放射性自显影法
放射自显影术
新应用领域的探索
医学影像诊断
探索放射自显影术在医学 影像诊断中的新应用，如 肿瘤检测、血管成像等。
生物科学研究
应用于生物科学研究，如 蛋白质组学、基因表达分 析等领域。
环境监测
开发放射自显影术在环境 监测领域的应用，如污染 物检测、土壤质量评估等 。
与其他技术的结合
与光学技术的结合
结合光学显微镜技术，实现更微观尺度的成像分析。
蛋白质相互作用研究
通过放射自显影术可以检测蛋白质之间的相互作 用，进一步揭示蛋白质的功能和调控机制。
3
蛋白质修饰研究
通过放射自显影术可以研究蛋白质的修饰情况， 了解蛋白质的磷酸化、乙酰化等修饰对蛋白质活 性和功能的影响。
放射自显影术涉及使用放射性物质，存在一定的 辐射危害，需要采取防护措施。
成本较高
放射自显影术需要昂贵的设备和试剂，成本较高 ，限制了其在某些领域的应用。
ABCD
操作复杂
放射自显影术需要专业的操作人员和技术条件， 操作过程较为复杂。
半衰期限制
放射自显影术使用的放射性物质具有较短的半衰 期，需要在使用前进行充分的准备和储存。
色体上确定基因的位置。
基因表达分析
通过放射自显影术可以检测基因的 表达情况，了解特定基因在不同组 织或发育阶段中的表达水平。
基因突变研究
放射自显影术可以用于检测基因突 变，通过比较正常和异常基因的标 记分布，研究突变对基因结构和功 能的影响。
在转录组学中的应用
转录本分析
放射自显影术可以用于分析转录 本的表达情况，了解特定基因在 不同条件下的转录水平。
景辐射。
显影与定影
通过显影和定影过程，将放射 性信号转化为可见的图像。
放射性自显影技术讲述
分钟。
（五）水洗及干燥
定影后要经充分水洗，以清除残余的定影剂 和未被显影的银盐。
一般要求在流水中冲洗20~30分钟，然后在空气
中晾干。
第二节 放射性自显影的制作方法
一、宏观放射性自显影的制作方法
（一）整体植株的放射性自显影
（二）放射性纸层析和薄层层析板自显影
（6） 曝光和显影时间
三、自显影效率
自显影效率 指一个入射粒子所生成显影
×曝光时间 = （0.5 ~ 1）×107 粒子/cm2
c）实验曝光法
（三）显 影
显影
指感光后形成潜影的乳胶，在显影剂 的作用下，使潜影转化为金属银的过程。
（1）显影液的组成：
显影剂：常用米吐尔，主要起还原作用。 促进剂：常用碳酸钠，维持碱性条件。 保护剂：常用亚硫酸钠，中和氧化产物。 抑制剂：常用溴化钾，抑制未感光的银盐。
明胶是溴化银的支持剂，又是溴原子的吸收剂；
它决定着乳胶的通透性、吸水膨胀、浓度稀释 和坚膜作用等特性。 而乳胶的敏感度决定于溴化银的浓度、颗粒大 小及其配制方法。
几种自显影感光材料的性能
乳胶名称
幻灯片 电影胶片 X射线乳 胶片 卤化银 卤化 晶体直 银 径（μm） (%) 晶体 灵 分 敏 辨 产品特点 粒子数 /1000 μm3 度 力
（二）染色
1. 前染
是指涂核乳胶前对切片进行染色。
优点：乳胶层不被染色，与后染相比颜色
清晰鲜明。缺点：染色处理可能引起标本中
放射性的损失；对易溶性放射性化合物不宜
采用前染。
2. 后染
是指在切片涂布核乳胶、曝光、显
影、定影后进行的染色。
优点：没有前染的放射性损失问题；
放射自显影放射自显影autoradiography放射自显影的原理是利用
放射自显影放射自显影(autoradiography)放射自显影的原理是利用放射性同位素所发射出来的带电离子(α或β粒子)作用于感光材料的卤化银晶体，从而产生潜影，这种潜影可用显影液显示，成为可见的"像"，因此，它是利用卤化银乳胶显像检查和测量放射性的一种方法。
放射性核素的原子不断衰变，当衰变掉一半时所需要的时间称为半衰期。
各种放射性核素的半衰期长短不同(表)，在自显影实验中多选用半衰期较长者。
对于半衰期较短的核素，应选用较快的样品制备方法，所用剂量也应加大。
表自显影实验中常用核素的半衰期与能量名称半寿期粒子类型能量(MeV) 名称半寿期粒子类型能量(MeV)3H 12.3 yr β 0.018 45Ca 152 d β 0.2611C 20 min β 0.981 59Fe 45 d β 0.4614C 5700 yr β 0.155 γ 1.3032P 14.3 d β 1.71 60Co 5.3 yr β 0.30835S 87.2 d β 0.167 64Cu 12.8 hr β 0.657131I 8.0 d β0.25 γ 1.35放射自显影技术放射自显影技术是利用放射性同位素的电离辐射对乳胶（含AgBr或AgCl）的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究的一种细胞化学技术。
