肾小管上皮细胞培养

合集下载

一种提取及培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的方法及培养基[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810952148.3(22)申请日 2018.08.21(71)申请人华中科技大学同济医学院附属同济医院地址 430030 湖北省武汉市解放大道1095号(72)发明人曾锐　徐虎子　邓旋　赵志　(74)专利代理机构北京一格知识产权代理事务所(普通合伙) 11316代理人赵永伟(51)Int.Cl.C12N 5/071(2010.01)(54)发明名称一种提取及培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的方法及培养基(57)摘要本发明涉及一种提取及培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的方法及培养基，该培养基由以下各原料混合而成：500 mL DMEM/Ham ´s F12培养基、两性离子缓冲液5mL、胎牛血清50mL、庆大霉素500uL、两性霉素B 500uL、表皮生长因子50uL、胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂50uL和激素混合物5mL。

本发明还提供了使用上述培养基提取及培养高纯度原代肾小管上皮细胞的方法。

有益效果为，采用本发明的高选择性的培养基，可提取及培养出纯度高达92%以上的小鼠原代肾小管上皮细胞，培养得到的高纯度原代肾小管上皮细胞是研究急性肾损伤或慢性肾脏病损伤机制的较好工具细胞。

权利要求书1页说明书3页附图2页CN 109022350 A 2018.12.18C N 109022350A1.一种培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的培养基，其特征在于，由以下各原料混合而成：500 mL DMEM/Ham ´s F12培养基、两性离子缓冲液5mL、胎牛血清50mL、庆大霉素500uL、两性霉素B 500uL、表皮生长因子50uL、胰岛素-转铁蛋白-硒添加剂50uL和激素混合物5mL。

2.根据权利要求1所述的一种培养小鼠高纯度原代肾小管上皮细胞的培养基，其特征在于，所述激素混合物由以下各原料混合而成：HBSS缓冲液28.5mL、两性离子缓冲剂0.5mL、前列腺素E2 1mL、 Trijod -Thyronine 5mL、氢化可的松5mL和肾上腺素5mL。

尿毒症毒素对培养肾小管上皮细胞增殖和转化生长因子-β1分泌的影响

【熊洁萍，李汉贤，朱刚，等．Ｂｌ２ａｐｓ一７］ｃ－，Ｃｓａｅ３在甲状腺癌和桥本甲状腺炎中的表达及意义【．中国耳鼻咽喉Ｊ］颅底外科杂志，２０，１（）．０６２２：１１０【］张林，８吴亚群．分化型甲状腺癌的预后评估和监测【１实Ｊ．
差异均具有统计学意义；有淋巴结转移的病例或临床进展期在甲状腺癌病例中，组织中ｐ３的表达明显增强，癌５差异均具有统计学意义。５在甲状腺癌所有类型中均有表达，并且分化ｐ３越差表达程度越高，因此，有理由认为，ｐ３阳性提示甲状腺５
ｔｙｏｉａｅｎｍｓｗｉｈａｎｕａａｔｒ．Ｅｄｅｈｒｄｃｒｉｏａｔｎｉｓｌｒｐｔｅｎｎｏｒ
尿毒症毒素对培养肾小管上皮细胞增殖和转化生长
因子一分泌的影响
蔡凤丙黄志文５４０２０１）
（广东省湛江市第一中医医院５４０１２０１）
（２广东医学院附属医院
［摘要］目的探讨尿毒症毒素在肾小管问质纤维化（ｅｌｕｕｉｅｔａｆｒｓ，Ｆｒａｔｌｎｒｉｌｂ￣ＲＴ）中的作用。方法用含不同浓度的尿毒ｎｂｏｔｓｏｄｉ血清培养液刺激培养肾小管上皮细胞（ＴＣ），以加含正常人血清培养液的细胞作对照组，应用四甲基偶氮唑蓝（Ｔ）ＲＥｓＭＴ比色法检测ＲＥｓＴＣ增殖能力，酶联免疫吸附（ＬＡ）ＥＩ法检测培养上清ＴＦｐ水平。结果不同浓度尿毒血清组与正常血清ＳＧ— 对照组比较差异有显著性（９０５且随尿毒血清浓度增加，对ＲＴＣ的增殖抑制以及对ＴＦ白１，），＜０ＥｓＧ —Ｂ蛋分泌的促进作用有增强趋势。结论尿毒症毒素可能通过抑制ＲＥｓＴＣ的生长并促进其ＴＦｐ的分泌从而在ＲＦＧ— Ｔ的发生发展中着一定的作用。起

