大豆组织特异启动子的克隆与功能分析

大豆组织特异启动子的克隆与功能分析曹译文;宋阳;渠可心;王丕武【摘要】采用同源序列法克隆得到了大豆根部特异性启动子、种皮特异性启动子、种子特异性启动子,核苷酸序列大小分别为2 500bp、1 832bp、1 268bp,分别具有CANNTG-motifs、GATA-box、ACGT等启动子表达元件,并分别构建了这3个组织特异性启动子的植物报告表达载体.通过农杆菌介导法将3个表达载体转入烟草NC89,通过组织化学染色和GUS基因的相对表达量分析验证3个启动子的功能.通过转化获得了根部特异性启动子转基因烟草植株11株,种皮特异性启动子转基因烟草植株4株,种子特异性启动子转基因烟草植株8株,转35S启动子启动GUS基因的阳性烟草植株7株.GUS化学组织染色结果表明,克隆得到的根、种皮、种子特异性启动子都表现为组织特异性表达,表达水平明显高于叶片、茎部、花等部位.进一步的荧光定量PCR结果显示,根部特异性启动子GUS的相对表达量在根部最高,而在茎、叶、种子、种皮、花中表达量较低;种皮部特异性启动子GUS的相对表达量在种皮最高,而在根、茎、叶、种子、花中表达量较低;种子特异性启动子GUS的相对表达量在种子最高,而在根、茎、叶、种皮、花中表达量较低,但是与35S启动子相比,这3个特异性启动子的GUS相对表达量在相应的组织均低于35S启动子.%In this study,the soybean root specific promoter,seed specific promoter and seed coat specific promoter were cloned by homologous sequence method respectively.Their sizes were 2 500bp,1 832bp and 1268bp.They had different expression elements including CANNTG-motifs,GATA-box,ACGT.Three plant expression vectors of these tissue specific promoters were constructed and transferred into Nicotiana tabacum NC89 by Agrobacterium-mediated method to prove GUS activityof different promoters.Soybean root,seed coat and seed specific promoter nucleotide sequence were isolated by PCR method.Then 11 root specific promoter transgenic plants,4 seed coat specific promoter transgenic plants,8 seed specific promoter transgenic plants,and 7 35S-promotertransgenic plants had been obtained.GUS activity assays indicated that GUS gene expression level in root,seed and seed coat were higher than leaf,shoot and flower.Further quantitative real time PCR results showed that the expression levels of GUS gene of root specific promoter in root were higher than those in stem,leaf,seed,seed coat and flower;the expression levels of GUS gene of seed coat specific promoter in seed coat were higher than those in root,stem,leaf,seed and flower;the expression levels of GUS gene of seed specific promoter in seed were higher than those in root,stem,leaf,seed coat and flower.But the expression levels of GUS of these three tissue specific promoters were lower than those of 35S promoter in each tissues.【期刊名称】《中国油料作物学报》【年(卷),期】2017(039)006【总页数】7页(P771-777)【关键词】启动子;组织特异性;基因表达;相对表达量分析【作者】曹译文;宋阳;渠可心;王丕武【作者单位】吉林农业大学农学院植物生物技术中心,吉林长春,130118;吉林农业大学农学院植物生物技术中心,吉林长春,130118;吉林农业大学农学院植物生物技术中心,吉林长春,130118;吉林农业大学农学院植物生物技术中心,吉林长春,130118【正文语种】中文【中图分类】S565.103启动子是调控目的基因的重要顺式作用元件。

根据启动子的功能，可以将其分为以下三种：诱导性启动子、组成型启动子和组织特异性启动子［1］。

组成型启动子表达不受外界环境的影响，所启动基因的表达具有持续性，几乎可以在多数或者全部组织中持续表达。

组成型启动子又包含异源组成型启动子和来自于植物自身的组成型启动子［2］。

如花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子是典型的异源组成型启动子［3］，能调控烟草［4］、拟南芥［5］、马铃薯［6］等转基因植株中的异源基因。

色氨酸合成酶蛋白β亚基基因（PTSB1）和植物光敏色素B基因（PPHYB）是来自拟南芥植物自身的组成型启动子，Naomi等验证了这两种启动子转基因烟草的GUS活性，与CaMV35S启动子相比，发现PPHYB和PTSB1启动子的GUS活性高了一半以上［7］。