放射自显影术（radioautogra phy；autoradiography）用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。
其原理是将放射性同位素（如14C和3H）标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光，组织中的放射性即可使乳胶感光。
然后经过显影、定影处理显示还原的黑色银颗粒，即可得知标本中标记物的准确位置和数量，放射自显影的切片还可再用染料染色，这样便可在显微镜下对标记上放射性的化合物进行定位或相对定量测定。
放射自显影基本原理与应用
射线能量低的自显影
射线能量高的自显影
放射自显影基本原理和应用
影响分辨力的主要因素：
2、样品的厚度：样品厚，组织表面和深层
中放射源的射线同时射入乳胶层，使银颗粒 分散程度加重，影像重叠，分辨力下降。样 品薄，则分辨力高，但曝光时间需加长。
放射自显影基本原理和应用
（二）显微镜自显影（light microscopic
ARG）：又称光学显微镜自显影，是借助显 微镜进行组织或细胞学观察，分辨能力要求较 高。根据银颗粒来判断示踪剂的分布部位和数 量的多少。适用于组织切片、细胞涂片等标本 的研究。可以对不同细胞进行比较，并根据不 同示踪剂在不同时间的分布，研究细胞水平的 代谢过程。制备一般采用液体乳胶法。
放射自显影基本原理和应用
第一节 基本原理
一、潜影的形成和消退 二、类型 三、常用的感光材料 四、常用的放射性核素 五、照相处理 六、放射自显影的分辨力 七、放射自显影的本底、效率
放射自显影基本原理和应用
一、潜影的形成和消退
（一）潜影形成的原理
放射自显影原理与光学摄影原理基本相似。 乳胶中的每颗溴化银晶体都是由Ag+和Br-的 点阵构成。在制作过程中，点阵存在缺陷， 这些缺陷即是潜影形成过程中的敏化中心。 射线与乳胶相互作用，引起电离作用，使 Ag+还原为Ag原子，形成潜影。
核素 半衰期 射线类型 射线平均能量（MeV）
3H 12.33年
14C 5730年 32P 14.28天 35S 87.4天 45Ca 165天 59Fe 44.6天 125I 60.2天
β β β β β β β、γ
放射性自显影法
放射性自显影法放射性自显影法与普通照相的曝光、显影、定影原理相似，此法是利用放射性同位素所放出之射线使照相乳胶“感光”，再经显影和定影处理，将乳胶中因受辐照而致敏的卤化银颗粒还原成金属银，洗去未“感光”的卤化银后则图像自然显示出来。
图像中任何区域的黑度取决于留存的金属银的量，它反映了射线在这个区域所沉积的能量。
这种方法以照相乳胶或核乳胶（卤化银颗粒更细）作为“仪器”，记录、检查和测量整体和组织、细胞和亚细胞水平中放射性示踪物的分布、进行定性和半定量测定，称为放射自显影法。
由于放射性物质往往在研究对象中呈不均匀分布，因此可利用一系列不同的图像判断放射性物质在组织或细胞中的动态关系，从而揭示精确的代谢动态过程，所以这种实验技术以其特有的功效从放射性被发现至今仍一直被广泛使用。
目前常用的自显影方法有以下几种类型：①接触法，最简单的一种，一般利用照相胶片或X光胶片，使含有放射性物质的标本表面与胶片上的乳胶层表面紧密接触，经过一定时间“曝光”后，将标本与胶片分开，胶片经过显影、定影等处理后即可得到自显影图像。
此法的分辨率受胶片上乳胶层的厚度及颗粒大小的限制，一般为10～30微米，适用于小的动、植物整体标本，大体解剖学的和组织学的切片以及薄层、纸层和电泳图谱的自显影等；②液体乳胶法，目前应用较广泛的一种。
一般是将液体乳胶直接涂布到载玻片的组织切片上，“曝光”后连同标本一起进行显影、定影、冲洗和染色，并最后封固在一起。
此法的分辨率可达1～10微米，可进行细胞内定位；③电镜自显影法，是放射自显影与电子显微镜相结合的一种新技术。
需使用颗粒均匀、大小适中、密度一般为1013银颗粒/厘米3的核乳胶。
