力。如 黄瓜花叶病毒（ CMV ）、马铃薯 X 病毒和 Y 病毒（ PVX 和 PVY ）、大豆花叶病毒（ SMV ）、苜蓿花叶病毒（ AIMV ） 等 20 多种病毒的外壳蛋白基因导入植物后，均得到了类似的 结果，使植物获得了对相应病毒的抗性。在我国，导入TMV 和CMV外壳蛋白基因获得的抗病毒烟草已在进行田间试验， 增产效果明显。
转CMV/CP基 因的番茄
除利用外壳蛋白基因途径外，还有利用转移病毒的反义 RNA、 卫星 RNA 、病毒复制酶基因（ replicase ）和核酶（ ribozyme ） 基因，以及利用植物本身编码的抗病毒基因如核糖体失活蛋 白基因（ribosome inactivating protein，RIP）等也有获得成 功的报道。
1.4 发展现状
《分子育种》课件
基因编辑技术为农作物和动物的遗传改良提供了强有力的工具，可以实现对特定基因的敲除、敲入和敲减等操作，从而达到改良品种和提高生产性能的目的。
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历史回顾
自20世纪50年代以来，分子育种经历了从传统育种到基因工程育种的发展历程，技术手段不断更新和完善。
02
分子育种技术
基因克隆技术是一种通过无性繁殖的方式，将一个DNA片段复制出多个相同片段的技术。
该技术包括限制性内切酶、DNA连接酶和质粒等关键酶和元件，通过限制性内切酶将DNA双链切开，再利用DNA连接酶将切开后的DNA片段与质粒连接，最后将连接产物导入宿主细胞中，实现基因的克隆。
特点
提高育种效率
分子育种能够大幅度缩短育种周期，提高育种效率，加速新品种的培育进程。
优化品种性状
通过精确地定向改良，分子育种能够显著改善品种的性状，提高农作物的产量、品质和抗逆性。
促进农业可持续发展
分子育种有助于培育抗病虫害、抗除草剂等新品种，减少化学农药的使用，降低环境污染，促进农业可持续发展。
提高玉米的抗逆性和产量，减少农药使用，降低生产成本，对保障全球粮食安全具有重要意义。
转基因玉米的争议
关于转基因食品的安全性、对环境和生态的影响等方面存在争议，需要进一步研究和评估。
转基因玉米的研发过程
利用转基因技术将抗虫、抗病、抗旱等外源基因导入玉米细胞，经过组织培养获得转基因植株，再经过多代选育和试验，最终获得具有优良性状的转基因玉米品种。
通过基因工程技术，研发新型疫苗，预防传染病。
疫苗研发
《分子育种》课件
《分子育种》课件一、教学内容本节课的教学内容来自于小学科学五年级下册第五单元第一课时《分子育种》。
本节课的主要内容是让学生了解分子育种的基本概念，掌握分子育种的基本方法，以及了解分子育种在农业生产中的应用。
二、教学目标1. 让学生了解分子育种的基本概念，掌握分子育种的基本方法。
2. 让学生了解分子育种在农业生产中的应用，提高学生的实践能力。
3. 培养学生热爱科学，关注农业生产的情感态度。
三、教学难点与重点重点：让学生了解分子育种的基本概念，掌握分子育种的基本方法。
难点：让学生了解分子育种在农业生产中的应用。
四、教具与学具准备教具：PPT课件、黑板、粉笔。
学具：课本、笔记本、彩笔。
五、教学过程1. 情景引入：教师通过播放一段关于农业生产的视频，引导学生关注农业生产中的科技应用。
2. 讲解分子育种的基本概念：教师通过PPT课件，讲解分子育种的基本概念，让学生了解分子育种的基本原理。
3. 讲解分子育种的基本方法：教师通过PPT课件，讲解分子育种的基本方法，让学生掌握分子育种的基本技巧。
4. 案例分析：教师通过PPT课件，展示一些分子育种在农业生产中的应用案例，让学生了解分子育种的实际应用。
5. 随堂练习：教师通过PPT课件，给出一些关于分子育种的问题，让学生进行随堂练习，巩固所学知识。
6. 作业布置：教师通过PPT课件，布置一些关于分子育种的作业，让学生课后巩固所学知识。
六、板书设计板书设计如下：分子育种基本概念→ 基本方法→ 应用案例七、作业设计1. 题目：请简述分子育种的基本概念。
答案：分子育种是指通过分子生物学技术，对生物体的基因进行改造，以达到改良生物品种的目的。
2. 题目：请列举两种分子育种的方法。
答案：基因重组、基因编辑。
