免疫酶染色法
酶免疫细胞化学染色操作指南-1
酶免疫细胞化学染色操作指南-1一、材料和试剂1、玻片：须用免疫组化专用玻片，或用2%多聚赖氨酸包被处理玻片。
2、5-10%正常山羊血清封闭液，用PBS配。
3、3%牛血清白蛋白（BSA），用PBS配。
4、0.01M pH7.4 PBS5、1% BSA-PBS（含0.05% Tween20）6、AEC底物（1）底物缓冲液（20X） PH 4.6醋酸（分子量60.6） 30.6mlTriton X-100醋酸钠 3H2O（分子量136.1）66.68克加蒸馏水到960ml，调pH到4.6，最后加蒸馏水到总体积1000ml。
（2）AEC（20X）AEC 15mg/ml，溶在DMF（二甲基甲酰胺，分子式HCOH(CH3)2 分子量73. 10中）（3）0.6% H2O2（20X）临用时，（1）（2）（3）各50ul，在1ml双蒸馏水中混匀30分钟内有效。
7、DAB（即DAB-4HCL）（1）1.5克DAB在100ml水溶液中（20X）（2）1M Tris（20X），用HCl调PH到7.4（1）（2）（3）各滴加入1ml二蒸水中，新鲜配，避光，30分钟内有效。
溶解后（可加热到50℃），加水合氯醛50克（水合氯醛Chloral H yclrate，分子量165.4），枸橼酸1克，充分溶解，于棕色瓶中，室温或400C保存。
8、苏木素复染液苏木素 1克碘酸钠 0.2克钾矾 50克水 1000ml9、含10%及2%小牛血清的DMEM培养液。
10、3% H2O2：30% H2O21份，加9份双蒸水，临用时配。
11、细胞抗原玻片及96孔细胞抗原板12、封片液：1克明胶，溶于30ml 35℃水中，加入35ml甘油（或用甘油封片）和650mg石碳酸（先溶于0.6ml水中）。
二、细胞内源过氧化物酶阻断（使用HRP标记二抗或SP法时必须阻断）1、从冰箱取出细胞片或细胞板，置室温或37℃ 10-15分钟，使恢复温度。
特殊染色和免疫酶标检查结果
特殊染色和免疫酶标检查结果
特殊染色和免疫酶标检查是临床医学中常用的诊断手段，用于
帮助医生确定疾病的诊断和治疗方案。
特殊染色通常是指对组织或
细胞进行特殊的染色方法，以便观察特定的结构或病理变化。
这些
染色方法可以帮助医生诊断肿瘤、感染、炎症和其他疾病。
常见的
特殊染色包括伊红染色、铬酸铅染色、 PAS 染色等。
通过观察染色
后的组织或细胞结构，医生可以获得关于病变类型和程度的重要信息。
免疫酶标检查是利用免疫学原理进行的一种检测方法，通过检
测血清或其他体液中特定蛋白质的含量或活性来帮助诊断疾病。
常
见的免疫酶标检查包括 ELISA、免疫印迹（Western blotting）和
免疫组化等。
这些检查可以用于诊断感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤和其他疾病。
在临床实践中，特殊染色和免疫酶标检查通常是结合使用的。
医生会根据患者的临床症状和体征，结合这两种检查的结果，进行
综合分析和诊断。
这两种检查方法的结果可以为医生提供重要的诊
断依据，帮助他们制定合理的治疗方案。
总的来说，特殊染色和免疫酶标检查在临床诊断中起着非常重要的作用，能够为医生提供丰富的病理信息和免疫学信息，帮助他们准确诊断疾病，为患者的治疗提供科学依据。
常用免疫组化染色方法SP法免疫组化染色
常用免疫组化染色方法SP法免疫组化染色1. 原理：链霉素抗生物素蛋白（SA）是从链霉素中分离出的蛋白质，穿透组织的能力比ABC、PAP复合物大，反应速度快，它含有四个亚基，每个亚基都有与生物素（Biotin）连接的部位，且二者间有极强的亲和力，SA的等电位接近于6.5，近中性，而卵白素（Avidin）为10，因此，SA几乎不与组织中的内源性凝集样物质发生非特异性结合，使用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶放大系统，即可产生低背景、高放大效果。
S-P采用生物素标记的第二抗体与链霉素抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及基质素混合液来测定细胞和组织中的抗原。
2. 基本染色方法：（1）石蜡切片脱蜡至水。
（2）3%H202室温孵育5～10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
