绿色荧光蛋白分子实验 PPT
合集下载
绿色荧光蛋白(GFP) 的特性及其在分子生物学研究中 的应用课件
3 GFP的稳定性
❖ GFP荧光极其稳定,在荧光显微镜强光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素 (fluorescein)强[19]。特别在450~490 nm蓝光波长下更稳定,但在340~390 nm或395~440 nm范围内,仍会发生光漂白现象。GFP在不同物种中稳定性不同,在果蝇和斑纹鱼(Zebra fish)中极稳定;在大肠杆菌中会有光漂白;在线虫中10 mM的NaN3将加速光漂白。GFP需要 在氧化状态下产生荧光,强还原剂如5 mM Na2S2O4或2 mM FeSO4能使GFP转变为非荧 光形式,但一旦重新暴露在空气或氧气中,GFP荧光便立即得到恢复。而一些弱还原剂,如2% 巯基乙醇、10 mM DDT、10 mM还原谷胱甘肽、10 mM半胱氨酸等并不影响GFP荧光。 中度氧化剂对GFP荧光影响也不大,如生物材料的固定、脱水剂戊二酸或甲醛等,但GFP对 某些封片指甲油特别敏感,苯氧丙烷对GFP荧光也有影响。强氧化剂如1% H2O2,或硫氢基 试剂如1 mM DTNB会造成GFP不可逆性破坏[20]。大多数中等浓度的有机试剂不减弱GFP 荧光,但其最大吸收峰值会改变[21]。在高蛋白、高盐条件下,GFP通过疏水反应形成二聚体, 使470 nm吸收峰值下降近4倍。GFP很容易从细胞中分离并结晶[22]。在离体状态下,GFP 蛋白对热(70℃)、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通蛋白酶(链霉蛋白酶Pronase 除外)有较强抗性[23]。GFP荧光在pH值为7~12时稳定,在pH值为5.5~7.0时开始受影响[24]。 在纳克级水平,SDS-聚丙烯酰胺电泳凝胶中仍能观察到GFP荧光。在高温、极端pH、或胍 基氯化物条件下,GFP会变性,荧光消失。一旦复性,荧光会部分恢复[25],但可能需要某些硫 醇类化合物的作用[26]。GFP在各种生物活体条件下表现稳定。例如氯霉素乙酰转移酶 (CAT)在生物体内很稳定,用35S-甲硫氨酸分别标记CAT和GFP,并转染玉米叶肉原生质体,用 放线菌酮处理原生质体,通过CAT检测,发现5~10μg/ml放线菌酮可完全抑制CAT在玉米原生 质体中的蛋白合成,但通过GFP观察,转染24小时后,仍未发现GFP荧光有明显减弱,仅有部分 GFP被放线菌酮降解。说明GFP在植物活体细胞中比CAT还要稳定[27]。此外,尽管GFP的 消光系数较低,但和荧光素一样,额定含量可高达80%。在荧光显微镜下,GFP融合蛋白的荧 光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高,抗光漂白能力强,因此更适用于定量测定与分析。 但因为GFP不是酶,荧光信号没有酶学放大效果,因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋 白。由于GFP荧光是生物细胞的自主功能,荧光的产生不需要任何外源反应底物,因此GFP 是迄今为止唯一一种活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。
绿色荧光蛋白gfp标记方法参考PPT
结果，并记录
2021/5/9
5
二.X-3感受态细胞的制备
1.从LB固体平板上挑取新鲜的x-3菌株单菌落于 50 ml LB液体培养基中，30℃，170 r/min 振荡 培养过夜，按照 1%接种比例接入100 ml LB液 体培养基中，30℃，170 r/min 振荡培养，每1 h 测定1 次 OD600
3.电转仪：伯乐MicroPulser电穿孔仪 4.立体荧光显微镜：（Leica MZ12）为瑞士莱卡仪器公司产品 5.荧光显微镜：ECLIPSE 80i高级研究型显微镜 6.离心机：EPPENDORF 7.凝胶成像仪：BIO-RAD Universal Hood Gel-Doc UV Imaging 8.质粒DNA：购自AxyGEN生产的AxyPrep质粒DNA
2
GFP标记
菌落观察
