EGFP在肿瘤细胞中的表达调控(基因工程综合性实验)
EGFP在肿瘤细胞中的表达分析 PC
EGFP在肿瘤细胞中的表达分析彭超222008371042030西南大学生命科学学院，重庆 400715摘要：肿瘤基因靶向治疗已经成为目前肿瘤治疗研究最活跃的领域之一，其目的是在不损伤正常细胞的前提下，进行选择性杀伤或抑制肿瘤细胞。
目前已有大量靶分子被分离和鉴定，如端粒酶、血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶等，其中端粒酶是目前所发现的恶性肿瘤最广谱的分子标记，在绝大多数恶性肿瘤中被激活，而在正常体细胞中一般为阴性表达。
近年来研究人员利用人端粒酶逆转录酶（human telomerase reversetranscriptase，hTERT）基因在端粒酶阳性肿瘤细胞中高效表达的特点，构建用hTERT 启动子调控其它抗肿瘤基因的表达载体，靶向破坏肿瘤细胞已取得了较大进展。
由于慢病毒载体具有可感染细胞并整合DNA序列的、可转移较大的基因片段等优点。
本研究通过构建由hTERT 基因启动子介导绿色荧光蛋白基因表达的慢病毒载体, 并转染肿瘤细胞, 检测该启动子在端粒酶阳性的肿瘤细胞中eGFP 的表达情况。
关键词：eGFP hTERT 肿瘤TOPO克隆脂质体介导法第一部分文献综述靶向诱导肿瘤细胞凋亡近年来研究发现，肿瘤的形成与凋亡功能的失调密切相关，提出肿瘤的发生可能是肿瘤细胞异常增殖和其凋亡调控功能受到抑制共同作用的结果。
一些研究人员利用hTERT 启动子的肿瘤特异性，在其下游连接凋亡相关的抑癌基因或细胞因子，导入端粒酶阳性的肿瘤细胞，从而靶向诱导肿瘤细胞发生凋亡，已取得良好效果[7]。
Caspases 是近年来发现的一组存在于胞质溶胶中的结构上相关的半胱氨酸蛋白酶，在细胞的凋亡过程中发挥重要作用，其中Caspase-3是细胞凋亡的执行者。
Yang 等[8]利用构建的hTERT/re-Caspase-3系统，同时转染端粒酶阳性的鼻咽癌细胞CNE1、结肠癌细胞HRT-18、胃癌细胞MGC 和端粒酶阴性的正常上皮细胞Hacat，孵育48h 后，荧光显微镜下观察，肿瘤细胞呈典型的核固缩、核碎裂、核溶解的凋亡形态；流式细胞仪分析显示，三种端粒酶阳性的肿瘤细胞（CNE1、HRT-18和MGC）凋亡率为15%~20%，而端粒酶阴性的Hacat仅为1.5%~3.5%；动物试验将hTERT/re-Caspase-3直接注射在裸鼠肿瘤内，以不含Caspase-3的hTERT/SEAP 为对照，连续7d 后观察发现，hTERT/re-Caspase-3能显著抑制裸鼠肿瘤的生长，证实了hTERT/re-Caspase-3的体内外靶向抗肿瘤作用。
绿色荧光蛋白GFP在转化细胞和肿瘤细胞中的表达_于丽莉
胞 , 在荧光显微镜下用不同时间的蓝光持续激发 , 用 显微摄影自动感光时间来检测荧光强度的变化(20 倍视野)。同一批培养细胞去培养液和 P BS 洗涤后 , 分别置于室温和 4 ℃下 , 避光保存 , 观察不同时间荧 光细胞的数量及荧光强度的变化 。
3.共转染 :用 pcDNA3 -EG FP 、pSV -gal 两种质粒 分别以 1∶0 、1∶1 、1∶4 比值共转染到 COS -7 细胞 。
关键词 : GF P 表达 标记基因 肿瘤基因 治疗 中图号 : R 73 文献标识码 : A
The Expression of GFP Gene in Transformed and Tumor Cells