3. 题目：请举例说明分子育种在农业生产中的应用。
答案：转基因抗虫棉、转基因抗病水稻。
八、课后反思及拓展延伸课后反思：本节课通过讲解分子育种的基本概念、基本方法和应用案例，让学生了解了分子育种的相关知识。
遗传育种学第十七章分子育种
LB
RB
E
Ti Plasmid
Vir 区
Con 区
Ori 区
T-DNA的结构与功 能∶
左边界 核心区 右边界
LLBB RRB
B
Vir 区操纵子的基因结构与功能
• Vir区是一段长度为35KB操纵 子
• 包含六个基因： VirA、VirB 、 VirC 、 VirD 、 VirE 、 VirG。
植物遗传转化的载体系统
表型分析鉴定
鉴定步骤： 筛选鉴定（利用质粒上的选择标记） 报告基因鉴定（利用质粒上的报告基因）
2.2.1 外源DNA导入植物细胞的方法
• 载体介导的转化方法： 致癌农杆菌介导的Ti质粒载体转化法 病毒介导的基因转移
• DNA直接导入法： 化学法：PEG诱导的基因转化 电激法介导 显微注射
• 媒体介导法 脂质体介导 超声波介导 基因枪介导
致癌农杆菌介导的Ti质粒载体转化法
含有Ti质粒的致癌农杆菌与一些植物的细 胞接触后，Ti质粒的一部分（T-DNA）可以 导入植物细胞，整和到植物基因组DNA随其 复制。根据这一特性可构建一系列Ti质粒载 体， 与含目的片段的DNA片段重组，导入 致癌农杆菌，再采用叶盘法、原生质体培养 法、细胞培养法，通过致癌农杆菌介导进入 植物细胞。
②氯霉素乙酰基转移酶（Chloraphenicol acetyltransferase, CAT）基因
③潮霉素磷酸转移酶（Hygromycin phosphotransferase, Hpt）基因
④β – 葡萄糖酸苷酶 （β – Glucuronidase, GUS）基因
⑤荧光素酶（Luceferase, Luc）基因 ⑥抗除草剂（Basta, Bar）基因
《分子育种》PPT课件
利用分子育种手段保护濒危畜禽 品种资源，维护生物多样性。
通过分子设计育种技术创制具有 自主知识产权的畜禽新品种，提
升我国畜牧业的国际竞争力。
06
分子育种面临的挑战与展望
分子育种面临的技术挑战
基因组编辑技术的精确性和效率
尽管CRISPR-Cas9等基因组编辑技术为分子育种带来了革 命性突破，但其精确性和效率仍需进一步提高，以减少脱 靶效应和基因表达的不可预测性。
结合传统育种和分子育种技术，创制 出适应未来农业发展的多功能作物新 品种。
利用合成生物学手段，设计并构建人 工生物系统，实现作物的多功能化。
05
分子育种在畜牧业中的应用
提高畜禽生产性能
通过基因编辑技术，精准改良 影响畜禽生长、繁殖等性状的 关键基因，提高生产性能。
利用分子标记辅助选择，快速 筛选具有优良生产性能的畜禽 品种。
《分子育种》PPT课 件
目录
• 引言 • 分子育种的基本原理 • 分子育种的技术方法 • 分子育种在作物改良中的应用 • 分子育种在畜牧业中的应用 • 分子育种面临的挑战与展望
01
引言
分子育种的背景与意义
背景
随着生物技术的飞速发展，分子 育种应运而生，为作物遗传改良 提供了新途径。
意义
分子育种可实现基因水平的精准 改良，提高作物产量、品质和抗 逆性，对保障粮食安全具有重要 意义。
基因编辑技术可能带来生物安全风险和伦理问题，需要进行严格的安全
评估和伦理审查。
03
分子育种的技术方法
分子标记技术
基于DNA的分子标记
利用DNA序列多态性进行标记，如RFLP、SSR等。
基于RNA的分子标记
利用RNA表达水平多态性进行标记，如SNP、EST等。
分子育种与常规育种的关系
分子育种与常规育种的关系选择育种对象是育种成功的第一步，通常我们选择优良的基因型作为育种材料。
传统的育种方法主要依靠基因型的变异和突变来进行选育，这种方法需要时间长、成本高，效率低。
分子育种则是利用分子遗传学、生物化学等方面的知识，通过基因组学、转录组学、蛋白质组学等技术手段，快速、准确地筛选和鉴定优良基因型或基因分子标记，加以选择和培育。
因此，分子育种是常规育种方法的有力补充。
分子育种与常规育种相比有着显著的优势。
首先，分子育种可以更加准确地把握育种的方向和目标，避免盲目选育，提高选育效率。
