人肾小管上皮细胞培养_操作指南
人肾小管上皮细胞血清饥饿法同步化方法的研究
人肾小管上皮细胞血清饥饿法同步化方法的研究【关键词】肾小管上皮细胞;，，同步化;，，血清饥饿法;，，G0/G1阻滞[摘要] 目的: 探讨采用血清饥饿法建立将人肾小管上皮细胞（HKC）的同步化方法。
方法: 将HKC分为6个不同低血清浓度组及对照组，分别采用胎牛血清浓度为0、 1、 2、 3、 4、 5和100 mL/L的DMEM培养液培养24 h。
根据流式细胞术结果选择的最佳同步化HKC的胎牛血清浓度。
将HKC的同步化处理时间分别延长为24 h、 48 h和72 h，选择最佳同步化时间。
用MTT法绘制生长曲线观察血清饥饿处理对HKC生长的影响。
采用免疫细胞化学方法验证血清饥饿同步化处理HKC的效果。
结果: 选择无血清（0 mL/L）和1 mL/L为HKC最佳同步化的胎牛血清浓度，选择48 h为HKC同步化最佳时间。
细胞生长曲线表明采用1 mL/L 胎牛血清的DMEM培养液培养48 h后恢复正常培养的HKC细胞，其生长曲线更接近于正常培养的细胞。
Brdu进一步证明，用1 mL/L胎牛血清的DMEM培养液培养48 h可以使90%以上的HKC细胞处于G0/G1期。
结论: 用1 mL/L胎牛血清的DMEM 培养液培养48 h可获得90%以上的G0/G1期HKC。
[关键词]肾小管上皮细胞; 同步化; 血清饥饿法; G0/G1阻滞肾小管萎缩和间质纤维化是终末期肾病发生和进行性恶化的主要危险因素之一，而肾小管萎缩和肾间质纤维化的发生与肾小管上皮细胞周期变化密切相关[1]。
因此建立有效的能将肾小管上皮细胞同步化于G0期的方法，对研究肾小管上皮细胞增殖周期以及由此引起的再生修复或间质纤维化具有重要意义。
血清饥饿法是能将细胞周期停滞于G0/G1期同时又较少影响细胞周期发育进程的一种简便有效的同步化方法[2， 3]。
目前尚无关于肾小管上皮细胞成熟有效的血清饥饿同步化方法的报道。
本研究旨在寻找对人肾小管上皮细胞实施血清饥饿同步化方法的最佳条件，从而为研究HKC增殖周期及肾间质纤维机制提供实验基础。
人肾小管上皮细胞安全操作及保养规程
人肾小管上皮细胞安全操作及保养规程背景介绍肾小管上皮细胞是一种常用的体外细胞模型，被广泛应用于药物筛选、疾病研究等领域。
然而，在进行实验操作过程中，由于缺乏安全措施，可能会对试验者的安全造成威胁，同时也容易影响细胞的生长及实验结果的准确性。
因此，在使用人肾小管上皮细胞时，我们需要遵循安全操作规程，做好细胞的保养工作，以确保实验的安全有效进行。
安全操作规程下面是使用人肾小管上皮细胞时需要注意的安全操作规程：1. 穿戴实验室防护用具在操作人肾小管上皮细胞时，必须穿戴实验室防护用具，包括实验服、手套、口罩和护目镜等，以保护实验者的皮肤、眼睛和口鼻不受化学药品的侵害。
2. 细胞操作前进行消毒在操作人肾小管上皮细胞前，必须进行细胞实验台面、培养皿、移液器等实验器材的消毒处理，以保证细胞操作过程中的无菌状态。
3. 禁止食用和吸烟在实验室内禁止食用任何食物，同时也不允许吸烟或使用任何含烟草成分的物品。
4. 合理使用化学药品在使用化学药品时，应当注意其作用、性质、危险性和浓度，避免与其他化学药品混合使用，同时要正确储存、使用和处理废弃物。
5. 注意个人卫生习惯在实验过程中要注意个人卫生习惯，使用完实验器材后要进行及时清洗，并注意手部卫生，避免在细胞操作过程中感染疾病。
细胞保养规程正确的细胞保养是实验顺利进行的前提，这里提供了一些人肾小管上皮细胞的保养规程：1. 培养条件人肾小管上皮细胞在37℃的恒温培养箱中进行培养，培养基中含有适宜的营养物质、生长因子和血清等，以保证细胞的快速生长和细胞外基质的分泌。
2. 细胞的传代在培养过程中，人肾小管上皮细胞需要定期传代以保证细胞的生长状态和细胞外基质的新鲜度，一般间隔时间不超过7天。