2021/5/9
油镜观察
3
本实验所需的的材料
1.LB培养基：蛋白胨 10g，NaCl 10 g，酵母浸膏5 g，蒸馏水 1000ml，pH 7.0 2.抗生素壮观霉素（Spectinomycine Spe）购自Sigma公司 3.PEB洗涤液：蔗糖93.1g， MgCl2 0.2g，KH2PO4 0.953g,H2O 1000ml, pH 7.4
System
2021/5/9
4
一.gfp质粒的提取
1.先在卡那培养基上过夜培养菌液，然后提取该菌液进行实验
2.按照AxyGEN生产的AxyPrep质粒DNA说明书上的方法进行相 关操作
3.采用1%琼脂糖凝胶电泳进行质粒DNA检测 a.凝胶制备：琼脂糖 （1g）+TAE（100ml） → 微波滴在制胶板上，同时做mark对照 c.140v，30min d.电泳结束后，用紫外凝胶成像仪和紫外凝胶成像系统观察
2021/5/9
5
二.X-3感受态细胞的制备
1.从LB固体平板上挑取新鲜的x-3菌株单菌落于 50 ml LB液体培养基中，30℃，170 r/min 振荡 培养过夜，按照 1%接种比例接入100 ml LB液 体培养基中，30℃，170 r/min 振荡培养，每1 h 测定1 次 OD600
3.电转仪：伯乐MicroPulser电穿孔仪 4.立体荧光显微镜：（Leica MZ12）为瑞士莱卡仪器公司产品 5.荧光显微镜：ECLIPSE 80i高级研究型显微镜 6.离心机：EPPENDORF 7.凝胶成像仪：BIO-RAD Universal Hood Gel-Doc UV Imaging 8.质粒DNA：购自AxyGEN生产的AxyPrep质粒DNA
2
GFP标记
菌落观察
2021/5/9
油镜观察
3
本实验所需的的材料
1.LB培养基：蛋白胨 10g，NaCl 10 g，酵母浸膏5 g，蒸馏水 1000ml，pH 7.0 2.抗生素壮观霉素（Spectinomycine Spe）购自Sigma公司 3.PEB洗涤液：蔗糖93.1g， MgCl2 0.2g，KH2PO4 0.953g,H2O 1000ml, pH 7.4
System
2021/5/9
4
一.gfp质粒的提取
1.先在卡那培养基上过夜培养菌液，然后提取该菌液进行实验
2.按照AxyGEN生产的AxyPrep质粒DNA说明书上的方法进行相 关操作
3.采用1%琼脂糖凝胶电泳进行质粒DNA检测 a.凝胶制备：琼脂糖 （1g）+TAE（100ml） → 微波滴在制胶板上，同时做mark对照 c.140v，30min d.电泳结束后，用紫外凝胶成像仪和紫外凝胶成像系统观察
绿色荧光蛋白(GFP)PPT课件
他与Tulle Hazelrigg结了婚。 她后来加入了哥大。她允许他引用 她在"Green Fluorescent Protein as a Marker for Gene Expression"上的未发表研究，条件 是他在一个月的时间内煮咖啡、做 饭、每晚倒垃圾。
.
8
2008年诺贝尔化学奖获得者
C:\Users\Administrator\Desktop\分子细胞\钱永健希望更多中 国青年投身基础研究_标清.mp4
.
2
2008年诺贝尔化学奖获得者
下村修
1928年出生于日本京都市， 毕业于名古屋大学，是日本化 学家、海洋生物学。
1960年开始，在美国普林 斯顿大学学者约翰逊的邀请下 ，前往美国，先后在普林斯顿 大学、波士顿大学和麻省伍兹 霍尔海洋生物实验所工作。
.
3
2008年诺贝尔化学奖获得者
下村修
1961年，下村修等人从大量的多管水 母属中分离了水母素及腔肠素。他们发现 生物发光是由钙离子引发的。这项研究开 展了对绿色荧光蛋白的研究。
1962年，他从一种水母中发现了荧光 蛋白，被誉为生物发光研究第一人。
维多利亚多管发光水母能够放出蓝色的荧光。这是 透过快速释放与水母素相互作用的钙离子（Ca2+）生 成的。所放出的蓝光会被绿色荧光蛋白转变为绿光。水 母素和绿色荧光蛋白都是生物学研究的重要工具。
C:\Users\Administrator\Desktop\分子细胞\机制.mp4 C:\Users\Administrator\Desktop\分子细胞\TED.mp4
.