YU Lili , CHEN Shishu (Depart ment of Biochemistry , Research Center for Human Gene Therapy , SSMU , Shanghai 200025)
· 410 ·
上海 第 二 医 科 大 学 学 报 Acta Universitatis Medicinalis Secondae Sh anghai
V ol .20 N o.5 2000
图 2 FACS 计数荧光细胞 Fig 2 FACS sorting GFP fluorescent cell
4.分选 :共转染的细胞 48h 后 , 去培养液和 P BS 洗涤后 , 悬浮在 PBS 溶液中 , 荧光 激发细胞 分选仪 (FACS)在无菌条件下分选荧光细胞 。
结 果
GFP 基 因在 COS -7 细 胞 中的 表 达 用 pcDN A3 -EGF P 转染到 COS -7 细胞 , 对同一批实验细 胞分别用共聚焦 、荧光显微镜 、FACScan 计数来观察 测定 GFP 表达(图 1 , 2)。 转染后 8h GFP 开始表达 , 随着时间的延长 , 转染率逐渐增加 , 48 ～ 72h 转染率 最高, 表达持续 2 周左右 。在表达荧光稳定性的观 察中 , 分 别用 1 、5 、10 、15 、20 、30min 的蓝光 持续激 发 , 观察在 20 倍视野中显微摄影感光时间的变化 , 发现随着激发时间的延长 , 感光时间增加 , 荧光逐渐 减弱 , 但在 30min 时仍可观察到荧光细胞 。 同一批 细胞离开培养液后 , 分别放在室温及 4 ℃避光保存 , 在细胞未干且形态完好的情况下 4 ℃避光保存 96h , 荧光细胞数及荧光强度基本不变 , 而室温 48h 即看 到荧光细胞数减少和荧光强度减弱 。 显示 GFP 表达 的荧光具有一定的稳定性 。
融合蛋白EGFP-PPA原核表达及标记肿瘤细胞研究
Ｊ ｕ ｎ ｌ ｆ ｈｊ ｎ ｃ ＴｅｈＵｎｖ ｒｉ ｏ ｒ ａ ｏ ｅｉ ｇＳ ｉ ｃ ｉｅｓｔ Ｚ ａ — ｙ
Ｖｏ ＿ ７，Ｎｏ ４ ｕ ．２ １ ｌ２ ． ，Ｊ １ ０ ０
文章 编 号 ：１７ —８ １（００ ０ — ６ ５ ０ ６ ３ ３５ ２ １ ） ４０ １— ５
中 图分 类 号 ： ７ Ｑ２ ９ 文献标识码 ： Ａ
０ 引 言
肿瘤 细胞 侵袭 和转 移是 肿瘤 重要 特征 之一 ， 与肿 瘤 的恶性 程 度和肿 瘤 病人 的预后 有直 接关 系 ＿ ］ １ 。越 来
越 多 的证 据表 明 ， 肿瘤 细胞 表面糖 基 异常化 与 肿瘤 细胞 的侵袭 和转移有 密 切关 系 ， 些变 化包 括糖链 在合 成 这 水平 上 的差异 和特 殊糖 基结 构 的出现 ＿ ］ ３ 。因此 ， 究 细胞膜 表 面糖蛋 白及 糖链 结 构变化 对 于解释 肿瘤 细 胞 研 的形 成 、 发展与 转移 非 常重要 。植 物凝 集素 是一 类存 在 于大 多 数植 物 中的蛋 白质 或糖 蛋 白。它 的 最大 的特 点在 于 它们 能 识 别 糖 蛋 白和 糖 脂 ， 别 是 细 胞 膜 中复 杂 结 构 的 糖 链 ， 细 胞 膜 表 面 决 定 簇 。掌 叶 半 夏 特 即
不能识别肝正常细胞 Ｌ ２ 提 示实体 瘤细胞表 面显露的甘露糖残基被此融合蛋 白所识 别， ０， 说明 Ｐ Ａ识别具 有甘 露糖 Ｐ 表型的实体瘤细胞表面的一部分 ， 些实验结果 为进 一步 阐明甘 露糖显 露细胞在 肿 瘤发 生发展 中的 作用提供 了新 这