人肾小管上皮细胞血清饥饿法同步化方法的研究

维普资讯
ＩＳＳＮ１００７—８７３８
志（ＣｈｉｎＪＣｅｌｌＭｏｌＩｍｍｕｎｏ１）２００７，２３（３
２７５
・
论著・
文章编号：１００７—８７３８（２００７）０３— ０２７５— ０３
分为７组，培养至对数生长期，弃去培养液，ＰＢＳ洗涤３次，分别加入０、１、２、３、４和５ｍｌＭＬ胎牛血清的ＤＭＥＭ培养液，
对照组加入１００ｍｌＭＬ胎牛血清的ＤＭＥＭ培养液，培养２４ｈ收获细胞，每组重复培养３次。（２）不同时问ＨＫＣ的培
用ＰＢＳ洗涤２次，除去无水乙醇，加少量ＰＢＳ将细胞吹散（每份要求细胞数为５～１０×１０），加入ＰＩ（终浓度为５０ｍｇ／Ｌ）和
步化于Ｇ０期的方法，对研究肾小管上皮细胞增殖周胰核糖核酸酶（ＲＮａｓｅＡ）（终浓度为２０ｍｇ／Ｌ），用流式细胞仪期以及由此引起的再生修复或问质纤维化具有重要检测ＧＯ／Ｇ１、Ｓ、Ｇ２／Ｍ各期的细胞数。意义。血清饥饿法是能将细胞周期停滞于Ｇ０／Ｇ１期１。２。３ＭｒｌＹｒ法细胞生长曲线分析取上述各组培养细胞分
养：将ＨＫＣ分为６组，培养至对数生长期，弃去培养液，ＰＢＳ
洗涤３次，分别加入０、１ｍｌＭＬ胎牛血清的ＤＭＥＭ培养液培养２４ｈ、４８ｈ和７２ｈ收获细胞，每组重复培养３次Ｊ。１。２．２细胞周期检测用含０。２ｍｌＭＬＥＤＴＡ、２。５ｇ／Ｌ胰蛋

肾小管上皮细胞

肾小管上皮细胞肾脏是人体重要的排泄器官，承担着调节体液平衡、排泄代谢产物等重要功能。

其中，肾小管是肾脏负责调节尿液成分和浓度的重要结构。

在肾小管中，肾小管上皮细胞起着至关重要的作用。

肾小管上皮细胞的功能肾小管上皮细胞是肾小管的主要细胞类型，其主要功能包括：1.吸收和分泌物质：肾小管上皮细胞通过细胞膜上的通道蛋白和转运蛋白，调节尿液中各种物质的进出，保持体液的稳定性。

2.酸碱平衡：肾小管上皮细胞参与调节体液的酸碱平衡，保持血液的PH值在正常范围内。

3.水和电解质的重吸收：肾小管上皮细胞通过调节水和电解质的重吸收，控制尿液的浓缩和稀释，以保持体内水分的平衡。

4.分泌代谢产物：肾小管上皮细胞还可以分泌代谢产物和药物，帮助排泄体内废物。

肾小管上皮细胞的结构肾小管上皮细胞具有特殊的结构和功能，主要包括：1.微绒毛：肾小管上皮细胞表面覆盖着微绒毛，增加细胞的表面积，有利于吸收和分泌物质。

2.紧密连接：肾小管上皮细胞之间有紧密连接，形成了密封的屏障，阻止尿液中物质的非特异性扩散。

3.基底膜：肾小管上皮细胞下方有基底膜支持，稳固细胞结构，有利于细胞的功能发挥。

4.细胞器：肾小管上皮细胞内含有丰富的线粒体、内质网等细胞器，能够提供能量和合成所需的蛋白质。

肾小管上皮细胞的生理调节肾小管上皮细胞的功能受多种生理调节因素影响，主要包括：1.激素调节：肾上腺素、抗利尿激素等激素能够调节肾小管上皮细胞的水和电解质重吸收。

2.神经调节：交感神经和肾上腺髓质素能够通过神经递质的释放，影响肾小管上皮细胞的功能。

3.渗透压调节：体液中的渗透压变化能够影响肾小管上皮细胞对水和电解质的调节。

肾小管上皮细胞与疾病肾小管上皮细胞在多种肾脏疾病中扮演重要角色，包括：1.肾小管功能障碍：肾小管上皮细胞受损或功能异常会导致尿液稀释和浓缩能力下降，引起多尿或少尿等症状。