魏晶从籼稻品种明恢63中获得了PSUI1启动子，该启动子在水稻发育幼苗期、抽穗期、成熟期均能表达。

进一步研究表明，玉米Ubiquitin启动子的活性为PSUI1启动子活性的2～3倍，但其稳定性与PSUI1启动子相比较差［8］。

大量研究表明，外源目的基因在植物中持续性的表达，消耗了植物体内自身储藏的大量营养物质和能量，外源目的基因合成并积累大量异源蛋白质及代谢产物，导致植物体自身代谢紊乱，有毒物质积累，影响植株正常的生长发育［9］。

因此与组成型启动子相比，组织特异性启动子可大大减少对植物体内物质和能量的过度消耗。

目前有研究人员成功获得各种类型的组织特异性启动子。

周晓红等首次从番茄中克隆并测出番茄果实特异性启动子E81．1序列［10］。

Govender从玉米自交系‘N19’中克隆出一个茎特异性启动子［11］。

目前，在植物中克隆了果实、茎、豆荚、花等组织特异性启动子，并且广泛应用于水稻、玉米、番茄等作物中［12～14］。

但用于大豆转基因研究的组织特异性启动子报道较少。

目前的研究多集中在35S启动子启动外源抗除草剂基因，目标基因在全株的各个时期各个部位都进行表达，造成了植株整体消耗过大，影响大豆植株的正常生长发育。

因此，研究大豆组织特异性启动子对外源基因表达效率的影响，对在大豆中定向表达外源基因有着重要的理论意义和应用价值。

本研究采用同源序列法，克隆了大豆根部、种子和种皮特异性启动子，采用农杆菌介导法将3种不同的启动子的植物表达载体转化烟草进行功能分析，通过对外源基因进行分子检测和相对表达量分析，验证了不同启动子对目标基因存在特异性表达，为三个启动子在大豆或其他植物上的进一步应用奠定基础。

1 材料与方法1．1 材料大豆品种为吉农18，烟草品种为NC89，植物表达载体质粒为 pBI121－RSP、pBI121－SCSP、pBI121－SSP和 pBI121，大肠杆菌DH5α（E．coli DH5α）和农杆菌EHA105等，均由吉林农业大学植物生物技术中心提供。

1．2 大豆组织特异性启动子片段的克隆采用Plasmid Minspin HP Kit试剂盒提取植物表达载体 pBI121－RSP、pBI121－SCSP、pBI121－SSP、pBI121的质粒DNA，从大豆的幼根提取大豆基因组DNA，分别根据大豆根部特异性启动子RSP（GenBank登录号为AF520576）、种皮特异性启动子SCSP（GenBank登录号为 AF014502）、种子特异性启动子SSP的核苷酸序列（GenBank登录号为AB237643），利用 Primer Premier 5．0软件设计相应的特异性引物，引物序列见表1，引物由三博远志公司合成。

PCR条件见表2。

表1 PCR引物Table 1 Primers used for PCR注／Note：RSP：根部特异性启动子 Root specific promoter；SCSP：种皮特异性启动子 Seed coat specific promoter；SSP：种子特异性启动子 Seed specific promoter；其中下划线部分为酶切位点Underlines indicate enzyme cutting sites启动子名称Promoter name 上游引物Upstream primer 下游引物Downstream primer RSP 5′－TTTCTGCAGGACTTCCATGTGAACTTG－3′ 5′－TTTCCATGGGCTTGTGCTTATTATGCC－3′SCSP 5′－TTTGGATCCCCACTACTAATAGACGC－3′ 5′－CCCAAGCTTCTCTTTGTAATCTCACC－3′SSP 5′－GGGAAGCTTTGCTTGGATTTGGACCAG AC－3′（HindⅢ）5′－TTTGGATCCTAGGATATTGAACTA GTTCT－3′（BamHⅠ）PCR扩增产物采用V－gene凝胶回收试剂盒纯化后连入克隆载体pMD18－T Vector；连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过蓝白斑筛选，挑取白斑提取质粒DNA，通过PCR和酶切鉴定获得重组质粒，对重组载体测序后进行BLAST分析，测序由北京三博远志生物技术有限公司完成。