的研 究 手段 。
关 键 词 ： 基 化 ；掌 叶 半 夏 凝 集 素 ；融合 蛋 白 ；甘 露 糖 ；肿 瘤 糖
（细胞生物学专业优秀论文）增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因真核表达载体的构建与表达
二实验方法“。
”４”１技术路线１．１质粒构建藉弼丈学矮士学柱论定椽穗杰结果１质粒ｐＣＤＮＡ３．１“）和ｐＥＧＦＰ一１的双酶切鉴定ｐＣＤＮＡ３．１（＋）质粒经过ＢａｍＩｔＩ、ＮｏｔＩ双酶切后，电泳结聚（见阉ｌ一８）显示有一条５。
４Ｋｂ麓絷带，穰据ｐＣＤＮＡ３。
ｉ（＋）瘊粒酶窃图谱分析，该质救含有ＢａｍＨｌ和ＮｏｔＩ酶切位点各一个，经过双酶切后得到线性化载体ｐＣＤＮＡ３．１（＋）和另外一个很短的片段，电泳时这令缀籁静冀蔽燕出了璩瓣糖凝黢，最蘑凝胶上褥剿的条带聿誊合线往化载体ｐＣＤＮＡ３．１（＋）的长度，故可以验证所获质粒确为ｐＣＤＮＡ３．１（十）质粒。
ｐＥＧＦＰ－１蒺载经过８ａ硎ｉ、Ｎｏｔ｛瑟酶切鑫，电濠结莱（冕圈ｌ—Ｃ）鼹示有瓶条分别为３．５Ｋｂ卸０。
７Ｋｂ的祭带，根据ｐＥＧＦＰ—ｌ质粮酶切图谱分析，该质粒同样含商ＢａｍＨＩ和ＮｏｔＩ酶切位点各一个，经过载酶切籁得嚣露静蘩茜ＥＧＦＰ片段帮勇终一个鞍长豹的片段，电泳时凝胶上的条带符合鼹个片段的长度，数可以验证雕获质粒确为ｐＥＧＦＰ一１质粮。
豳ｌｐＣＤＮＡ３．１（＋）羊¨ｐＥＧＦＰ—ｌ质粒的酶切分毫斥Ａ：ＤＮＡ分子量标记：Ｂ：ｐＣＤＮＡ３．１（＋）质粒ＢａｍＨＩ、ＮｏｔＩ舣酶切Ｃ：ｐＥＧＦＰ－ｔ矮粒ＢａｍＨ｛、Ｎｏｔ｛鼹酶鞠鞫ｊｌ｜大学疆士学盈论文撩谗杰２垂缣质粒ｐＣＤＮＡ３．１（＋）－ＥＧＦＰ的酶稍釜定重组厦粒ｐＣＤＮＡ３。
ｌ（＋）一ＥＧＦＰ经过ＢａｍＨＩ单酶切基，电溶结果（见图２一Ｂ）显示有一条单一的６．１Ｋｂ条带，根据ｐＣＤＮＡ３．１－ＥＧＦＰ强谱分析，该质粒含有单一的ＢａｍＨＩ酶切位点，全长为６．１Ｋｂ左右。
耋组质粒ｐＣＤＮＡ３．１（＋）～ＥＧＦＰ经过ＢａｍＨｌ、ＮｏＬＩ双酶切蜃，电泳结果（见网２一Ｃ）显示有两条分别为５．４Ｋｂ和０．７Ｋｂ的条带，符台线赣ｐＣＤＮＡ３。
ｌ（十）载体和ＥＧＦＰ片段的长发，故可以验证所较质粒确为耋缀质粒ｐＣＤＮＡ３，ｌ《＋）－ＥＧＦＰ。
外源EGFP基因在肿瘤细胞中的稳定表达
近年来 ， 肿瘤疾病 已成 为仅次 于心血 管疾 病 的人 类健康第 二号 “ 手” 杀 。全球约有 几百种抗 肿瘤药 ， 抗
作 为筛 选标记 的新型克 隆载体 ， 建立起 了 以绿 白斑筛
选法筛选 阳性重组子的新方 法 。 总的来说 ， 构建稳定表达 Ｅ Ｆ Ｇ Ｐ基 因的细胞 株 ， 首
ｎｍａｃｌ Ａ ４ ）ｔ ｃｎｔ ｃ ｔ ｅ ｏｅ ｗｔ ｔｅＥ Ｆ ｏ ａｔｃｎｅ ｒｇ ｃｅｎ ｇｉ ｉｏ ｈ ｐｌ ａ ｏ ａｕ ｆ ｈ ｏ ｅ ｓ（ ５９ ｏ ｏｓ ｕｔ ｈ ｃｌ ｍ ｄｌ ｉ ｈ Ｇ Ｐｆ ｎｉ ａｃｒｄ ｓｓｒｅｉ ｎｖｔ ，Ｔ ｅａｐｉ ｔ ｎｖｌｅｏ ｔｅ ｌ ｒ ｅ ｌ ｈ ｒ — ｕ ｎ ｒ ｃｉ
肿瘤药的年平均增 长率高于 １％ 以上 ， ５ 大大高 于全 ， 发 ％ 研
新 作用机 制或新结构类 型的抗癌药物 已成为新药研 发 的热点。而药物 筛选模 型是 药物筛选 中的关 键 ， 过 通 模 型观察药 物与药 物靶标之 间 的相互作 用 ， 可直接 认 识 药物的基本作 用机制 ， 以便能开发 出选择性 高 、 毒副