3. 细胞冻存在细胞生长状态较好时，为了方便保存和定期使用，可以将细胞进行冻存处理。
在进行细胞冻存之前，需要先加入适量的细胞冻存液，并正确的放置于恒温冰箱内进行保存。
4. 细胞的解冻冻存的细胞需要在使用前进行解冻，解冻过程中需要注意解冻液的温度，以避免细胞受到不必要的损伤。
Percoll法分离培养肾小管上皮细胞
Percoll法分离培养肾小管上皮细胞
刘晓玲;邢淑华
【期刊名称】《徐州医学院学报》
【年(卷),期】2006(26)2
【摘要】目的建立良好的肾小管上皮细胞培养方法.方法选用SD幼鼠的肾组织进
行细胞培养,采用Percoll密度梯度离心法分离纯化肾小管后,选择含10%新生牛血清的DMEM/F12培养基、5%CO2、37℃孵箱进行细胞培养.利用传1代的细胞,
制作细胞爬片,用免疫组化、透射电镜进行鉴定.结果细胞生长4～5天后基本达到
融合,细胞呈多边鹅卵石铺路样.结合形态学及免疫组化鉴定,细胞培养传1代后98%的细胞为肾小管上皮细胞.结论用Percoll法分离培养的细胞数量多,均一性生长较好,可重复性操作较好.为体外研究接近组织原位RTECs细胞功能和特征及药物的筛选提供了可行性和可能性.
【总页数】4页(P100-103)
【作者】刘晓玲;邢淑华
【作者单位】徐州医学院药理学教研室,江苏,徐州,221002;徐州医学院药理学教研室,江苏,徐州,221002
【正文语种】中文
【中图分类】R322.61
【相关文献】
1.用微分离方法培养肾皮质近曲肾小管和髓质集合管上皮细胞及其生物学… [J], 傅博;陈香美
2.大鼠肾小管上皮细胞分离及其体外原代培养 [J], 张元元;郭艳;王光明
3.昆明小白鼠肾小管上皮细胞原代分离培养方法的建立 [J], 寇焕起;潘晓亮;周恩库;许梓荣
4.肾小管上皮细胞分离方法与原代培养 [J], 喻陆
5.Percoll分离法联合MALDI-TOFMS直接鉴定血培养专性厌氧菌阳性标本的应用价值 [J], 梁林;幸雯;张京;陆必超;丁秀荣;刘志忠
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肾上腺皮质细胞的单层培养方法
3收稿日期:2003212205;修回日期:2004206221作者简介:郭 华(19762),女,山西人,助理研究员,硕士,从事航空医学研究。
肾上腺皮质细胞的单层培养方法3郭 华1,刘洪涛2(1.空军航空医学研究所,北京100036;2.军事医学科学院卫生学环境医学研究所,天津300050)摘要 目的:体外单层培养大鼠肾上腺皮质细胞,以便为肾上腺皮质细胞的有关实验提供必要条件。
方法:采用胶原酶Ⅱ、透明质酸酶消化等步骤分离Wistar 大鼠的肾上腺皮质细胞;分离的细胞于含15%NBS 的DMEM 培养基、37℃、5%CO 2的环境中培养,3β2羟基类固醇脱氢酶特异染色鉴定。
结果:培养的肾上腺皮质细胞呈梭形,胞体较大、有少量突起,3β2羟基类固醇脱氢酶特异染色后胞体显著着蓝色。
肾上腺皮质细胞不呈典型的“S ”形增殖趋势,适于作原代培养。
上皮样细胞和成纤维样细胞同时存在。
结论:通过细胞形态观察及特异酶染色鉴定,本文培养的细胞为大鼠肾上腺皮质细胞。
关键词: 肾上腺皮质细胞; 单层培养; 3β2羟基类固醇脱氢酶中图分类号:Q2233;R239.3文献标识码:A 文章编号:100026834(2005)0120117203 肾上腺皮质细胞包括球状带、束状带、网状带细胞,分泌类固醇激素,参与机体的应激应答反应。
1966年,Arvi Kahri 利用贴壁培养法成功培养出成年大鼠肾上腺皮质细胞,为进行肾上腺皮质的生理、生化研究提供了可能。
国内有关肾上腺皮质细胞培养的报道较少,王惠等[1]曾用悬浮法培养成功肾上腺皮质细胞。
由于单层培养细胞在细胞生长发育、功能变化、调控因素研究等方面有较好的优势,为此我们尝试了肾上腺皮质细胞的单层培养,为利用肾上腺皮质细胞进行有关研究提供条件。