（3）蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。
（4）5～10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。
倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1～2小时或4℃过夜。
（5）PBS冲洗，5分钟×3次。
（6）滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10～30分钟; 或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10～30分钟。
（7）PBS冲洗，5分钟×3次。
（8）滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS 稀释)，37℃孵育10～30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10～30分钟。
（9）PBS冲洗，5分钟×3次。
（10）显色剂显色（DAB或AEC）。
（11）自来水充分冲洗，复染，封片。
（附，冰冻切片免疫组化染色步骤：冰冻切片4~8um，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3次。
用3%过氧化氢孵育5～10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗，5分钟×2次。
免疫酶技术
2．涂片的要求 无论采用何种酶标记法，若 用涂片法则需要将涂片完全干燥以后方能检 测。若不干燥，在操作过程中易发生脱膜现 象。虽然在前处理时有固定这一步，但为了 使细胞表面的分化抗原少受因固定带来的损 失，往往选择的固定剂和固定时间均不十分 满意。若较薄的涂片标本干燥72小时，可省 略固定这一步，能提高部分细胞分化抗原的 阳性表达。但必须控制好试验的渗透压，以 免细胞破坏。
7．结果观察 结果观察要及时，酶标法虽然可 保存较长时间不褪色，但不如新鲜时颜色鲜艳， 易观察。如对结果有疑问，可重复操作，加以证 实。
8．阳性反应的了解 在检测前应明确被检细胞 的分化抗原所在的部位，即在细胞膜表面和细胞 浆中及细胞核内，以利标本的前处理和阳性结果 的准确判断，以免造成假阴性或阳性结果的误判、 漏判。
湿盒
吸水纸 移液器
镊子
DAKO笔
载玻片
试剂可选即用型试剂 盒(小于100名/年)或 购买原液自行配置 (大于100名/年)
选取厚薄适宜、髓(血)膜较长的骨髓或血涂片一张
用利器将骨髓膜划分成数个小块
划分前
3 10 19 DR
13 68 MPO
金会利 04102
划分后 用铅笔在磨砂玻面处写上与小块骨髓 膜所相应的标记号并写上姓名、检测编号。
目前可选用的标记酶有辣根过氧化物酶 （HRP）、 碱性磷酸酶（AP）、葡萄糖氧化 酶（GOD）、β－D半乳糖苷酶（β－D－Gal） 等。以上这些酶因其纯度和活性及产品性质 相对较稳定且价格适中，广泛地被临床和实 验室所应用
Ab-1（Mo）来自细胞Ab-2（Ho）Ab-3（Mo）
APAAP法染色原理
卵白素
（Avidin）
生物素化Biotion （HRP/AP）
酶免疫组织化学染色技术 -回复
酶免疫组织化学染色技术-回复酶免疫组织化学染色技术（Enzyme ImmunoHistoChemistry, E-IHC）是一种常用于组织学研究和病理诊断的方法。
该技术基于免疫学原理，采用酶标标记抗体和细胞色素底物，通过酶的催化作用来检测组织中特定抗原的分布和表达水平。
本文将一步一步回答与酶免疫组织化学染色技术相关的问题。
第一步：样本处理样本处理是酶免疫组织化学染色技术的重要步骤，它的目的是保持组织结构和细胞膜完整性，同时保留目标抗原的免疫原性。
1. 固定化：将组织样本进行固定化处理有助于保持细胞和组织的形态学结构。
最常用的固定剂包括甲醛和乙醇。
甲醛能够形成甲醛-蛋白质交联，从而固定并保持组织中的抗原。
乙醇可以用于去除水分和酮糖，提高抗体的渗透性。
2. 残胶和抗原修复：许多抗原在标本固定过程中会损失其免疫原性，需要进行抗原修复。
常用的修复方法包括热处理、酶消化和酸碱处理等。
热处理通常使用高温蒸煮或压力加热，可使蛋白质水平解离，恢复抗原性。
酸碱处理则通过改变组织的PH值，使抗原解离。
第二步：抗体选择抗体是酶免疫组织化学染色技术的核心。