ｍｏ ｅ ｈ ｏ ｇ ｔ ｄ ｉ ｇ ｉ ｉｏ ａ ｌ ａ ｉ ｏ ｗａ ｔ ｄｅ ．Ｂ ｌｃ ｒｐ ｒ ｔ ｎ，ｔ ｅＥＧＦ ｅ ｅ ｗ ｓｔａ ｓｅ ｔ ｄ ｉ ｔ ５ ９ ｃ ｌｓａ ｄ ｄ ｌ ｒ ｕ ｈ ｓ ｙ ｎ ｖｖ ｓｗｅｌ ｓｉ ｖｔ ｓ ｓ ｉｄ ｔ ｕ ｎ ｎ ｒ ｕ ｙ ｅｅ ｔ ｏ ａｉ ｏ ｏ ｈ Ｐ ｇ ｎ ａ ｒ ｎ ｆ ｃｅ ｏ Ａ ４ ｅｌ ｎ ｎ ｔ ｅ ｙｍｅ ｎ ｆ ｈ ４ ８ ａ ｄ ｇ ａ ｉｎ ｔ ｏ ，ｔ ｅｈ ｇ ＧＦ — ｘ ｒ ｓ ｉｎ ｃ ｌ ｈ ｔ ｕ ｔｒ ｄ ｆｒｅ ｐ ｎ ｉｎ ｗ ｒ ｈ ｒ ｄ ｏ ｔ ｈ ｎ ｉ ｈ ｎ ｂ ａ ｓｏ ｅ Ｇ １ ｎ ｒ ｄ ｅ ｔ ｔ ｍｅｈ ｄ ｈ ｉｈ Ｅ Ｐ ｅ ｐ ｅ ｓｏ ｅｌ ｔ ａ ｌ ｅ ｘ ａ ｓｏ ｅ ｅｆ ｅ ｅ ｕ ．Ｔ ｅａ ｔ ｓ ｃ ｕ ｏ ｉ — ｃ ｎ ｅ ｅｌ ｔ ｕ ｒ ｓ ｅ ｃ ｒ ｂ ａｎ ｄ ａ ｃ ｒｃ ｉ ｗｉ ｆ ｏ ｅ ｃ ｎ ｅ ｗｅｅ ｏ ｔｉ ｅ ． ｓ ｈｌ Ｋｅ ｗｏ ｄ ：Ａ ４ ｅｌ ；Ｅ Ｐ；ｔ ｅ ｓｒｔ ｇ ｆｅｅ ｔ ｐ ｒ ｔ ｎ ｙ ｒ ｓ ５ ９ｃｌ ｓ ＧＦ ｈ ｔａｅ ｙ ｏ ｌｃｒ ｏａ ｉ ｏ ｏ
EGFP在大肠杆菌E.coli中的表达与检测
质粒：携带目的基因的载体用于将目的基因导入E.coli细胞
启动子：控制目的基因表达的DN序列通常位于质粒上
终止子：控制目的基因表达的DN序列通常位于质粒上
复制子：用于复制质粒的DN序列通常位于质粒上
抗性基因：用于筛选含有目的基因的E.coli细胞的DN序列通常位于质粒上
表达条件的优化
温度：选择适宜的温度如37℃
培养基：选择含有丰富营养物质的培养基如LB培养基
诱导剂：选择合适的诱导剂如IPTG
培养时间：选择合适的培养时间如12-24小时
检测方法：选择灵敏度高、特异性强的检测方法如荧光显微镜或Western blotting
表达产物的检测与鉴定
荧光显微镜观察：观察荧光蛋白的表达情况
单击此处添加标题
单击此处添加标题
单击此处添加标题
单击此处添加标题
拓展EGFP的应用领域与范围
生物医学领域：用于细胞标记、基因表达检测等
生物制药领域：用于药物研发、药物筛选等
食品科学领域：用于食品检测、食品安全等
生物技术领域：用于基因工程、蛋白质工程等
农业科学领域：用于植物基因工程、抗病抗虫等
环境科学领域：用于水质监测、污染检测等
步骤：样品制备、抗原抗体孵育、酶催化底物显色、结果观察
优点：灵敏度高、特异性强、操作简便
应用：广泛应用于蛋白质、多肽、激素等生物大分子的检测
其他检测方法
荧光显微镜检测：通过观察荧光信号强度判断表达产物量
放射性标记检测：通过放射性标记检测表达产物量
生物传感器检测：通过生物传感器检测表达产物量
酶联免疫吸附试验（ELIS）：通过酶催化反应检测表达产物量
在药物筛选与开发中的应用
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取欧阳学文南方医科大学预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。
方法：从E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFPN3和质粒pET28a。
然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。