其次，分子育种可以通过任意数量的数量基因组数据分析，确定重要的基因及其关联性，可以实现基因型和表型的信息无缝连接，提高了育种效果。
此外，分子育种也具有可以更好的控制育种质量，耐病性和抗逆性等方面的优势。
这使育种成为更为可持续、稳健和可靠。
分子育种虽然具有很多优势，但仍然存在一些局限性。
一个显著的缺点是分子标记的开发周期很长，需要较高的技术门槛和荧光剂等高质量的试剂，育种成本也会相应增加。
此外，与常规育种方法相比，需要更大的基础设施和资源支持，如计算机与大数据分析能力和实验室技术支持等。
而且在一些育种目标仍然存在不确定性，比如环境因素、植物自身特性以及市场需求等。
所以，特定情况下分子育种也需要同常规育种方法进行结合，以达到更好的育种效果。
综上所述，分子育种与常规育种之间相辅相成，齐头并进。
分子育种未来将会为农业发展提供有力支撑，为实现粮食安全和全面发展提供源源不断的动力。
我们需要把握育种的最新技术，善于用常规育种和分子育种相结合的方式，为农业科技发展做出更大的贡献。
分子育种PPT课件
为了防止出现自动修正作用，可用α-硫代三磷酸核苷作 为底物，这种类似物不为酶所识别和纠正。
30
31
（四）不完全配对的低聚核苷酸介导法
以上的碱基取代都是在双链DNA分子的某个单 链区域进行的。在双链DNA上要利用限制酶来 切开一个单链裂口，这就意味着所发生的取代 只能在限制酶切点的附近，这种空间的限制作 用使上述方法具有一定的局限性。
说明：lipase脂肪酶，esterase酯酶，triglyceride三甘油酯，Degradation降解， Detergent additives洗涤剂添加剂，hydrolysis水解
16
Lipases
Kinetic Resolutions of Chiral Alcohols and Acids
其对象可以是蛋白质或多肽，也可以核酸和其他大分子， 甚至是一些生物体中的小分子。
它通过人工合成或借助于重组 DNA技术，人为制造大 量的变异体，然后按照特定的需要和目的，给予选择压 力，或通过高通量筛选技术，将满足特定目的的分子筛 选出来，从而实现试管中分子水平上的模拟进化。
3
定向进化是一个由构建突变体库，突变体表 达，表达后筛选三个步骤组成的循环递进过 程，需要：
变的频率，其中比较常用的Kunkel提出的一种 配合该技术的诱变体产量富集法。
37
这种方法用具dut和ung基因缺陷的大肠杆菌制 备M13载体。
dut基因编码催化dUTP分解的dUTPase，该基因 缺陷会使细胞中dUTP含量升高，导致复制时少 量dUTP代替dTTP掺入DNA。
ung基因编码尿嘧啶DNA糖基化酶，该基因缺失 后，不能除去掺入DNA的dUTP。
12
定向进化技术包括：
定点突变（定点的） 易错PCR（随机的） DNA重排（重组的） ……
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（四）不完全配对的低聚核苷酸介导法
以上的碱基取代都是在双链DNA分子的某个单 链区域进行的。在双链DNA上要利用限制酶来 切开一个单链裂口，这就意味着所发生的取代 只能在限制酶切点的附近，这种空间的限制作 用使上述方法具有一定的局限性。
说明：lipase脂肪酶，esterase酯酶，triglyceride三甘油酯，Degradation降解， Detergent additives洗涤剂添加剂，hydrolysis水解
16
Lipases
Kinetic Resolutions of Chiral Alcohols and Acids
其对象可以是蛋白质或多肽，也可以核酸和其他大分子， 甚至是一些生物体中的小分子。
它通过人工合成或借助于重组 DNA技术，人为制造大 量的变异体，然后按照特定的需要和目的，给予选择压 力，或通过高通量筛选技术，将满足特定目的的分子筛 选出来，从而实现试管中分子水平上的模拟进化。
3
定向进化是一个由构建突变体库，突变体表 达，表达后筛选三个步骤组成的循环递进过 程，需要：
变的频率，其中比较常用的Kunkel提出的一种 配合该技术的诱变体产量富集法。
37
这种方法用具dut和ung基因缺陷的大肠杆菌制 备M13载体。