含有标记物质的样品需制成超薄切片，切片可以捞在带支持膜的铜网上或载玻片上。
采用浸涂法、环套法或泡盖法等使乳胶形成一单晶体层敷盖在切片上，再经“曝光”、冲洗和染色等处理。
此法的分辨率可达0.05～0.1微米，能分辨DNA分子的一条链，故又称为“分子自显影法”。
第7章 放射自显影术
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• 灵敏度影响因素
– 核射线的能量：射线能量愈小，在乳胶中能量损失愈大，引起潜影的能力 核射线的能量：射线能量愈小，在乳胶中能量损失愈大，
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电泳谱
肿瘤组织切片原位杂交 检测细胞内EB病毒 检测细胞内 病毒
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五、常用核素
• 发射下列粒子流的核素： 发射下列粒子流的核素：
–α、β、β＋射线、俄歇电子、内转换电子 α 射线、俄歇电子、 –能量低的优先，因分辨率高 能量低的优先， 能量低的优先
• 如3H、14C、125I
–短T1/2的核素尽量避免用 短
– 核乳胶干板
• 涂在玻片上，直接使用；光镜ARG 、宏观 涂在玻片上，直接使用；光镜 宏观ARG
– 揭膜核乳胶
• 涂在胶质或纤维质衬底上，而衬底贴合在玻片或薄膜托片上，用时揭下 涂在胶质或纤维质衬底上，而衬底贴合在玻片或薄膜托片上， 定量光镜ARG 来；定量光镜
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液体核乳胶配方举例
• 取所需乳胶量在40℃水浴中融化后，按下列比例 取所需乳胶量在 ℃水浴中融化后， 顺序缓缓加入，并用玻棒轻轻搅匀。 顺序缓缓加入，并用玻棒轻轻搅匀。
灵敏度低；温度高，雾点增加， 灵敏度低；温度高，雾点增加，分辨率下降
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3. 本底
– 除标本内放射性核素外，由于其他原因造成银 除标本内放射性核素外， 颗粒的显影所产生的影像 1）红灯过度照射、过亮 ）红灯过度照射、 2）显影时间过长 ） 3）显影温度过高 ） 4）机械压力、张力 ）机械压力、 5）化学物质沾污 ） 6）环境放射性 ） 7）乳胶中杂质 ）
放射自显影术
放射自显影术需要使用放射性同位素作为标记物，存在一定的
放射性危害，需要采取适当的防护措施。
操作复杂
02
放射自显影术需要进行一系列的实验操作，包括标记、分离、
洗涤等步骤，操作较为复杂。
成本较高
03
放射自显影术需要使用昂贵的仪器和特殊的试剂，成本较高，
限制了其在一些实验室和临床环境中的应用。
未来展望
技术改进
原理
放射自显影术利用放射性同位素发出的射线，在感光材料上产生感光效应，从 而形成图像。由于放射性同位素在不同组织或细胞内的分布不同，因此可以通 过图像分析来确定标记物的位置和浓度。
发展历程
19世纪末，科学家发现放射性 同位素及其在生物体内的分布
；
20世纪初，放射自显影术开始 应用于生物学和医学领域；
03
放射自显影术的应用
生物学研究
染色体研究
通过放射自显影术，可以对染色 体进行定位和计数，有助于研究
染色体的结构和变异。
细胞生物学研究
放射自显影术可以用于标记细胞内 的特定分子或结构，从而研究其在 细胞内的分布、功能和动态变化。
分子生物学研究
通过放射自显影术，可以对DNA、 RNA和蛋白质进行标记和追踪，有 助于研究基因表达、蛋白质合成和 代谢等过程。
定位准确
通过标记特定分子或细胞成分，放射 自显影术能够准确地定位这些分子或 细胞在组织或器官中的位置。
定量分析
通过测量放射性信号的强度，可以对 标记物的数量进行定量分析，提供更 精确的生物学信息。
无创性
放射自显影术是一种非侵入性的技术 ，不会对生物样本造成损伤，可以重 复进行实验。
缺点
放射性危害
01
随着技术的不断发展，放射自显影术有望在灵敏度、特异性、操作 简便性和降低成本等方面得到进一步改进。
放射性自显影流程
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下面我将介绍其详细流程。
