高效液相色谱法同时分析低浓度的葡萄糖_乙醇和甘油

图 2 酿酒酵母随机生长过程中葡萄糖、乙醇、 甘油随时间变化曲线
Fig. 2 Changes of gl ucose, ethanol and gl ycerol in random growth
4 结论
本文用高效液相色谱法同时 分析了低浓度的葡 萄糖、乙醇和甘油。实验表明, 该方法易于操作, 灵敏 度 较高, 检测 速 度快, 在 15 min 内 可使 葡萄 糖等 3 种物质达到基线分离。为该类培养体系, 特别是为酿 酒酵母代谢行为的研究提供了一 个快速、准 确、灵敏 的检测方法。关于酿酒酵母代谢行 为的深入研究将 另文发表。
1. 44
0. 999 7
<8
* 以葡萄糖为参照物, 参见文献[ 4] 。 G lucos e w as s elect ed as t he con tr ast [ 4] .
最低检测限 Det ection lim it
( g) 10- 5
10- 4
10- 5
3. 4 酿酒酵母发酵初期的代谢行为初探 酿酒酵 母( Sacchar om yces cerev isiae ) 是代 谢工
母生长初期的代谢行为。菌种为 S. cer evisiae( Z-234) , 由 中科院微生物所谭华荣研究员赠送。培养基配 方: 葡 萄 糖 10 g , 酵 母 浸 粉 2 g, ( N H4 ) 2SO 4 2 g , K H2P O 4 5 g , M gSO 4· 7H2O 0. 4 g , CaCl2 0. 2 g , 溶 于 1 000 m L 蒸馏水中, pH 值 5. 15。药品 均为分析 纯。培养基经高压蒸汽灭菌后待用。菌种经 24 h 活 化 后 接 入 新 鲜 的 液 体 培 养 基 中, 接 种 密 度 在 106 个/ mL 数 量 级, 摇 床 培 养 温 度 30 ℃, 转 速 160 r / min。定时取样分析 。菌体 密度采用显微计数法( 血 球记数板法) 测定。
第 18 卷第 2 期 2000 年 3 月
色 谱
CHIN ESE JO U RN A L OF CHR OM AT OG RA PHY
V ol. 18 N o . 2 M ar ch 2000
高效液相色谱法同时分析低浓度的葡萄糖、乙醇和甘油
李伟军, 韦新桂, 丛 威, 欧阳藩
收稿日期: 1998-11-04; 修回日期: 1998-12-28 基金项目: 中国科学院生物科学与技术研究特别支持费资助项目( ST Z-3-08) 作者简介: 李伟军( 1973-) , 男, 博士研究生。电话: ( 010) 82627062。 通讯联系人: 丛威( 1969-) , 男, 副研究员, 博士。电话: ( 010) 82627061。
( 中国科学院化工冶金研究所 生化工程国家重点实验室, 北京 100080)
摘要: 用高效液相色谱法同时分析、示差折光检测器检测酿酒酵母 发酵液中的葡萄糖、乙醇及甘油。方法快速、 灵敏、操作方便。同时利用高效液相色谱法对酿酒酵母细胞群体发酵初期的代谢行为进行了初步研究。 关键词: 高效液相色谱法; 示差折光检测器; 酿酒酵母; 发酵 中图分类号: O 658 文献标识码: A 文章编号: 1000-8713( 2000) 02-0170-03
Abstract: A met hod based on hig h perfo rma nce liquid chr om atog raphy ( HP LC) fo r t he analy sis of gluco se, ethanol and g ly cero l sim ultaneously is pr esented. T he ba seline separation w as achieved at r oo m tempera ture ( 25-30 ℃) o n a Beckman -Spher og el car bohydra te colum n ( 6. 5 mm i. d. ×30 cm) w ith H2SO 4-H2O ( 0. 5∶ 1 000, V / V ) as mo bile phase at a flow rate o f 1. 000 mL / min. A ll the substances w ere detected w ith the Beckman 186 Refr activ e Index Detecto r. U nder these conditio ns, distinct peaks o f g luco se , ethano l and gly cer ol w er e resolv ed w ithin 15 min. T he ret ent ion t ime in t he par ticular co ndit ion w as ( 6. 04±0. 04) min for g lucose, ( 13. 36± 0. 08) min fo r ethanol and( 8. 72± 0. 05) min fo r g ly cero l. T he detectio n limit fo r glucose, ethanol and g ly cero l w ere fo und t o be 10- 5g, 10- 4g and 10- 5g respectiv ely . A ser ies of ex per iments have been per for med to investigate the g lucose co nsumptio n and the ethanol, g ly cer ol pr oduct ion in the ra ndom gr ow th of Sacchar omy ces cer evisiae w ith the metho d abo ve . O nly 0. 5 mL sample w as needed each tim e. In 30 hour s aft er ino culatio n, the cell density incr eased fr om 106 m L- 1 to 107 mL - 1. I t wa s fo und that the gluco se co ncentr atio n decreased appro x imately linearly aft er 8 hour s, and ethanol and glycer ol was det ect ed after the delay per io d as ex pect ed. T he results sho w t ha t the method pro po sed is r apid and convenient w it h eno ug h accur acy. T he metho d ma y be used to investigat e the metabolic behavior of y east in the fer mentation pr ocess at the ear ly stag e o r detect the slight cha ng es o f concentr atio ns of some objective substances in par ticular cultur e ex per iments.
第 2 期
李伟军等: 高效液相色谱法同时分析低浓度的葡萄糖、乙醇和甘油 ·171·
表 1 葡萄糖、乙醇、甘油标准样品的定量分析 Table 1 The quantitati ve analysi s of glucose, ethanol and gl ycerol
物质 Subs t ance
葡萄糖 G lu cose
L I Wei-jun, WEI Xin-g ui, CONG Wei, OUYANG F an
( S tate K ey L abor atory of Biochemical E ngineering, T he Chinese A cad emy of S ciences , Beij ing 100080, China)
保留时间 R et ent ion t ime
( min)
相关系数 r
0. 999 1
线性范围 Linear range
(g / L)
< 15
乙醇 E th anol
13. 36±0. 08
2. 21
0. 999 7
< 20
甘油 G l ycer ol
8. 72±0. 05
程( metabolic eng ineer ing ) 研 究中 常 用的 模 型生 物 之一。酿酒酵母发酵利用葡萄糖的过程有 3 种途径: 有氧呼吸 生成 CO2 和 H2O 、无氧 呼吸生成 乙醇或者 生成甘油。这 3 种方式在菌体内都可以存在。要研究 酿酒 酵母的代谢 动力学 行为, 就需要 在发酵 过程中 监测葡萄糖、乙醇、甘油等的变化 情况。在工业发酵
图 1 实际样品的高效液相色谱图 Fig. 1 The chromatogram of real sample 色 谱 柱 ( col umn ) : -Sph erogel carbohydr at e colum n( 6. 5 m m i. d . ×30 cm ) ; 流动相( mobile phase) : H2SO 4-H2O( 0. 5∶1 000, V/ V ) ; 流速( f low rat e) : 1. 000 mL/ min; 检测 器 ( d et ect or ) : Beck man 186 R ef ract ive In dex D et ect or; 进样量 ( inject ion volume) : 500 L; 温 度( temperat ure) : 室温( room t emperat ure) 。 1. 葡 萄 糖( glucose) ; 2. 甘 油 ( gl ycer ol ) ; 3. 乙 醇 ( et hanol) ; 4, 5. 未知杂质( im purit y) 。