再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。
将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。
用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。
最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。
结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。
关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取目录1 前言32 实验目的43 实验设备44 材料及试剂55 实验操作步骤55.1操作流程55.2质粒DNA的分离与纯化65.2.1 质粒的培养65.2.2 质粒的DNA的碱提取法65.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化75.3酶切及连接85.3.1 双酶切85.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收）8 5.3.3 连接95.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化95.4.1 LB（LuriaBertain）液体和固体培养基的配制（参考附录）95.4.2．感受态细胞的制备 (CaCl2法)95.4.3 转化涂板105.5GFP蛋白的诱导表达105.6绿色荧光蛋白的粗提取11参考文献11附录121LB培养基的配制：122.溶液Ⅰ123.溶液Ⅱ124.溶液Ⅲ（100ML）125.DN ASEFREE RN ASE A136.TE缓冲液（P H8.0）137.20×TBE138.G ENE F INDER溴酚蓝上样缓冲液139．PEGFPN3质粒全图谱1310．P ET28A质粒全图谱141 前言绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
人端粒酶催化亚单位启动子驱动的EGFP真核表达载体的构建及在肺癌细胞的表达
ＺＨＵ ｈ ｎ — ｉ ｇ Ｓ ｅ ｇｍ ｎ 。
，
ＷＡ Ｇ Ｙ ｎｐｎ Ｃ Ｎ Ｘ ａ —ｅ ， ａｇＸａ － ｎ ，Ｘ Ａ ｎ Ｎ ａ —ｉｇ ， ＨＥ ｉｏｈ Ｔ ｎ ｉ ｊ Ｉ Ｏ Ｗｅ ｏｕ
（ ． ａ ｏａｏｙｏ ｌ ｕａ ｉｇ ｏ￣ｏ ａ ｃｒ ２ Ｌ ｂｒｔｒ ｕｇ Ｃ ｎｅ Ｍｏ ｃ ｌ Ｗ ｓ Ｃ ａ ｏａｏｙｏ Ｌ ｎ ａ ｃｒ ｌ ｕ ｒ， ｅ ｈｎ ｅ Ｄ ｆ ｅ ａ ｔ ａ
论
著 ・
人 端 粒 酶 催 化 亚 单 位 启动 子 驱 动 的 Ｅ Ｐ真 核 表 达载 体 的构 建 及 在 肺 癌 细 胞 的 表 达 ＧＦ
朱 圣 明 王 艳 萍 陈 晓禾 唐 小 军 肖 文 ， ， ， ，
（ ｔｌ 学华 西 医院 ，． Ｉ）大 ￣ｌ １肿瘤 分 子诊 断实 验室 ； ２ 肺癌 分 子实验 室 ， ． 四川 成 都 ６０４ ） １０ １
Ｃ ｎｔｕｔ ｎｏ ｕ ａｙｉ ｅｐ ｅｓ ｎｖｃｏ ｆ ｎ ａ ｃｄｇｅｎｆ ｏｅｃｎ ｅｐｏｅ ｒｖｎｂ ｏ ｓ ｃｏ ｆ ｋｒｔ ｘ ｒｓｉ ｅｔｒｏ ｈ ｎ ｅ ｒｅ ｕ ｒｓｅｃ ｒｔｉ ｄ ｅ ｙ ｒ ｉ ｅ ｃ ｏ ｅ ｌ ｎ ｉ