20
绿色荧光蛋白的应用前景
肿瘤切除手术的现状： 凭借医生经验，难以根除，容易残留 ，容易转移。
.
8
2008年诺贝尔化学奖获得者
C:\Users\Administrator\Desktop\分子细胞\钱永健希望更多中 国青年投身基础研究_标清.mp4
.
2
2008年诺贝尔化学奖获得者
下村修
1928年出生于日本京都市， 毕业于名古屋大学，是日本化 学家、海洋生物学。
1960年开始，在美国普林 斯顿大学学者约翰逊的邀请下 ，前往美国，先后在普林斯顿 大学、波士顿大学和麻省伍兹 霍尔海洋生物实验所工作。
.
3
2008年诺贝尔化学奖获得者
下村修
1961年，下村修等人从大量的多管水 母属中分离了水母素及腔肠素。他们发现 生物发光是由钙离子引发的。这项研究开 展了对绿色荧光蛋白的研究。
1962年，他从一种水母中发现了荧光 蛋白，被誉为生物发光研究第一人。
维多利亚多管发光水母能够放出蓝色的荧光。这是 透过快速释放与水母素相互作用的钙离子（Ca2+）生 成的。所放出的蓝光会被绿色荧光蛋白转变为绿光。水 母素和绿色荧光蛋白都是生物学研究的重要工具。
C:\Users\Administrator\Desktop\分子细胞\机制.mp4 C:\Users\Administrator\Desktop\分子细胞\TED.mp4
.
20
绿色荧光蛋白的应用前景
肿瘤切除手术的现状： 凭借医生经验，难以根除，容易残留 ，容易转移。
绿色荧光蛋白PPT模板.ppt
用荧光蛋白在鼠脑中绘制的油画
3.3 小动物体内恶性肿瘤生长过程及药物作用效果 的实时光学成像监测：
No Image
(a) 整体荧光成像系统示意图．(b)整体荧光成像监测2 胰腺癌细胞(表达红色荧光蛋白)的生长以及治疗效果．肿 瘤细胞种植后10，17，24，48 和56 天分别进行成像．粗箭头表示原位灶．细箭头表示转移灶．与对照组进行 比， 药物部分抑制原位灶和转移灶的生长，而 药物则在一个月内大大抑制肿瘤的生长，但是一个月之后，继
2. 发光机制： 生色团是由其中的三件下 不能形成荧光．生色团通过66 的脱质子 (酚盐)和质子化状态(羟酚基)的转换决定荧光发射。
生色团的66 和67 相对比较保守，而65相对易变，因此可用其他氨基酸替 换。
3. 典型应用：
3.1 技术 ——活细胞内基因表达及蛋白质-蛋白质相互作用的光学成像与可视化
R
C
Y
C
3.2 不同神经元的多色标记与光学成像:
结合其他颜色荧光蛋白，比如红色荧光 蛋白，可对同一个细胞的不同细胞器和不同 细胞进行标记．其中最具代表性的实验莫过 于2007 年的“脑虹”。
哈佛大学的研究人员通过转基因技术将 不同光谱的荧光蛋白基因整合进实验老鼠的 基因组，并且只让它们在老鼠脑神经元表 达．
谢谢！
绿色荧光蛋白
化 基：张 赫 学 号：2
2008年，诺贝尔化学奖：
Y.