dut基因编码催化dUTP分解的dUTPase，该基因 缺陷会使细胞中dUTP含量升高，导致复制时少 量dUTP代替dTTP掺入DNA。
ung基因编码尿嘧啶DNA糖基化酶，该基因缺失 后，不能除去掺入DNA的dUTP。
12
定向进化技术包括：
定点突变（定点的） 易错PCR（随机的） DNA重排（重组的） ……
分子育种
3、AFLP
基本原理：AFLP标记是选择性扩增基因组DNA酶切片段所
产生的扩增产物的多态性，其实质也是显示限制性内切酶酶 切片段的长度多态性，只不过这种多态性是以扩增片段的长 度不同被检测出来。
AFLP标记的特点有：（1）由于AFLP分析可以采用的限
制性内切酶及选择性碱基种类、数目很多，所以该技术所产 生的标记数目是无限多的；（2）典型的AFLP分析，每次反 应产物的谱带在50-100条之间，所以一次分析可以同时检测 到多个座位，且多态性极高；（3）表现共显性，呈典型孟德 尔式遗传；（4）分辩率高，结果可靠；（5）目前该技术受 专利保护，用于分析的试剂盒昂贵，实验条件要求较高。 。
现代育种新技术之
分子育种
（molecular breeding）
主要内容
第一节 分子育种的概念和方法
第二节 分子遗传标记
第三节 QTL的鉴别与定位 第四节 标记辅助选择
第五节 展 望
第一节
分子育种的概念和方法
分子育种的概念
指DNA分子标记辅助育种(简称DNA标记 辅助育种)。DNA标记辅助育种(DNA marker-assisted breeding）是一种利用 DNA 水平上的(非蛋白质水平上的)分子 标记(或称DNA标记)对生物群体进行遗 传改良的技术。
RFLP、DNA指纹技术（DNA Fingerprinting）、原位杂交 （in situ hybridization）等；
第二类是以PCR为核心的分子标记技术，包括RAPD、
简单序列重复标记SSR或简单序列长度多态性（Simple sequence length polymorphism, 简称SSLP标记）、扩展片段 长度多态性标记AFLP、序标位STS、序列特征化扩增区域 SCAR等；
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2.1.2 基因工程的载体系统
质粒载体 噬菌体载体 病毒载体
质粒图谱及质粒构建
启动子 外源基因 终止子 启动子 报告基因 终止子
目的片段
（标记基因） 选择标记
载体
植物基因工程的报告基因：
• 定义: • 特点:
在选择培养基上生长 报告基因与目的基因嵌和表达 研究调控区
报告基因的种类:
①新霉素磷酸转移酶（ Neomycine phosphotransferase – II, NPT II)基因
1.3 基因工程的基本步骤 目的基因的获取 基因载体的选择与构建 目的基因与载体的拼接
重组子导入受体分子
重组子的检测
外源基因的表达和产物的分离
1.4 观赏植物基因工程的目的基因
①观赏性:开花、花色、花型、花径相关基因。 ②抗逆性:抗虫、抗旱、耐盐碱、抗寒相关基因 ③切花寿命 ④花期调控
2. 基本技术及原理
LB
RB
E
Ti Plasmid
Vir 区
Con 区
Ori 区
T-DNA的结构与功 能∶
左边界 核心区 右边界
LLBB RRB
B
Vir 区操纵子的基因结构与功能
• Vir区是一段长度为35KB操纵 子
• 包含六个基因： VirA、VirB 、 VirC 、 VirD 、 VirE 、 VirG。
植物遗传转化的载体系统
表型分析鉴定
鉴定步骤： 筛选鉴定（利用质粒上的选择标记） 报告基因鉴定（利用质粒上的报告基因）
• Ti质粒
根瘤农杆菌染色体外的遗传物质，为 共价闭合环状的DNA分子。
• Ti质粒的功能 为农杆菌提供附着于植物细胞壁的能力； 参与寄主细胞合成激素的能力； 诱发植物产生冠瘿瘤； 赋予寄主分解冠瘿碱的能力； 决定寄主范围。
• Ti质粒的结构 T-DNA区 Vir 区 Con 区 Ori 区
T-DNA 区
2.1 DNA重组技术 将外源DNA片段与载体分子连接，形
成重组DNA分子，再将重组子导入寄主细 胞内。这一技术体系称为DNA重组技术。
DNA 重 组 技 术