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二、放射性自显影法中的潜影是怎么形成的？
1、发射电子：核射线与溴化银作用，使其电离，发射出
电子，向敏化中心移动形成阴电层。
AgBr+β粒子→Ag++Br-+e2、 Ag+的还原：Ag+向敏化中心移动，与e-结合，还原成 银原子。e-+Ag+ →Ag 3、潜影形成：还原的银原子起催化作用，致周围的Ag+被
示踪技术之放射性自显影法
(Autoradiography，ARG)
放射性自显影法
一、什么是放射性自显影法？
放射性自显影法是一种光化学过程。用作示踪剂的放射 性核素所产生的射线使乳胶感光形成潜影，经显影、定 影处理，就可将已形成潜影的银离子迅速还原为黑色的
银颗粒，而溶去未形成潜影的银离子，出现图像。
20世纪70年代后，低能量的放射性同位素的应用以及精密定标器的制成， 提高了其分辨率。同时结合了微量密度计的扫描手段和一定的数学处理， 使该项技术初步达到定量测量的要求。 20世纪80年代初以来，放射性自显影技术得到进一步完善，即根据Passioura 提出的计算方程式，研究放射性分布曲线与扫描所得的密度曲线之间的关系， 校正自显影图像。
四、为什么要使用放射性自显影法？
最大特点：*能定位放射性示踪剂在样品中的准确分布，生动、
直观，比起基于电离和闪烁作用的放射性探测器只能测定整个 样品进入探测器灵敏区的总放射性有很大的优越性。 *能精确定位微观区域中放射性物质的存在与分布；且探测效率较 高，可累积记录入射的放射性，在植物生长过程中可以反复形 成放射性影像，借此观察养分随时间的变化过程。此外这种方 法操作方便，设备简单，研究资料便于长久保存。
局限性：定量上误差较大，只能作相对定量，只能得到一个总
量的概念，对养分的状况无法区分，测定速度低，在微弱的放 射性条件下需要很长曝光时间。
五、自显影片的制备方法
重要制备 方法
接触法
液体核 乳胶浸 膜法
揭膜乳 胶法ຫໍສະໝຸດ 1、接触法在暗室中，将标本面与感光胶片或核乳胶干板 的乳胶面密切接触，进行曝光而制备自显影的方 法称为接触法。标本与感光材料均不接触水或有 机溶剂，不会造成示踪剂的扩散或流失，适用于
将一小块胰腺组织放在加有
放射性同位素标记氨基酸的培养
液中进行短暂培养，在此期间，
活细胞就会摄取具有放射性的氨 基酸并掺入到核糖体合成的消化 酶中，然后立即将组织进行固定 ，通过切片和放射自显影检测， 发现放射性出现在内质网，说明 蛋白质的合成始于内质网。
放射性自显影法在根际研究中的应用 例：放射性自显影法在根际研究中的应用： 采用薄层涂片自显影技术研究不同植物和 不同介质中养分的根际微域分布。 如在沙壤土、高岭土和蒙脱土的混合介质上 用86Rb和32P对玉米和箭筈豌豆根系的养分 吸收进行研究，以探求根系特性对根际养 分分布的影响，以及养分离子在根际的亏 缺趋势与介质的吸附性能之间存在的联系 等。
还原，形成潜影。
Ag ……Ag →nAg
潜影经显影液和定影液处理即成为自显影图像。
三、放射性自显影法的起源和发展
在生物学上的应用始于1940年伦登(E.S.London)的研究，他获得了 吸入镭气曝射过的青蛙皮的放射自显影。
20世纪20年代以来，在生物科学研究领域中逐渐应用广泛， 成为放射性同位素示踪法的一项常用实验技术。 20世纪60年代的Walker等人开始将这种方法应用于土壤根际微区的研究。
各种实验。
2、液体核乳胶浸膜法
在暗室中，将标本或载有标本的玻片浸入适当稀释的液 体核乳胶中，使标本表面敷上一层薄而均匀的乳胶膜，干
燥后曝光而制备处显影的方法称液体核乳胶浸膜法。在浸
膜过程中，标本要与含水的液体核乳胶接触，会造成扩散 性示踪剂一定程度的扩散和流失，故只适用于非扩散性示 踪实验。
3、揭膜乳胶法
将揭膜乳胶膜从玻璃基片上揭下来，在温水中展开， 浸透，然后将其贴于标本表面，干燥后曝光而制备自显影
。揭膜乳胶厚度均匀，该法常用于光镜自显影的定量研究
。因需在水中进行，故适用于非扩散性示踪实验。
放射性自显影法的应用
应用:用放射性自显影可动态观察生理 或病理状态下放射性核素标记的各 种试剂、毒物、营养物质等在脏器 、组织、细胞中的分布、转运、蓄 积和排泄，以研究其代谢规律、作 用部位及作用机理。
Thanks!
组员：陈姣姣、杨光琴、刘雪薇、秦 岭、张周波、蒲强、陶文广、汪家志 2013-12-3