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
西南大学本科实验教学改革行动计划项目——综合性、设计性实验项目建设项目名称：EGFP在肿瘤细胞中的表达分析--基因工程课程综合性实验项目项目负责人：杨应斌负责人所在部门：生命科学学院填表日期：2010年6月16日EGFP在肿瘤细胞中的表达分析引言利用肿瘤组织特异性启动子调控自杀基因在肿瘤组织的靶向表达，是肿瘤基因治疗研究中的一种策略。
目前常用的肿瘤组织特异性启动子有：前列腺特异性抗原（PSA）启动子、癌胚抗原（CEA）启动子、人类端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子等。
其中hTERT在85%以上的不同组织起源的各种类型的恶性肿瘤中，都可以检测到较高水平的表达，而在正常哺乳动物体细胞中，除生殖细胞等少数几种细胞可检测到活性以外，其它组织细胞均为阴性。
由于hTERT启动子和其它启动子相比，具有广谱（在大多数肿瘤细胞中有活性）、转录活性高、靶向性好等优点，因而被认为是肿瘤基因治疗领域里较有潜在应用价值的启动子。
现已有使用hTERT启动子成功对骨肉瘤、结肠癌、肝细胞肝癌等恶性肿瘤进行靶向基因治疗的报道。
人类骨髓干细胞不具有端粒酶活性已经被报道，然而Burns JS的研究发现，长时间在体外培养的干细胞可能发生癌变，其原因是其开始表达端粒酶。
而肿瘤细胞之所以能够无限增殖，也与其有比正常细胞活跃的端粒酶有关。
hTERT基因的转录机制严格控制着端粒酶的活性的表达，而hTERT基因的转录被hTERT基因启动子调控，hTERT基因启动子是一种在肿瘤细胞中特异启动的启动子，因此，我们构思可以利用hTERT基因启动子，在其下游接入自杀基因，并将其克隆入慢病毒载体中，再借助慢病毒将此融合基因导入骨髓干细胞中，筛选出含有由hTERT基因启动子控制自杀基因的供体骨髓干细胞，当这种移植的骨髓干细胞在植入体内后有形成肿瘤细胞的趋势时，就可以通过自杀基因的表达使用前体药物对有瘤变趋势的骨髓干细胞进行杀灭，这样既不会对受体产生副作用，又可以由此解决骨髓干细胞移植的安全性问题。
因此构建一种靶向表达自杀基因的载体，这种载体转染骨髓干细胞后能很容易筛选，并且被转染的骨髓干细胞能稳定表达自杀基因且不会发生丢失，这将成为骨髓干细胞移植瘤变研究中关键且必要的步骤。
然而，在本研究的前期实验中，我们发现野生型hTERT启动子如其他已知肿瘤组织特异性启动子一样，仍然存在着肿瘤组织转录活性与靶向性较差的问题，而不能保证将导入体内的自杀基因限制在肿瘤细胞中特异性地表达。
因此，如何利用肿瘤细胞中特异性的表达上调因子结合元件对hTERT启动子进行顺式修饰，以提高hTERT启动子在骨髓瘤变细胞中的转录活性是本节研究所关注的重点。
据研究表明，c-Myc基因的大量扩增是促使癌细胞无限增殖的重要原因，转录因子c-Myc（或c-Myc与其它转录因子形成的二聚体复合物）与hTERT启动子上的E-box结合后可以启动hTERT基因的在肿瘤细胞中特异性表达，但在正常细胞中的表达较低甚至缺乏。
通常情况下，在肿瘤细胞中c-Myc表达占优势，c-Myc 转录因子（c-Myc或与Max 蛋白形成异二聚体复合物）在识别和连接E-box后，激活hTERT基因转录；而在正常细胞中mad1表达占优势，mad1（或mad1和Max 蛋白形成异二聚体复合物）和c-Myc竞争识别和连接E-box后，抑制hTERT 基因转录。