目录：
发
典
结
光
型
展
构
机
应
望
制
用
1. 绿色荧光蛋白的结构：
: 分子量27 238个氨基酸残基 11个β折叠 位于圆桶中央的α螺 旋含有一个含6肽组 成的发光中心
N端 C端
大学精品课件：2015年第05讲+GFP绿色荧光蛋白
4
5
下村修从大量的维多 利亚水母中分离出的 蛋白，在UV照射下 发出绿色荧光
水母素与钙离子结合-发出蓝光 蓝光被GFP吸收，发出荧光
6
钱永健，Roger Tsien
Professor，美国科学院院士 Department of Chemistry, UCSD
主要贡献: 系统地研究了绿色荧光蛋白的工作原理， 并对它进行了大刀阔斧的化学改造， 不但大大增强了它的发光效率， 还发展出了红色、蓝色、黄色、青色荧光蛋白
12
Chalfie，查尔非
Professor, Columbia University
线虫体内表达了绿色荧光蛋白
13
14
荧光蛋白的结构解析
15
维多利亚水母GFP由238个AA组成，分子量约27kD
16
17
Topology structure (拓扑结构分析）
18
荧光生色AA为65,66,67
33
GFP用于药物筛选
34
GFP用于肿瘤研究
35
GFP用于细胞定位研究
36
37
利用GFP观察病毒入侵宿主
38
39
40
41
42
43
可用于检测重金属离子污染
44
45
46
中国首例有GFP转基因荧光猪
47
48
能发绿色荧光的油菜(UV light)
49
GFP“调色板”
50
51
“Methods for tumor diagnosis and therapy” US Patent 20030021791
55
计算机辅助设计的探针分子
Extracellular PAP (Prostatic Acid Phosphatase)
5
下村修从大量的维多 利亚水母中分离出的 蛋白，在UV照射下 发出绿色荧光
水母素与钙离子结合-发出蓝光 蓝光被GFP吸收，发出荧光
6
钱永健，Roger Tsien
Professor，美国科学院院士 Department of Chemistry, UCSD
主要贡献: 系统地研究了绿色荧光蛋白的工作原理， 并对它进行了大刀阔斧的化学改造， 不但大大增强了它的发光效率， 还发展出了红色、蓝色、黄色、青色荧光蛋白
12
Chalfie，查尔非
Professor, Columbia University
线虫体内表达了绿色荧光蛋白
13
14
荧光蛋白的结构解析
15
维多利亚水母GFP由238个AA组成，分子量约27kD
16
17
Topology structure (拓扑结构分析）
18
荧光生色AA为65,66,67
33
GFP用于药物筛选
34
GFP用于肿瘤研究
35
GFP用于细胞定位研究
36
37
利用GFP观察病毒入侵宿主
38
39
40
41
42
43
可用于检测重金属离子污染
44
45
46
中国首例有GFP转基因荧光猪
47
48
能发绿色荧光的油菜(UV light)
49
GFP“调色板”
50
51
“Methods for tumor diagnosis and therapy” US Patent 20030021791
55
计算机辅助设计的探针分子
Extracellular PAP (Prostatic Acid Phosphatase)
GFP绿色荧光蛋白课件
Orthotopic transplantation of intact tissue Metastatic sites
lymph nodes liver lung pancreas adrenal gland kidney peritoneum Green Fluorescent Protein expression
为此,Yang 等在欲检测的器官做一个可逆性的皮瓣,观察时打开 皮瓣,建立一条荧光通路,大大提高了检测的敏感性,从而可检测出 脑内、肝内单个肿瘤细胞,以及由数个肿瘤细胞形成的肺内微小 瘤灶。
GFP绿色荧光蛋白
近年来，随着研究的进一步深入，有 越来越多的模型用于研究。
Bladder cancer models Features
GFP绿色荧光蛋白
为了克服上述缺陷,Yang 等建立了一 种在活体内可连续、重复、动态观察 肿瘤细胞生长及瘤体形成过程的方法。
GFP绿色荧光蛋白
GFP绿色荧光蛋白
External whole-body images of the BxPC-3-GFP primary tumor compared with internal images. A, fluorescent images of the primary pancreatic tumor (P), omental (O), bowel (B), and spleen (S) metastases. B, an image of the same mouse after laparotomy internally localized the external images of metastatic tumors.
研究肿瘤生长、浸润和转移的传统方法是将载瘤动物分阶段处 死,做成光学或免疫组化切片进行观察,或采用CT、ECT、MRI、 PET 等影像仪器进行检测。为了详细了解肿瘤的生物学行为特 征,即使使用大量的动物和昂贵的设备,也难以对肿瘤细胞的生长、 瘤体形成过程进行连续、动态的观察。
lymph nodes liver lung pancreas adrenal gland kidney peritoneum Green Fluorescent Protein expression
为此,Yang 等在欲检测的器官做一个可逆性的皮瓣,观察时打开 皮瓣,建立一条荧光通路,大大提高了检测的敏感性,从而可检测出 脑内、肝内单个肿瘤细胞,以及由数个肿瘤细胞形成的肺内微小 瘤灶。
GFP绿色荧光蛋白
近年来，随着研究的进一步深入，有 越来越多的模型用于研究。
Bladder cancer models Features
GFP绿色荧光蛋白
为了克服上述缺陷,Yang 等建立了一 种在活体内可连续、重复、动态观察 肿瘤细胞生长及瘤体形成过程的方法。
GFP绿色荧光蛋白
GFP绿色荧光蛋白
External whole-body images of the BxPC-3-GFP primary tumor compared with internal images. A, fluorescent images of the primary pancreatic tumor (P), omental (O), bowel (B), and spleen (S) metastases. B, an image of the same mouse after laparotomy internally localized the external images of metastatic tumors.