1 材料与方法1.1 材料雄性Wistar 大鼠,由本研究所动物中心提供,体重200～220g 。
胶原酶Ⅱ、透明质酸酶、HEPES 、L 2谷氨酰胺、脱氢表雄酮(Dehydroepiandrosterone ,DHEA ),美国Sigma 公司;DM EM 、新生牛血清,美国G ibco 公司;其余试剂为国产分析纯。
肾小管上皮细胞分离实验研究-细胞生物学论文-生物学论文
肾小管上皮细胞分离实验研究-细胞生物学论文-生物学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——目前大量关于肾的毒理学、药物测试等研究需要肾小管上皮细胞株。
但是，细胞株部分基因的变异或缺失与正常细胞存在差异，原代细胞在表达正常细胞生理状态下则更显优势[1],因此寻求一种有效的肾小管上皮细胞的原代培养尤为重要。
目前多篇文献[1-7]对肾小管上皮细胞的原代培养都有各自见解，本实验将其简化并加以改良，在文献的基础上[2]优化实验条件，寻找经济材料以及合适的浓度以获得大量良好的肾小管上皮细胞。
在试验中发现将第一次细胞换取液可再次利用，仍有大量高纯度的肾小管上皮细胞贴壁且贴壁良好。
1 材料与方法1.1 材料实验动物：SD 大鼠，雄性，4~5 周龄（徐州医学院实验动物中心）；昆明小鼠，4~5 周龄（徐州医学院实验动物中心）。
1.2 主要试剂胎牛血清（杭州四季青），DMEM-F12 1:1 培养基（Thermo），Ⅰ型胶原酶（美国Sigma），胰酶消化液，双抗（青霉素-链霉素溶液100），兔抗人角蛋白CK18（Bioss），SABC 免疫组化染色试剂盒（博士德生物），DAB 显色试剂盒（博士德生物）。
1.3 试验方法1.3.1 肾小管节段分离大鼠和小鼠实验前均禁食12 小时，进水自由。
脱臼，75% 乙醇中浸泡5min.在超净台中取出肾，置于冷的含双抗的PBS 溶液中，去除肾蒂和包膜，将肾皮质剪碎大小至1mm3,PBS 洗涤3 次后，放置80 目不锈钢筛网上，用50ml灭菌注射器柄轻轻研磨，PBS 液充分清洗后的网下液转移至100 目不锈钢筛网中，将100 目筛网倒置PBS 冲洗取网上液。
取得的液体经1500r/min 离心8min,弃去上清液在沉淀中加入Ⅰ型胶原酶，分别37Ⅰ振荡消化，振荡消化时间分三组，分别为20min,25min,30min.双倍体积DMEM-F12 培养基中和后，1500r/min 离心8min.1.3.2 肾小管上皮细胞的原代培养及传代在上述离心后的沉淀中加入含10% 胎牛血清的DMEM-F12 培养基，轻轻吹打混匀。
肾小管上皮细胞
肾小管上皮细胞肾脏是人体重要的排泄器官，承担着调节体液平衡、排泄代谢产物等重要功能。
其中，肾小管是肾脏负责调节尿液成分和浓度的重要结构。
在肾小管中，肾小管上皮细胞起着至关重要的作用。
肾小管上皮细胞的功能肾小管上皮细胞是肾小管的主要细胞类型，其主要功能包括：1.吸收和分泌物质：肾小管上皮细胞通过细胞膜上的通道蛋白和转运蛋白，调节尿液中各种物质的进出，保持体液的稳定性。
2.酸碱平衡：肾小管上皮细胞参与调节体液的酸碱平衡，保持血液的PH值在正常范围内。
3.水和电解质的重吸收：肾小管上皮细胞通过调节水和电解质的重吸收，控制尿液的浓缩和稀释，以保持体内水分的平衡。
4.分泌代谢产物：肾小管上皮细胞还可以分泌代谢产物和药物，帮助排泄体内废物。
肾小管上皮细胞的结构肾小管上皮细胞具有特殊的结构和功能，主要包括：1.微绒毛：肾小管上皮细胞表面覆盖着微绒毛，增加细胞的表面积，有利于吸收和分泌物质。
2.紧密连接：肾小管上皮细胞之间有紧密连接，形成了密封的屏障，阻止尿液中物质的非特异性扩散。
3.基底膜：肾小管上皮细胞下方有基底膜支持，稳固细胞结构，有利于细胞的功能发挥。