2.肾小管间质疾病：某些疾病如肾小管间质性肾炎会累及肾小管上皮细胞，损害肾小管结构和功能。

原代肾小管上皮细胞的提取和培养方法的优化

收稿日期:2017-12-28基金项目:国家自然科学基金项目(21675017);中央高校基本科研项目(DUT17LK25)第一作者:曲玥阳(1988-),女,博士研究生,从事肾脏器官芯片研究,E-mail :yyqu@通信作者:罗勇(1978-),男,博士,副教授,从事器官微流控芯片研究,E-mail :yluo@原代肾小管上皮细胞的提取和培养方法的优化曲玥阳1,陈旭2,岳喜庆2,罗勇1,赵伟杰1,林炳承1(1.大连理工大学制药科学与技术学院/精细化工重点实验室,辽宁大连116023;2.沈阳农业大学食品学院,沈阳110161)摘要:为建立理想的研究农药中毒性肾病体外细胞模型,系统考察了原代肾小管上皮细胞提取和培养的一系列关键因素,经过优化组合,提出了一种更为高效实用的原代肾小管上皮细胞提取和培养方法。

通过显微镜明场观察肾小管节段组织形态和纯度,研究0.1%的Ⅰ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶、Ⅴ型胶原酶在15min 和3h 的时候对组织的消化情况以及Ⅱ型胶原酶作用0min,8min,15min,40min,1h,3h 时组织消化情况。

利用MTT 比色法考察了鼠尾I 型胶原,层粘连蛋白,基质胶对培养皿的包被情况对细胞增殖速率的影响,利用MTT 比色法考察不同浓度的血清对细胞增殖速率以及细胞活性维持的影响,细胞免疫荧光法考察不同浓度血清对肾小管上皮细胞的Na +/K +ATPase 表达的影响。

结果表明:利用Ⅱ型胶原酶,消化15min 可以获得较好的肾小管节段;利用基质胶包被培养皿是性价比最高的促进肾小管上皮细胞增殖的条件;观察到在细胞增殖期内,1%,2%,4%的血清浓度较0%和5%有较好的促进细胞增殖作用;在平台期内,2%,4%,5%的血清浓度较0%和1%有较好的细胞活性维持作用;第3天时,2%血清浓度培养的肾小管上皮细胞的Na +/K +ATPase 表达最强;第14天时,1%和2%血清浓度培养的细胞的Na +/K +ATPase 表达较好,最终确定血清最优浓度为2%。