选择合适的抗体对于获得可靠的结果至关重要。
1. 一抗和二抗：酶免疫组织化学染色一般采用间接法。
首先，使用一抗与目标抗原特异性结合。
随后，使用标记有酶的二抗来识别和结合一抗，从而可视化目标抗原。
常用的二抗有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。
2. 选择合适的抗体：选择抗体需要考虑目标抗原的特异性和抗体的亲和性。
在选择抗体时，可以参考文献报道、试剂公司提供的抗体说明书和其他研究人员的建议。
第三步：酶标标记酶标标记是酶免疫组织化学染色技术的另一个关键步骤。
酶标标记抗体在靶抗原区域内催化底物，从而产生特定的染色反应。
1. 酶标物质的选择：常用的酶标物质有HRP和AP。
HRPHRP常用于DAB法（diaminobenzidine）和AEC法（aminoethyl carbazole）等反应体系中，可产生棕色至棕黑色反应。
免疫组织化学染色
免疫组织化学染色
免疫组织化学染色(Immunohistochemical Staining,IHC)是一种常见的组织学检测方法，用于确定细胞或组织中特定蛋白质的表达或位置。
这种技术实际上是将抗原源合成出抗体，利用免疫相互作用(两抗体一抗原)在细胞内或细胞外测定有无抗原物质。
这种技术有许多种变式，其中一种叫做实时双标定量免疫组织化学染色(RQ-IHC)，可以用来检测癌细胞内外的抗原表达。
染色十分具体：首先，切取患者的取样以供检测，然后将组织片放在真空显微镜的底部，将抗体滴在表面上并使其完全覆盖，然后将片子放置在一定温度的溶液中培养，以促成抗体和抗原之间的结合。
最后，借助细胞标记小分子，将抗原特异性滴在含抗体片上，以实现染色。
此外，还可以使用磁珠，是特殊磁性微球，将抗体带入抗原，从而改善抗体和抗原的结合，从而提高染色的特异性。
IHC 染色为临床检测提供了重要佐证，在临床组织活检及肿瘤监测中有着重要的作用。
它可以帮助医生的诊断和行医判断，帮助选择治疗方法，更好地控制肿瘤的发展，最大限度地减小病人的痛苦。
IHC 染色在其他方面也有重要应用，尤其是在器官移植和临床药物开发中，它能够有效提高细胞和组织质量，并帮助研究者准确地检测细胞和组织中蛋白质的表达。
通过IHC 染色，可以帮助我们准确了解细胞组织的结构和异常状态，从而改善对各种疾病的辅助检测、诊断和治疗。
这一技术为临床医生提供了坚实的诊断成果，给患者带来了良好的治疗效果。
免疫染色方法
张宏
内 一、材料 二、试验方法
容
三、报告检验结果
一、材 料
（一）试剂 1. HRP-FIMcAb（辣根过氧化物酶标记F1抗原单克 隆抗体）：用PBS.T配制，常用应用浓度一般为 ELISA法应用浓度的2-3倍。 2. 固定液：柠檬酸0.5g，溶于75% 乙醇100ml， 30% H2O2 5ml，具有杀菌、固定标本和消耗内源 性酶活性三项作用。
FITC标记F1McAb染色鼠疫菌
鼠疫菌
呈明亮的黄
绿色荧光如 夜色中的灯 笼
（四）报告检验结果
1.逐项填写报告单。
2.填写检验结果：
检验方法名称： FITC-FIMcAb免疫荧光染色检查鼠疫 菌试验
检验结果：检出免疫荧光染色阳性杆菌（+）或（++）
未检出免疫荧光染色阳性杆菌（-） 3.检验者：2人或2人以上签名 4.报告时间：__年__月__日__时
未看到未看到平均平均每视野有每视野有1155个个每视野每视野55个以上个以上满视野满视野hrpflmcabkap1ow氏染色鼠疫菌菌体鼠疫菌菌体被兰色晶体覆盖被兰色晶体覆盖晶体两端参差不晶体两端参差不齐与菌体平行齐与菌体平行不含不含flfl抗原的菌抗原的菌体被染成红色体被染成红色对照鲜明
HRP-F1McAb 免疫染色 检查鼠疫菌试验
6．观察记录结果：光学显微镜油镜检查
（1）标本染色结果必须与己知阳性、阴性对照
相符。
（2）按目测染色深浅与着染菌体量分级: 镜检：无色或仅见微弱染色，染色浅、明显可 见，染色清晰，染色浓厚。 按镜检染色清晰菌体量分级：未看到（-），平均
每视野有1-5个（+），每视野5个以上（++），
免疫酶组织化学技术
2 间接法
1) 石蜡切片脱蜡至水；
冰冻切片 室温干燥--丙酮固定----缓冲液漂洗溶去OCT包埋剂
2) 甲醇双氧水室温处理切片15～30min,封闭内源性过氧化物酶活性。 3) PBS漂洗
4) 0.1％～1％牛血清白蛋白(BSA),湿盒内室温孵育15～25’,然后吸去孵育 液,不冲洗.