4.细胞器：肾小管上皮细胞内含有丰富的线粒体、内质网等细胞器，能够提供能量和合成所需的蛋白质。
肾小管上皮细胞的生理调节肾小管上皮细胞的功能受多种生理调节因素影响，主要包括：1.激素调节：肾上腺素、抗利尿激素等激素能够调节肾小管上皮细胞的水和电解质重吸收。
2.神经调节：交感神经和肾上腺髓质素能够通过神经递质的释放，影响肾小管上皮细胞的功能。
3.渗透压调节：体液中的渗透压变化能够影响肾小管上皮细胞对水和电解质的调节。
肾小管上皮细胞与疾病肾小管上皮细胞在多种肾脏疾病中扮演重要角色，包括：1.肾小管功能障碍：肾小管上皮细胞受损或功能异常会导致尿液稀释和浓缩能力下降，引起多尿或少尿等症状。
2.肾小管间质疾病：某些疾病如肾小管间质性肾炎会累及肾小管上皮细胞，损害肾小管结构和功能。
原代肾小管上皮细胞的提取和培养方法的优化
收稿日期:2017-12-28基金项目:国家自然科学基金项目(21675017);中央高校基本科研项目(DUT17LK25)第一作者:曲玥阳(1988-),女,博士研究生,从事肾脏器官芯片研究,E-mail :yyqu@通信作者:罗勇(1978-),男,博士,副教授,从事器官微流控芯片研究,E-mail :yluo@原代肾小管上皮细胞的提取和培养方法的优化曲玥阳1,陈旭2,岳喜庆2,罗勇1,赵伟杰1,林炳承1(1.大连理工大学制药科学与技术学院/精细化工重点实验室,辽宁大连116023;2.沈阳农业大学食品学院,沈阳110161)摘要:为建立理想的研究农药中毒性肾病体外细胞模型,系统考察了原代肾小管上皮细胞提取和培养的一系列关键因素,经过优化组合,提出了一种更为高效实用的原代肾小管上皮细胞提取和培养方法。
通过显微镜明场观察肾小管节段组织形态和纯度,研究0.1%的Ⅰ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶、Ⅳ型胶原酶、Ⅴ型胶原酶在15min 和3h 的时候对组织的消化情况以及Ⅱ型胶原酶作用0min,8min,15min,40min,1h,3h 时组织消化情况。
利用MTT 比色法考察了鼠尾I 型胶原,层粘连蛋白,基质胶对培养皿的包被情况对细胞增殖速率的影响,利用MTT 比色法考察不同浓度的血清对细胞增殖速率以及细胞活性维持的影响,细胞免疫荧光法考察不同浓度血清对肾小管上皮细胞的Na +/K +ATPase 表达的影响。
结果表明:利用Ⅱ型胶原酶,消化15min 可以获得较好的肾小管节段;利用基质胶包被培养皿是性价比最高的促进肾小管上皮细胞增殖的条件;观察到在细胞增殖期内,1%,2%,4%的血清浓度较0%和5%有较好的促进细胞增殖作用;在平台期内,2%,4%,5%的血清浓度较0%和1%有较好的细胞活性维持作用;第3天时,2%血清浓度培养的肾小管上皮细胞的Na +/K +ATPase 表达最强;第14天时,1%和2%血清浓度培养的细胞的Na +/K +ATPase 表达较好,最终确定血清最优浓度为2%。
人胚肾细胞培养方法
人胚肾细胞培养方法
人胚肾细胞培养方法是一种常用的细胞培养技术，可以用于研究细胞生长、分化、细胞信号通路及药物筛选等领域。
以下是人胚肾细胞培养方法的详细步骤：
材料和试剂：
1. 人胚肾细胞
2. DMEM培养基
3. 10%胎牛血清
4. 青霉素/链霉素溶液
5. 0.25%胰酶/乳酸钙溶液
步骤：
1. 用10%胎牛血清预先加热的DMEM培养基来悬浮人胚肾细胞。
2. 用离心机离心悬浮细胞，去掉上清液。
3. 加入预热的DMEM培养基，调整细胞浓度至1.5×105/mL。
4. 将细胞悬液均匀地分配到含有DMEM培养基和10%胎牛血清的培养皿中，每格加入1 mL。
5. 在37℃、5% CO2条件下培养细胞，每隔2~3天更换一次培养基。
6. 当细胞接近100%的情况下，用0.25%胰酶/乳酸钙溶液将细胞从培养皿中剥离下来。