研究肿瘤生长、浸润和转移的传统方法是将载瘤动物分阶段处 死,做成光学或免疫组化切片进行观察,或采用CT、ECT、MRI、 PET 等影像仪器进行检测。为了详细了解肿瘤的生物学行为特 征,即使使用大量的动物和昂贵的设备,也难以对肿瘤细胞的生长、 瘤体形成过程进行连续、动态的观察。
分子生物学实验课件
• 与诱导前对照比较，可知诱导效率较好，蛋白表达量较多 ，成功率高。
参考文献
1.马金石. 绿色荧光蛋白[ J] . 化学通报, 2009, 72( 3) : 243 250.
2. 季爱加, 宁喜斌 原核表达载体 pET28a EGFP 的构建与表 达 微生物学杂志 2011 年7 月第31 卷 第4 期
• 继续培养，分别在1、2、3h和过夜培养后各取1mL样品，作为诱导后 的样品。
• 每次取1mL样品置于Eppendorf管中，冰浴待用。诱导完后，将样品 5000r/min离心5min，回收上清液进行下一步实验或者保存在-20℃冰 箱中。
检测：SDS-PAGE原 理
聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。
制备感受态细胞
制备E.coli BL21(DE3)的感受态细胞——CaCl2法
（一）受体菌培养 1.从LB平板上挑取新活化的E.coli菌落，接种于5 ml LB培养基中，37 ℃振荡培养过夜。 2.以2%接种量将过夜菌培养的E.coli接种于5 ml LB培养基中，37 ℃振 荡培养2-3 h，至菌浓度OD600=0.3-0.5 （二）感受态制备 1.将培养液冰浴20 min，取1.5ml菌液于无菌EP管中，4℃离心6000 rpm ，5 min. 2.重复上述操作，收集4.5ml菌液的菌体. 3.以预冷的800μLCaCl2轻悬菌体，冰上放置10min，4℃离心6000rpm，5 min.4.弃上清，加入100μL预冷CaCl2轻轻悬浮细胞，冰上放置数分钟后 即为感受态细胞悬液。
• 分别取过夜培养物100μL接种于10mL含100μg/mL卡那霉素的LB液体 培养基，37℃恒温培养1~2h。
• 当细菌浓度A600达到0.4~0.6时，分别取出样品1mL作为IPTG诱导前的 样品，其余样品中添加100mmol/L的IPTG至终浓度为2mmol/L，其中一 瓶实验组不加IPTG的对照。
参考文献
1.马金石. 绿色荧光蛋白[ J] . 化学通报, 2009, 72( 3) : 243 250.
2. 季爱加, 宁喜斌 原核表达载体 pET28a EGFP 的构建与表 达 微生物学杂志 2011 年7 月第31 卷 第4 期
• 继续培养，分别在1、2、3h和过夜培养后各取1mL样品，作为诱导后 的样品。
• 每次取1mL样品置于Eppendorf管中，冰浴待用。诱导完后，将样品 5000r/min离心5min，回收上清液进行下一步实验或者保存在-20℃冰 箱中。
检测：SDS-PAGE原 理
聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。
制备感受态细胞
制备E.coli BL21(DE3)的感受态细胞——CaCl2法
（一）受体菌培养 1.从LB平板上挑取新活化的E.coli菌落，接种于5 ml LB培养基中，37 ℃振荡培养过夜。 2.以2%接种量将过夜菌培养的E.coli接种于5 ml LB培养基中，37 ℃振 荡培养2-3 h，至菌浓度OD600=0.3-0.5 （二）感受态制备 1.将培养液冰浴20 min，取1.5ml菌液于无菌EP管中，4℃离心6000 rpm ，5 min. 2.重复上述操作，收集4.5ml菌液的菌体. 3.以预冷的800μLCaCl2轻悬菌体，冰上放置10min，4℃离心6000rpm，5 min.4.弃上清，加入100μL预冷CaCl2轻轻悬浮细胞，冰上放置数分钟后 即为感受态细胞悬液。
• 分别取过夜培养物100μL接种于10mL含100μg/mL卡那霉素的LB液体 培养基，37℃恒温培养1~2h。
• 当细菌浓度A600达到0.4~0.6时，分别取出样品1mL作为IPTG诱导前的 样品，其余样品中添加100mmol/L的IPTG至终浓度为2mmol/L，其中一 瓶实验组不加IPTG的对照。
GFP-绿色荧光蛋白课件PPT
可以提高GFP在实际应用中的表现。
05
gfp在生物技术中的应用
示踪和标记技术
1 2 3
细胞内定位
利用绿色荧光蛋白的特性，可以将其与目标蛋白 融合，通过观察荧光信号，确定目标蛋白在细胞 内的位置和动态变化。
病毒追踪
在病毒研究中，绿色荧光蛋白可以标记病毒，通 过观察荧光信号，追踪病毒在细胞内的复制和传 播过程。
稳定性好
gfp具有较好的热稳定性和化学稳 定性，能够在较为极端的环境条 件下保持较为稳定的荧光特性。
03
gfp的表达和纯化
在大肠杆菌中表达gfp
01
02
03
表达系统
使用pET系列载体，将目 的基因插入到载体中，通 过转化到大肠杆菌中实现 表达。
表达条件
通过调节温度、诱导剂浓 度等条件，控制目的基因 的表达量。
提高荧光强度
总结词
通过定点突变技术，对绿色荧光蛋白（GFP）的关键氨基酸进行改造，以提高其荧光强 度。
详细描述
在野生型GFP中，存在一些关键的氨基酸残基，如色氨酸、酪氨酸和组氨酸等，它们对 荧光强度起着重要作用。通过将这些氨基酸替换为发光能力更强的氨基酸，如荧光素、
雷氯毒素等，可以显著提高GFP的荧光强度。
海洋生物学
用于研究海洋生物的行为、生态和 生物发光现象等。
gfp在科学研究中的重要性
gfp作为重要的生物标记工具， 为科学研究提供了可视化手段， 使得科学家能够直观地观察和了 解细胞和生物体内的动态变化。
gfp的应用促进了跨学科的合作 与交流，推动了生命科学领域的
发展。
gfp的成功应用证明了基因工程 技术的巨大潜力和价值，为未来 的科技发展提供了新的思路和方
THANKS
05
gfp在生物技术中的应用
示踪和标记技术
1 2 3
细胞内定位
利用绿色荧光蛋白的特性，可以将其与目标蛋白 融合，通过观察荧光信号，确定目标蛋白在细胞 内的位置和动态变化。
病毒追踪
在病毒研究中，绿色荧光蛋白可以标记病毒，通 过观察荧光信号，追踪病毒在细胞内的复制和传 播过程。
稳定性好