人肾小管上皮细胞培养_操作指南

正常人肾脏近球小管上皮细胞（RPTEC）的培养方法拆装与贮存1.检查所有容器是否漏液或破损。

2.对于冻存细胞：将细胞冷冻管从干冰中取出并迅速放入液氮中贮存。

或者，解冻并立即培养。

3.对于增殖细胞：用70%的乙醇或异丙醇擦洗盛有细胞的培养皿，将细胞培养皿置于培养箱（如不特殊说明，均为37℃，5% CO2）中3到4个小时。

细胞处于平衡状态后，除去运送时的培养基并更新。

4.Bulletkit®使用说明：送达后，在无自动除霜功能的冰箱中4-8℃下冷藏保存基础培养基，-20℃下冷冻保存SingleQuots®细胞生长因子。

如送达后已经解冻，生长因子可在4℃下冷藏，并需要在72小时之内加入基础培养基中。

加入基础培养基后，在一个月之内使用，不要再次冷冻。

5.ReagentPack TM传代试剂在运送前已经过无菌过滤在-20℃下保存。

传代试剂在运送过程中可能会解冻。

可以进行一次再冷冻。

如果在3天之内使用，可以在4℃下冷藏。

Trypsin/EDTA溶液的保存时间有限并会在4℃下活化。

如果在送达之后出现解冻，立即分装并在-20℃下冷冻。

建议HEPES缓冲液（以下简称HEPES）和Trypsin中和液不要在4℃下冷藏超过一个月。

注意：为保持解冻后的Trypsin/EDTA的新鲜和活性，可将其按20ml分装并置于消毒的离心管中，-20℃下再次冻存。

培养基的制备1.用乙醇或异丙醇对所有的添加剂管瓶及装有培养基的试剂瓶消毒。

2.用移液管将全部的添加剂加入培养基中。

3.用培养基冲洗添加剂管瓶。

对于每瓶添加剂，可能会有少量残存未被移取。

少量的残存，即使10%，也不会显著影响在含有添加剂培养基中的细胞生长。

4.将添加剂管瓶上的标签撕下并贴于培养基的试剂瓶上。

以此记录每种添加剂加入的时间和含量。

建议将全部标签贴于培养基试剂瓶上（不要将培养基的批号及有效期覆盖）以避免混淆和重复添加。

细胞解冻/起始培养1.RPTEC(Renal Proximal Tubule Epithelial Cell，肾脏近球小管上皮细胞)的建议接种密度为2500 cells/cm2。

肾小管上皮细胞分离实验研究-细胞生物学论文-生物学论文

肾小管上皮细胞分离实验研究-细胞生物学论文-生物学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——目前大量关于肾的毒理学、药物测试等研究需要肾小管上皮细胞株。

但是，细胞株部分基因的变异或缺失与正常细胞存在差异，原代细胞在表达正常细胞生理状态下则更显优势[1],因此寻求一种有效的肾小管上皮细胞的原代培养尤为重要。

目前多篇文献[1-7]对肾小管上皮细胞的原代培养都有各自见解，本实验将其简化并加以改良，在文献的基础上[2]优化实验条件，寻找经济材料以及合适的浓度以获得大量良好的肾小管上皮细胞。

在试验中发现将第一次细胞换取液可再次利用，仍有大量高纯度的肾小管上皮细胞贴壁且贴壁良好。

1 材料与方法1.1 材料实验动物：SD 大鼠，雄性，4~5 周龄（徐州医学院实验动物中心）；昆明小鼠，4~5 周龄（徐州医学院实验动物中心）。

1.2 主要试剂胎牛血清（杭州四季青），DMEM-F12 1:1 培养基（Thermo），Ⅰ型胶原酶（美国Sigma），胰酶消化液，双抗（青霉素-链霉素溶液100），兔抗人角蛋白CK18（Bioss），SABC 免疫组化染色试剂盒（博士德生物），DAB 显色试剂盒（博士德生物）。

1.3 试验方法1.3.1 肾小管节段分离大鼠和小鼠实验前均禁食12 小时，进水自由。

脱臼，75% 乙醇中浸泡5min.在超净台中取出肾，置于冷的含双抗的PBS 溶液中，去除肾蒂和包膜，将肾皮质剪碎大小至1mm3,PBS 洗涤3 次后，放置80 目不锈钢筛网上，用50ml灭菌注射器柄轻轻研磨，PBS 液充分清洗后的网下液转移至100 目不锈钢筛网中，将100 目筛网倒置PBS 冲洗取网上液。

取得的液体经1500r/min 离心8min,弃去上清液在沉淀中加入Ⅰ型胶原酶，分别37Ⅰ振荡消化，振荡消化时间分三组，分别为20min,25min,30min.双倍体积DMEM-F12 培养基中和后，1500r/min 离心8min.1.3.2 肾小管上皮细胞的原代培养及传代在上述离心后的沉淀中加入含10% 胎牛血清的DMEM-F12 培养基，轻轻吹打混匀。