2.1.1 目的基因的分离（或合成）
常用的几种目的基因： 基因工程的工具酶:
限制性内切酶（restriction endonuclease) DNA连接酶（ligase) 末端修饰酶
电激法介导：
利用高压脉冲
＋
作用，在原生质体
－
上形成可逆的瞬间
＋பைடு நூலகம்
－
通道，从而促进外
＋
－
源DNA的摄取。
＋
－
＋
－
＋
－
＋
－
2.2.2 转基因操作的受体系统
高频再生体系的建立： • 愈伤组织再生系统 • 直接分化再生系统 • 原生质体再生系统 • 胚状体再生系统 • 生殖细胞再生系统
抗生素敏感实验： 抑制细菌生长 杀死非转化细胞
操作步骤： 预培养 转基因操作 转基因植株筛选和培养 转基因植株的鉴定 田间释放
影响转化效率的因素： 金属微粒 DNA沉淀辅助剂 DNA纯度和浓度 微弹速度 植物材料
基因枪法的优点： 无宿主限制； 靶受体类型广泛； 可控度高； 操作简便。
问题： 转化效率低； 嵌合体多； 稳定性差，瞬时表达； 外源基因沉默； 整合机理不详。
2.2.1 外源DNA导入植物细胞的方法
• 载体介导的转化方法： 致癌农杆菌介导的Ti质粒载体转化法 病毒介导的基因转移
• DNA直接导入法： 化学法：PEG诱导的基因转化 电激法介导 显微注射
• 媒体介导法 脂质体介导 超声波介导 基因枪介导
致癌农杆菌介导的Ti质粒载体转化法
含有Ti质粒的致癌农杆菌与一些植物的细 胞接触后，Ti质粒的一部分（T-DNA）可以 导入植物细胞，整和到植物基因组DNA随其 复制。根据这一特性可构建一系列Ti质粒载 体， 与含目的片段的DNA片段重组，导入 致癌农杆菌，再采用叶盘法、原生质体培养 法、细胞培养法，通过致癌农杆菌介导进入 植物细胞。
第十七章 分子育种
1. 分子育种的概念与程序
1.1 概念 按照人们的愿望，进行严密的设计，通
过体外 DNA重组技术 和 DNA转移技术， 有目的地改造生物种性，使现有物种在短时 间内趣于完善，以创造出新的生物类型的技 术体系 ，亦即基因工程。
1.2 植物基因工程
植物基因工程是近20年来随着DNA重 组技术、植物遗传转化技术及植物组织培 养技术而发展起来的现代生物技术。
农杆菌敏感实验：
2.3 转化细胞的培养和转基因植株的再生
• 恢复生长 • 筛选培养 • 植株再生
2.4 转基因植物的鉴定
遗传鉴定
直接鉴定DNA分子是否整 合到基因组上。 1）扩增目的片段； 2）杂交信号鉴定。 （Southern 杂交）
表达鉴定
利用报告基因 Northern 杂交 Western 杂交
PEG诱导的基因转化
聚乙二醇（PEG）、多聚鸟苷酸、磷 酸钙在高PH值条件下诱导原生质体扑获 DNA分子。
步骤： 共保温； 稀释PEG； 非选择培养； 选择培养。
优点： 转化顺利，对细胞伤害小； 避免嵌合体的生成； 易于选择； 便于进行理论研究； 受体广泛。
脂质体介导：
用化学物质将 DNA包裹成球体， 通过植物原生质体的 吞噬作用，把DNA 导入细胞。
一元载体（顺势载体） 双元载体（反式载体）
农杆菌介导的转化质粒的构建
目的基因
报告基因，选择标记基因
Ampr P
G1
T
LB
P
G2
T NOS
RB
Vir区
农杆菌导入方法
• 共培养法 • 叶盘转化法 • 整株感染法 • 原生质体共培养法
基因枪介导的转基因操作：
基本原理 操作步骤 优点 影响转化效率的因素
基因工程的基本概念
转化（Transformation)：是指将外源 DNA导入受体细胞的过程。 复制子（Replicon)：具有一个复制起点 (ori) 的DNA分子称为一个复制子。 载体（Vector）：能与外源DNA连接并实 现转化的复制子。 重组子（Recombinant）：连接了外源 DNA分子的复制子。
②氯霉素乙酰基转移酶（Chloraphenicol acetyltransferase, CAT）基因
③潮霉素磷酸转移酶（Hygromycin phosphotransferase, Hpt）基因
④β – 葡萄糖酸苷酶 （β – Glucuronidase, GUS）基因
⑤荧光素酶（Luceferase, Luc）基因 ⑥抗除草剂（Basta, Bar）基因