5%～10％正常兔血清(或山羊血清),湿盒内室温孵育15～20’然后吸去。
3 GOD(葡萄糖氧化酶)：
以β-D-葡萄糖底物，被GOD氧化生成的H2O2，又作为
HRP的催化底物，最后仍可用DAB显色。 适用于两种酶的放大技术： 即用GOD和HRP分别标记第二和第三抗体(如第一抗体是 小鼠mAb，第二抗体为GOD标记的兔抗小鼠IgG，第三抗
体为HRP标记的羊抗兔IgG)，孵育液即含有葡萄糖，又 含有DAB，此法可提高免疫染色的敏感性和特异性。
(二) PAP法（过氧化物酶抗过氧化物酶法）
PAP复合物：
抗酶抗体 + 足量的酶 == 形成稳定的五角形复合物 (由三个过氧化物酶分子和二个抗酶抗体分子组成)
原理：三种抗体
PAP复合物代替了酶桥法中的抗酶抗体。 一抗 二抗---桥抗体 PAP复合物
要求：
抗酶抗体的动物种属应和制备第一抗体的动物相同。
非标记抗体酶法
--PAP法
原理：同酶桥法，只是把抗酶抗体-酶制成 复合物（PAP复合物），形成抗原-抗体1PAP复合物。
双PAP法
Hale Waihona Puke 优点：① PAP复合物结构很稳定，冲洗时酶分子不会脱落，灵敏度高，比酶桥法
高20倍； ② PAP是一种复合物，无游离免疫球蛋白存在，不易引起非特异性染色；
③ 双PAP法：通过两次连接桥抗体和PAP复合物，在抗原抗体复合物上结 合了更多的酶分子，使敏感性大大增强，更适用于常规石蜡切片中微量和 抗原性减弱的抗原检测。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
免疫酶染色法
(一) 原理
免疫酶染色法亦称免疫酶标组织化学法。
标本制备后，首先将其内源酶抑制，接着即可进行免疫酶染色检查。
常规的免疫酶染色法可分为直接法和间接法两种。
前者固定标本中的抗原直接与酶标抗体结合，达到酶染色目的；后者是抗原先与其抗体(第一抗体)结合后，再与酶标抗体(第二抗体)结合，而进行酶染色的。
免疫酶染色法的酶底物产物为不溶性物质，可沉着于抗原上，使其显色。
间接法虽然多一步骤，但使用范围广。
此外，酶标记第二抗体可用酶标记SPA或生物素与亲和素系统等代替。
(二) 材料和方法(以检测空肠弯曲菌为例)
1 材料
(1) 去除内源性酶试剂：1%H2O2甲醇溶液。
(2) 空肠弯曲菌免疫血清(第一抗体)：CjC37(鸡源)和CjP5(猪源)抗血清，自制。
(3) 驴抗兔IgHRP(第二抗体)：自制。
(4) 稀释液与洗液(pH值74 PBS)。
(5) 底物溶液(DABH2O2)：
①TrisHCl缓冲液(pH值76，005mol/L)。
②底物溶液，3，3二氨基联苯胺50mg、TrisHCl缓冲液100ml、过滤，4℃冰箱保存。
用前加H2O2，最终浓度为03%。
2 方法
(1) 标本制备：将疑似空肠弯曲菌病料或其培养物涂片，干燥，然后置除去内源性酶试剂中处理及固定10min。
(2) 冲洗：用PBS冲洗1次，沥干。
(3) 加抗血清：用稀释液对CjC37或CjP5抗血清(针对同源菌)作1∶160稀释，滴加在玻片上，置37℃于湿盒内孵育30min。
(4) 洗涤：3次。
(5) 加酶标记抗体：用稀释液对驴抗兔IgGHRP作1∶500稀释，滴加于玻片上，置37℃于湿盒内孵育30min。
(6) 洗涤：3次。
(7) 滴加底物溶液：室温作用20min，用自来水冲洗，终止反应，干燥，光学显微镜检查。
(三) 结果判定凡菌体被染成棕色或褐色，且形态弯曲者，均判为空肠弯
曲菌阳性；凡2～3个视野中，未发现被着色的弯曲形菌体或被鉴定菌不着色，均判为空肠弯曲菌阴性。
(四) 注意事项
1 涂片后，为了防止玻片上的标本面反置和号码混乱，应用一小片橡皮膏贴于玻片一端，并用铅笔编号。
2 滴加酶染色试剂时，玻片应沥干，并且各试剂滴加的量不宜过多，以防溢出。
3 孵育时，温箱内需放一水槽或将玻片置湿盒内孵育，防止酶染色试剂蒸发或干燥。
上海越研生物科技有限公司提供
+86-021-******** 55785281。