肾小管上皮细胞对成骨细胞骨代谢相关基因表达的体外调节

（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＢｏｎｅＭｅｔａｂｏｌｉｃ，ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＲａｄｉａｔｉｏｎＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＦｕｄａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２０００３２，Ｃｈｉｎａ）
培养大鼠近端肾小管上皮细胞与头盖骨成骨细胞；用甲状旁腺激素（ＰＴＨ）、 ” Ｃｓ一７射线及２５（ＯＨ）Ｄ３预作用前
者，再与后者分为４组共培养： ①单培养组（成骨细胞单培养）、 ②共培养组（肾小管上皮细胞与成骨细胞共培养）、 ③刺激共培养组（肾小管上皮细胞经ＰＴＨ＋２５（０Ｈ）Ｄ处理，再与成骨细胞共培养）、 ④抑制共培养组（肾小管上皮细胞经 ” Ｃｓ一７射线照射＋２５（０Ｈ）Ｄ处理，再与成骨细胞共培养）；并用ＲＴ — ＰＣＲ方法检测共培养体系中成骨细胞的ＢＧＰ、ＡＬＰ、ＣｏｌＩ、ＲＡＮＫＬ与ＯＰＧｍＲＮＡ表达。结果共培养组成骨细胞的骨形成相关基因
机制研究。【关键词】肾小管上皮细胞；成骨细胞；共培养体系；骨代谢；基因表达【中图分类号】Ｒ８１８．０２３【文献标识码】Ａ
Ｃｏｒｒｅｌａｔｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｂｏｎｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｏｆｔｈｅｐｒｏｘｉｍａｌ

1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

超净台的规范使用
1.打开无菌工作台及净化室的紫外灯，消毒30min以上。

2.进入净化室前先关闭紫外灯，打开超净台风机，等待30min以上，以排尽臭氧。

3.穿好隔离衣，戴好口罩，帽子。

4.风淋2分钟。

5.75%酒精喷手上手套消毒
6.再超净台内的整个过程必须一直点燃着酒精灯；超净台内应避免放入过多的物品；使用的吸管，滴管，试管，培养瓶等均事先灭菌。

7.打开各类瓶盖前先过火，以固定灰尘；打开的瓶口、试管口过火焰，镊子使用前应经火焰烧灼。

8.水平式风机的超净台，应使瓶口斜置，应尽量避免瓶口敞开直立。

9.同一根吸管或滴管不应连续用于几个不同的细胞系；吸取培养基的吸管应离开培养瓶或试管口0.5cm，避免伸入培养瓶口或试管口；以防止细胞系的互相混杂污染。

10.漏在培养瓶上或台上的液体，立即用酒精棉球擦净。

11.操作完毕后恢复工作台面，关闭风机。

2012.06.29
小鼠肾小管上皮细胞培养
基础培养液配置：
完全培养基的配置：基础培养基+胎牛血清+抗生素和链霉素
1.取两个灭菌平皿，一个加适量基础培养基，一个加适量基础培养基
2.试验小鼠最好禁食12小时，自由饮水。

在细胞间外颈椎脱臼致死，75%酒精中
浸泡即可带进细胞间，75%酒精浸泡5min左右取出
3.以下步骤须在超净台操作。

用镊子将小鼠拿出后放于干净托盘在超净台上（小鼠均腹部
向上以便肾脏取出）
4.用镊子和剪刀剪开肚皮，用另一镊子和剪刀取出肾脏放入盛有基础培养基的培养皿
5.用两个弯镊子剖肾筋膜，之后放于80目细胞筛（细胞筛浸有完全培养基的培养皿中），
肾脏用培养基浸湿后直接在细胞筛上研磨，直至磨至近白色即可弃去此筛
6.用150目细胞筛进行过滤（因肾小管段在范围为80—150目内所以150目筛上的是我们
所要的），此筛下放一平皿用来接过滤液即为废液（过滤时用移液枪操作）
7.另取一新培养皿，将150细胞筛反过来放在培养皿上，用移液枪吸取完全培养液将肾小
管段冲洗至培养皿中，尽量少用培养液
8.弃去细胞筛，将有肾小管段的培养液倒入15ml离心管1000r/min离心4min
9.弃上清，加等量胶原酶，37度温浴15min
10.1100r离心5min，弃上清
11.两只小鼠加36ml完全培养基，用移液器将肾小管段尽可能的吹散
12.细胞瓶中放5ml培养且细胞瓶盖不要拧紧以便细胞呼吸，六孔板中放2ml培养，24孔板
放100微升培养为佳。

这是原代细胞培养。

2012.06.30下午
13.细胞传培养：
从对侧倒掉培养液，用酒精棉球擦拭最后一滴，注意要靠近酒精灯。

如果细胞不干净可用什么液清洗(冲洗)，加入适量消化液(胰蛋白酶液)，注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。

倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度，然后让其停止消化。

细胞培养所用试管洗涤方法
洗衣粉洗---冲净20遍---烘干---泡酸8h----自来水冲洗20遍----双蒸水2-3遍---烘干---包装高压。