gfp具有较好的热稳定性和化学稳 定性，能够在较为极端的环境条 件下保持较为稳定的荧光特性。
03
gfp的表达和纯化
在大肠杆菌中表达gfp
01
02
03
表达系统
使用pET系列载体，将目 的基因插入到载体中，通 过转化到大肠杆菌中实现 表达。
表达条件
通过调节温度、诱导剂浓 度等条件，控制目的基因 的表达量。
提高荧光强度
总结词
通过定点突变技术，对绿色荧光蛋白（GFP）的关键氨基酸进行改造，以提高其荧光强 度。
详细描述
在野生型GFP中，存在一些关键的氨基酸残基，如色氨酸、酪氨酸和组氨酸等，它们对 荧光强度起着重要作用。通过将这些氨基酸替换为发光能力更强的氨基酸，如荧光素、
雷氯毒素等，可以显著提高GFP的荧光强度。
海洋生物学
用于研究海洋生物的行为、生态和 生物发光现象等。
gfp在科学研究中的重要性
gfp作为重要的生物标记工具， 为科学研究提供了可视化手段， 使得科学家能够直观地观察和了 解细胞和生物体内的动态变化。
gfp的应用促进了跨学科的合作 与交流，推动了生命科学领域的
发展。
gfp的成功应用证明了基因工程 技术的巨大潜力和价值，为未来 的科技发展提供了新的思路和方
THANKS
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
不要用经过多次转接或储存于４℃的培养菌，最好从－ 70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态 细胞。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通 过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600 为0.5 时,细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不 同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。
实验结果
PCR产物回 收的检验 电泳图。
条带清晰。
3、目的基因与载体的连接
原理：在Mg2 和ATP存在下，T4 DNA连接酶能催化 载体分子的粘性末端与外源DNA的相同粘性末端联 接成重组DNA分子。
影响DNA连接反应的因素：
1、连接缓冲液的影响：20-100mmol/L的Tris-HCl，较多
4、连接产物转化大肠杆菌
实验原理：转化( Transformation )是将异源 DNA 分子引入另一原核细胞，使受体细胞获得新的遗 传性状的一种手段，它是微生物、分子遗传、基 因工程等研究的基本实验技术。
感受态细胞：在自然条件下,很多质粒都可通过细菌 接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载 体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能 自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如 需将质粒载体转移进受体细菌，需将对数生长期的 细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜的通 透性发生暂时性改变，成为能允许外源 DNA 分子 进入的细胞，称感受态细胞。
绿色荧光蛋白报告基因的克隆
1. PCR扩增获得目的基因
基本原理：多聚酶链式反应是DNA的 体外酶促扩增。是利用两个短的单链 引物，在体外快速扩增特异DNA片段 的技术。应用热稳定的聚合酶，通过 双链DNA模板的热变性、引物退火和 引物延伸的重复循环，使目的DNA片 段在一定时间以指数方式增加百万倍。
4、退火温度对PCR的特异性有较大影响。
5、变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增 失败。
6、循环数——过多易产生非特异扩增。
7、酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶 的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴 乙锭。
8、引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是 PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引 物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效 率的不对称扩增。
影响因素：
1、dNTP的质量与浓度——dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密 切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。
2、模板（靶基因）核酸——模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败 与否的关键环节之一。
3、Mg2+浓度——Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响， 在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为 1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特 异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
大家应该也有点累了，稍作休息
大家有疑问的，可以询问和交流
10
3、 酶浓度的影响：日常使用的DNA浓度比
酶单位定义状态低10-20倍，连接平末端时酶用
量要比连接黏端大10-100倍。
4、 DNA浓度的影响：要求得到环化的有效
连接产物， DNA浓度不可过高，一般不会超过 20nmol/L。要求线性化的连接产物， DNA的浓 度可以高些，至少是接近推荐的浓度。