进一步的研究表明，在hTERT启动子核心序列上含有两个E-box（5＇-CACGTG-3＇），分别位于hTERT基因起始密码子ATG上游-34和-242位置上.敲除-34 位E-box，可使启动子活性下调10倍，与无启动子时的表达水平相似，但缺失或敲除-242bp 位置处E-box时，hTERT启动子活性只是不同程度的下降。
说明hTERT启动子核心序列3＇端位置的E-box保守序列对维持hTERT启动子功能具有更加重要的作用。
因此，我们假设c-Myc转录因子与hTERT启动子上的结合元件（E-box）结合（特别是与hTERT启动子核心序列3＇端位置处的E-box保守序列结合）后可以上调hTERT的表达，那么增加hTERT启动子序列上E-box元件（特别是hTERT 启动子３＇端的E-box元件）的数量后，势必会引起转录因子c-Myc（或c-Myc 与其它转录因子形成的二聚体复合物）和转录抑制因子mad1（或mad1与其它转录因子形成的二聚体复合物）与hTERT启动子结合机会增加，最终导致hTERT 启动子在肿瘤细胞中转录活性得到进一步的提高。
材料准备1质粒、菌株和细胞质粒pLenti6/V5-D-TOPO (invitrogen)质粒pUC-ModhTERT （实验室自行化学法制备）质粒pUC-WThTERT （实验室自行化学法制备）质粒pGL3-basic(Promega)大肠杆菌菌株ER2925(NEW GENE)大肠杆菌菌株stab3 (invitrogen)阳离子脂质体liperfectamine2000(invitrogen)293T细胞株（由本实验室提供）2 主要试剂氯霉素(购于GIBCO )卡那霉素(购于GIBCO)酵母提取物（购于Oxoid）胰蛋白胨（购于Oxoid）质粒DNA抽提试剂盒（购于Promega）DNA凝胶片段回收试剂盒（购于Promega）琼脂糖(购于Sigma.Co) Goldenview (购于赛百盛)Tris: （购于XX生工）EDTA: （购于XX生工）HCL: （购于XX生工）甘油：（购于XX生工）3相关工具酶ＣlaI (购于Promega)BamHI(购于Promega)T4 DNA 连接酶(购于TaKaRa)Pyrobest DNA Polymerase (购于TaKaRa)4主要实验设备与仪器准备PCR仪：TC-312（TTECHNE）恒温摇床：（XX科学仪器厂）生化恒温培养箱：（XX跃进医疗器械一厂）恒温水浴加热器（汉科学仪器厂）超净工作台：（苏净安泰中国）普通高速离心机（Appendorf 5417）低温冷冻离心机（Beckman）电泳仪：（六仪器厂）微量蛋白质核酸定量仪（Appendorf）凝胶成像系统(Bio-Rad USA)低温冰箱NV-6382E （日本/NV公司）恒温水浴加热器（XX科学仪器厂）紫外分光光度计U-1800 （日本日立公司）超纯水器D7035 （BARNSTEAD THERMOLYNE）5试剂配制①LB(Luria-Bertani)培养液、平板的配制1)LB培养液用天平称取1g酵母提取物、2g胰化蛋白胨、1gNaCl于500毫升的三角烧瓶中，加入200毫升去离子双蒸水溶解，用5mol/L NaOH(约0.2mL)调节pH值至7.0，然后120℃高压蒸汽灭菌20min。
2)LB琼脂平板的配制：先按上述配方配制液体培养基，临高压灭菌前加入琼脂糖3g ，同法高压蒸汽灭菌20min。
从高压灭菌器取出培养基时应轻轻旋动以使熔解的琼脂糖能均匀分布于整个培养基溶液中，应使培养基降温至50℃时，加入抗生素等不耐热的物质。