7. 加入预热的DMEM培养基，将细胞浓度调整至1.5×105/mL。
8. 重复步骤4~7，直到获得所需量的细胞。
注意事项：
1. 操作时需严格遵守无菌技术。
2. 细胞培养条件需要严格控制，温度、CO2浓度、培养基配方等需要根据具体的实验要求进行调整。
3. 细胞培养时需要定期更换培养基，保证细胞的生长环境良好。
4. 剥离细胞时，需要使用0.25%胰酶/乳酸钙溶液，但过度消化会导致细胞损失。
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正常人肾脏近球小管上皮细胞（RPTEC）的培养方法
拆装与贮存
1.检查所有容器是否漏液或破损。
2.对于冻存细胞：将细胞冷冻管从干冰中取出并迅速放入液氮中贮存。
或者，解冻并立即
培养。
3.对于增殖细胞：用70%的乙醇或异丙醇擦洗盛有细胞的培养皿，将细胞培养皿置于培养
箱（如不特殊说明，均为37℃，5% CO2）中3到4个小时。
细胞处于平衡状态后，除去运送时的培养基并更新。
4.Bulletkit®使用说明：送达后，在无自动除霜功能的冰箱中4-8℃下冷藏保存基础培养基，
-20℃下冷冻保存SingleQuots®细胞生长因子。
如送达后已经解冻，生长因子可在4℃下冷藏，并需要在72小时之内加入基础培养基中。
加入基础培养基后，在一个月之内使用，不要再次冷冻。
5.ReagentPack TM传代试剂在运送前已经过无菌过滤在-20℃下保存。
传代试剂在运送过程
中可能会解冻。
可以进行一次再冷冻。
如果在3天之内使用，可以在4℃下冷藏。
Trypsin/EDTA溶液的保存时间有限并会在4℃下活化。
如果在送达之后出现解冻，立即分装并在-20℃下冷冻。
建议HEPES缓冲液（以下简称HEPES）和Trypsin中和液不要在4℃下冷藏超过一个月。
注意：为保持解冻后的Trypsin/EDTA的新鲜和活性，可将其按20ml分装并置于消毒的离心管中，-20℃下再次冻存。
培养基的制备
1.用乙醇或异丙醇对所有的添加剂管瓶及装有培养基的试剂瓶消毒。
2.用移液管将全部的添加剂加入培养基中。
3.用培养基冲洗添加剂管瓶。
对于每瓶添加剂，可能会有少量残存未被移取。
少量的残存，
即使10%，也不会显著影响在含有添加剂培养基中的细胞生长。
4.将添加剂管瓶上的标签撕下并贴于培养基的试剂瓶上。
以此记录每种添加剂加入的时间
和含量。
建议将全部标签贴于培养基试剂瓶上（不要将培养基的批号及有效期覆盖）以避免混淆和重复添加。
细胞解冻/起始培养
1.RPTEC(Renal Proximal Tubule Epithelial Cell，肾脏近球小管上皮细胞)的建议接种密
度为2500 cells/cm2。
2.根据接种密度和培养皿的表面积确定培养皿的个数。
在培养皿中加入适量的培养基
（0.2ml/cm2）并在培养前至少将培养皿放入培养箱中30分钟。
3.开启细胞冻存瓶前，先用乙醇或异丙醇消毒。
在无菌区内，将瓶盖旋开约1/4圈以释放
压力，然后再旋紧。
在37℃水浴中将细胞快速解冻，注意不要浸没整个冻存瓶。
仔细注意冻存瓶，当最后一片冰融化后将冻存瓶取出。
解冻超过2分钟会导致细胞功能无法达到最佳状态。
4.用移液管将冻存瓶中的细胞悬浮液分装至事先准备好的培养皿中。
轻轻摇动培养皿使细
胞均匀分布，放回培养箱。
5.不要用离心分离法移取冻存液中的细胞。
该方法比培养皿中残存DMSO对细胞造成的
损伤更大。
传代
下述操作程序均针对25cm2的培养皿。
对于其它大小的培养皿需相应改变试剂用量。
第一份培养皿的传代准备：
1.当细胞达到70-90%融合并呈现许多有丝分裂象的时候，即可进行传代。
2.对于每25cm2要进行传代的细胞：
a.解冻2ml Trypsin/EDTA至室温。
b.取7-10ml的HEPES并达室温。