3、注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带 模糊ห้องสมุดไป่ตู้条带缺失的现象。乙醇沉淀可以去除多余的盐， 用酚可以去除蛋白。
4、注意变性的DNA样品可能导致条带模糊和缺失，也 可能出现不规则的DNA条带迁移。在上样前不要对DNA 样品加热，用20mM NaCl缓冲液稀释可以防止DNA变性。
5、正确的DNA上样量是条带清晰的保证。注意太多的 DNA上样量可能导致DNA带型模糊，而太小的DNA上 样量则导致带信号弱甚至缺失。
注意事项及影响因素：
1.对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5~2%之间，低浓 度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小 片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼 脂糖是解决办法。注意高浓度的胶可能使分子大小相近 的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。
2、电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注 意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升， 缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则 的DNA带迁移的现象。
实验结果
pcr扩增获得 目的基因的 凝胶电泳图
PCR产物
模板跑胶条带 几乎看不到。
引物
2、凝胶电泳回收目的基因
基本原理：DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应 和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负 电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上 的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电 荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。
用50mmol/L，pH的范围在7.4-7.8，目的是提供合适酸碱 度的连接体系； 25-50ug/ml的BSA，作用是增加蛋白质 的浓度，防止因蛋白浓度过稀而造成酶的失活。 2、 连接温度与时间的影响：因为黏性末端的DNA双链 间有氢键的作用，所以温度过高会使氢键不稳定，传统 上将连接温度定为16℃，时间为4-16h。现经实验发现， 对于一般的黏性末端来说，低温连接较长的时间可取得 较好的连接效果。
试验方法——热休克法
10 L载 体DNA
40L感 受态菌
On ice混合， 静置10min
200L转化液 +16ulIPTG+40u lX-Gal，涂含抗
菌素的平板
37℃摇1h
42ºC 45秒
加入1mL LB培养基
检验是否从大肠杆菌中提取出质粒DNA 的电泳图。
影响转化率的因素
➢细胞生长状态和密度:
9、变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极 有可能出现假阴性；退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异 性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效 率。
10、靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整 个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性；二是空气中的小片段 核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼 接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生。
实验结果
PCR产物回 收的检验 电泳图。
条带清晰。
3、目的基因与载体的连接
原理：在Mg2 和ATP存在下，T4 DNA连接酶能催化 载体分子的粘性末端与外源DNA的相同粘性末端联 接成重组DNA分子。
影响DNA连接反应的因素：
1、连接缓冲液的影响：20-100mmol/L的Tris-HCl，较多
4、连接产物转化大肠杆菌
实验原理：转化( Transformation )是将异源 DNA 分子引入另一原核细胞，使受体细胞获得新的遗 传性状的一种手段，它是微生物、分子遗传、基 因工程等研究的基本实验技术。
感受态细胞：在自然条件下,很多质粒都可通过细菌 接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载 体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能 自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如 需将质粒载体转移进受体细菌，需将对数生长期的 细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜的通 透性发生暂时性改变，成为能允许外源 DNA 分子 进入的细胞，称感受态细胞。
绿色荧光蛋白报告基因的克隆
1. PCR扩增获得目的基因
基本原理：多聚酶链式反应是DNA的 体外酶促扩增。是利用两个短的单链 引物，在体外快速扩增特异DNA片段 的技术。应用热稳定的聚合酶，通过 双链DNA模板的热变性、引物退火和 引物延伸的重复循环，使目的DNA片 段在一定时间以指数方式增加百万倍。
4、退火温度对PCR的特异性有较大影响。
5、变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增 失败。
6、循环数——过多易产生非特异扩增。
7、酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶 的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴 乙锭。