为避免产生气泡，混匀培养基时应采取旋动的方式，然后可直接从烧瓶中倾出培养基铺制平板。
在90mm直径的培养皿需加入30mL培养基，培养基完全凝结后，应倒置平皿并贮存于4℃备用。
3) 抗生素贮存液的配制氯霉素（34mg/mL）: 用少于10毫升的无水乙醇溶解340mg氯霉素，最后定容至10mL。
分装入1.5毫升的离心管中, 每管1毫升,于-20℃贮存备用。
氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)：用少于10毫升的双蒸水溶解1克氨苄青霉素,最后定容致10毫升, 再分装入1.5毫升的离心管中, 每管1毫升,于-20℃贮存备用。
4) 含抗生素液体培养基的配制氨苄青霉素液体培养基: 在配置好的1000毫升LB液体培养基中加入上述氨苄青霉素贮存液1毫升,混匀即可.氯霉素液体培养基: 在配置好的1000毫升LB液体培养基中加入上述氯霉素贮存液10毫升,混匀即可.5) 含抗生素固体LB培养基的配制先按上述LB固体培养基配制的方法配制2瓶200mL培养基,经灭菌后待液体温度降至55-60℃时分别加入氯霉素、氨苄青霉素贮存液便得到相应的抗生素固体培养基6) 新鲜氯化钙转化液的配制在200mL纯水中（Milli-Q水或相当级别的水）溶解54g CaCl2·6H2O，用0.22滤器过滤除菌，用15mL的离心管分装成10mL小份贮存于－20℃。
制备感受态细胞时，取一小份融化，用纯水稀释至100mL，用Nalgene滤器（0.45μm孔径）过滤除菌，然后骤冷到０℃即可。
6) 50×Tris-乙酸(TAE)的配制50×浓贮存液：称量242g Tris 碱,量取57.1mL 冰乙酸,100mL 0.5mmol/LEDTA(pH8.0)定容至1000mL。
7) 1×TAE的配制将配置好的50×TAE稀释50倍即得到1×TAE６感受态大肠秆菌的制备①保存于-70℃的大肠杆菌菌株DH5a、stab3及ER2925用接种环划菌于1.5%琼脂平板上，37℃恒温倒置培养至单菌落出现（约14-16 hr）。
②挑取单菌落，接种于2.0mL LB液体培养基中，37℃恒温，250g振荡培养过夜（约12hr）。
③取0.5mL 过夜培养液，接种于100mL LB液体培养基中，37℃振荡培养2-2.5hr，至OD600为0.4-0.5时，放置于4℃冰箱冷却1-2hr。
（注：以下操作均应在冰浴中进行。
）④将培养液分入两个50mL离心管中，4℃，离心10min（4000rpm），弃去25mL悬浮30min。
上清，用冰浴的0.1M MgCl2-甘⑤4℃离心, 离心10min（4000rpm），弃去上清，加入冰浴的0.1M CaCl2油溶液1mL悬浮。
⑥以100μL/管分装入1.5mL离心管中，-70℃冻存备用。
2.2.9质粒的转化①取2管（100μL）贮存于-70℃DH5α感受态ER2925大肠杆菌置于冰上待用；②分别加入pLenti6/V5-D-TOPO和pUC57-ModhTERT、pUC57-WThTERT （0.5μg/μL）质粒5μL，旋转混匀，冰浴20min；③迅速放入42℃水浴锅中热休克90s，迅速转移至冰浴中，继续冰浴2-3min；④加入LB液体培养基600μL，于37℃缓摇孵育90min；⑤培养结束后，12000rpm离心15秒，倾去上清，保留100μL左右的菌液；⑥将100μL的菌液涂布于含有氯霉素(34μg/m1)抗性的平板LB培养基中,于37℃温箱孵育至胶表面没有液体流动时（约2hr），然后翻转平皿37℃倒置培养16hr。