c.取4ml Trypsin中和液（TNS）并达室温。
d.取出培养基并达室温。
3.准备新的细胞传代培养皿。
4.一次进行一份培养皿的传代。
接下来所有的培养皿将按照第一份的最优化条件进行传代
（细胞数，细胞成活率，接种密度）。
在无菌区内：
1.从培养皿中抽去培养基。
2.用5ml HEPES冲洗细胞。
不要遗漏该步骤。
培养基中含有中和trypsin的多种蛋白质及
钙离子。
3.从培养皿中抽去HEPES。
4.向培养皿中加入2ml的Trypsin/EDTA。
5.在显微镜下观察细胞层。
6.将加入Trypsin的培养皿置入培养箱（胰蛋白酶消化）直到约90%的细胞驱集。
整个过
程依不同细胞种类约需要2-6分钟。
7.将培养皿在掌心轻敲使多数细胞脱壁。
如果仅有少数细胞脱壁，可能是消化的时间太短。
30秒后再次轻敲。
如果细胞仍然不脱壁，稍候并每30秒轻敲一次。
8.细胞脱壁后，用4ml Trypsin中和液中和培养皿内的trypsin。
如果多数细胞在7分钟内
未脱壁，原因是trypsin的温度不够或活性太低致使细胞无法脱壁。
按照前述的过程，向培养皿中加入新鲜的温Trypsin/EDTA进行再次消化，或者向培养皿中加入新鲜的温培养基，放回培养箱中直到准备好新鲜的胰蛋白酶消化试剂。
9.迅速将脱壁的细胞移至15ml的消毒离心管。
10.用2ml HEPES冲洗培养皿收集残留的细胞，然后加入到离心管中。
11.用显微镜观察细胞采集后的培养皿，观察残留的细胞数量。
残留量应少于5%。
12.将采集的细胞在220 x g离心5分钟。
使细胞粒化。
a. 抽去大部分上层清液，剩余100-200μl。
b. 用指尖快速轻敲管底使粒化细胞松弛。
13.用2-3ml 培养基稀释细胞，并记录稀释细胞悬浮液的体积。
14.进行细胞计数。
记录细胞收率（细胞总数）备用。
15.如果需要，向悬浮液中加入适量HEPES以达到需要的细胞密度（cells/ml）并再次计数。
16.利用下面的方程计算成活细胞的数量。
成活细胞数=细胞总数×成活百分率
17.利用下面的方程计算接种细胞的培养皿总数。
培养皿总数取决于细胞收率及接种密度。
如果在孔板上接种，建议接种密度为10000cells/cm2。
培养皿总数=成活细胞数/生长面积×接种密度
18.利用下面的方程计算单份培养皿中细胞悬浮液的体积。
单份培养皿中细胞悬浮液体积=稀释细胞悬浮液的体积/培养皿总数
19.在每个培养皿上注明传代数，细胞株数，细胞类型及日期。
20.按照0.2ml/cm2向新的培养皿中慢慢加入新鲜培养基。
21.用移液管反复抽吸细胞悬浮液确保细胞的均匀分散。
按照单份培养皿中细胞悬浮液体积
分装至事先准备好的传代培养皿中。
如果不是使用通风盖，旋松培养皿的盖。
将新的传代培养皿放入培养箱中。
换液
1.接种的转天进行换液，此后隔天进行换液。
随着细胞的融合，按照下面的标准增加培养
基的体积：融合率低于25%，培养基密度为0.2ml/cm2。
融合率在25-45%，培养基密度为0.3ml/cm2。
融合率超过45%，培养基密度为0.4ml/cm2。
2.在无菌容器中准备适量37℃的培养基。
从培养皿中抽去旧培养基，更换为新鲜的温培养
基并放回培养箱。
3.避免培养基的反复加温和冷却。
每次准备的培养基体积够单次换液使用即可。
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产品保证
体外培养的细胞寿命有限。
1.冻存后培养的RPTEC具有确保实验使用的15代群体倍增。
2.增殖后培养的RPTEC具有确保实验使用的10代群体倍增。
3.超过产品保证次数的群体倍增和传代是可能的，但会导致传代后细胞的生长率下降，生
物响应性和功能的劣化。
4.RPTEC在完全融合后会出现不可逆的接触抑制。
为避免细胞的损失，应在细胞达到80%
融合前进行传代。