8、引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是 PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引 物合成质量有问题，两条引物一条浓度 高，一条浓度低，造成低效 率的不对称扩增。
影响因素：
1、dNTP的质量与浓度——dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密 切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。
2、模板（靶基因）核酸——模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败 与否的关键环节之一。
3、Mg2+浓度——Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响， 在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为 1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特 异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
大家应该也有点累了，稍作休息
大家有疑问的，可以询问和交流
10
3、 酶浓度的影响：日常使用的DNA浓度比
酶单位定义状态低10-20倍，连接平末端时酶用
量要比连接黏端大10-100倍。
4、 DNA浓度的影响：要求得到环化的有效
连接产物， DNA浓度不可过高，一般不会超过 20nmol/L。要求线性化的连接产物， DNA的浓 度可以高些，至少是接近推荐的浓度。
3、注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带 模糊ห้องสมุดไป่ตู้条带缺失的现象。乙醇沉淀可以去除多余的盐， 用酚可以去除蛋白。
4、注意变性的DNA样品可能导致条带模糊和缺失，也 可能出现不规则的DNA条带迁移。在上样前不要对DNA 样品加热，用20mM NaCl缓冲液稀释可以防止DNA变性。
5、正确的DNA上样量是条带清晰的保证。注意太多的 DNA上样量可能导致DNA带型模糊，而太小的DNA上 样量则导致带信号弱甚至缺失。
注意事项及影响因素：
1.对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5~2%之间，低浓 度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小 片段分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼 脂糖是解决办法。注意高浓度的胶可能使分子大小相近 的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。
2、电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。注 意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升， 缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则 的DNA带迁移的现象。
实验结果
pcr扩增获得 目的基因的 凝胶电泳图
PCR产物
模板跑胶条带 几乎看不到。
引物
2、凝胶电泳回收目的基因
基本原理：DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应 和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负 电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上 的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电 荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。
用50mmol/L，pH的范围在7.4-7.8，目的是提供合适酸碱 度的连接体系； 25-50ug/ml的BSA，作用是增加蛋白质 的浓度，防止因蛋白浓度过稀而造成酶的失活。 2、 连接温度与时间的影响：因为黏性末端的DNA双链 间有氢键的作用，所以温度过高会使氢键不稳定，传统 上将连接温度定为16℃，时间为4-16h。现经实验发现， 对于一般的黏性末端来说，低温连接较长的时间可取得 较好的连接效果。
试验方法——热休克法
10 L载 体DNA
40L感 受态菌
On ice混合， 静置10min
200L转化液 +16ulIPTG+40u lX-Gal，涂含抗
菌素的平板
37℃摇1h
42ºC 45秒
加入1mL LB培养基
检验是否从大肠杆菌中提取出质粒DNA 的电泳图。
影响转化率的因素
➢细胞生长状态和密度:
9、变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极 有可能出现假阴性；退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异 性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效 率。
10、靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整 个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性；二是空气中的小片段 核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼 接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生。