NF-kB 炎症相关肿瘤的启动因子
NF—κB在TNF诱导凋亡中的作用
NF—κB在TNF诱导凋亡中的作用标签：TNF；NF-κB；凋亡；肿瘤细胞众所周知，TNF可诱导肿瘤细胞发生凋亡。
在这一过程中，NF-κB会被激活，同时还可抑制肿瘤细胞发生的凋亡[1-3]。
细胞可以通过NF-κB这一通路产生抗凋亡效用和起到转导信号的作用。
NF-κB的研究日渐增多，其中在TNF诱导肿瘤细胞发生凋亡的过程中的作用逐渐被重视。
1 NF-κB的定义核转录因子（nuclear transcription factor）是一种能与启动子区的固定核酸序列结合从而激活基因的转录功能的特殊蛋白质。
有一种核蛋白因子，能特异结合免疫球蛋白κ链基因上GGGACTTTCC这一增强子序列，然后促进细胞表达κ轻链，这种蛋白质最早发现于B细胞的核提取物中，所以被称做NF-κB。
目前，将其归为NF-κB/ReL蛋白家族成员，此家族成员目前包括以下几类：（1）p50及其前体p105 （NF-κB1）；（2）p52及其前体p100 （NF-κB2）；（3）C-Rel；（4）P65 （RelA）和（5）RelB。
此家族成员均包含一个氨基末端，包括DNA结合部位、二聚体化部位以及和IκB结合的位点-NLS（nuclear translocation signal），主要负责形成二聚体，与DNA以及抑制蛋白IκB结合，此氨基末端来源非常保守，由300个左右氨基酸组成，称为Rel同源区（rel homology domain，RHD）或NRD（NF-κB/ReL/dorsal），RHD含有的NLS定位序列可以促使活化的NF-κB 进入细胞核而实现本身的功能。
NF-κB二聚体与DNA结合后，可形成一个有活性的结构。
NF-κB/ReL蛋白大家族各成员之间可以形成同源的或异源二聚体，而这些蛋白二聚体不同的组成结构的结合序列也不相同，而且各自具有各自的特性，DNA靶目标的细微不同都可以被NF-κB二聚体的不同形式识别出来，从而使得面对不同的调节对象基因或序列时，NF-κB的不同亚单位形式的表达能力得到相应的保证。
NF-κB信号通路与炎症反应
自从１９８６年，Ｓｅｎ等在哺乳动物细胞中发现了 一种潜在的转录调节因子一ＮＦ—ＫＢ以来，关于ＮＦ—ＫＢ 各方面的研究迅速发展。ＮＦ—ＫＢ可以被多种刺激因 子诱导而迅速从抑制状态转化为活化状态，它几乎 存在于所有细胞中，是由Ｒｅｌ家族构成的二聚体蛋 白。Ｒｅｌ家族可分为两组：第一组包括ｐ５０（ＮＦ— ＫＢｌ）和ｐ５２（ＮＦ．ＫＢ２）蛋白；第二组包括ｐ６５（Ｒｅｌ
导型一氧化氮合酶（ｉＮＯｓ）。另外，经过ＮＦ—ＫＢ诱导 产生的蛋白，比如ＴＮＦ仪，同样会活化ＮＦ－ＫＢ，即产生 一种恶性循环而扩大最初的炎症反应‘９ｌ。
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图２与自身免疫有关的ＮＦ—ＫＢ活化经典通路
型小鼠中，自噬的减少可以增加ＩＫＢ的积累从而抑
去泛素化酶，敲除编码Ａ２０的基因会导致持续性的 炎症反应（Ｌｅｅ等．２０００）。 二、ＮＦ．ＫＢ信号通路相关疾病及通路阻断策略 （一）ＮＦ—ＫＢ信号通路概述 ＮＦ—ＫＢ信号通路 经促炎因子、ＴＮＦ仅、ＡｎｇⅡ等多种刺激因子诱导后， 在下游调节白细胞介素相关基因、凋亡抑制因子、编 码粘附因子相关基因等多种基因的表达。ＮＦ—ＫＢ信 号通路不仅参与机体免疫调节、炎症反应及肿瘤等 生理病理过程，还参与感染、细胞周期调控、细胞分 化及凋亡等。因此ＮＦ—ＫＢ信号通路在机体的多种 生理过程中起重要的调节作用。近年来，ＮＦ－ＫＢ信 号通路与人类疾病的相互关系越来越受到重视。如 上文所述，ＮＦ—ＫＢ信号通路的活化若不能及时消退 便会导致病理反应，如类风湿性关节炎、系统性红斑 万方数据
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NF-kB信号通路
NF-kB信号通路NF-κB信号通路图解NF-κB最初是R.Sen和D.Blatimore于1986年在B细胞中发现的⼀种核转录因⼦，能特异性结合免疫球蛋⽩κ轻链基因的上游增强⼦序列并激活基因转录，此后发现它⼴泛存在于⼏乎所有的真核细胞中。
NF-κB信号通路可调控多种参与炎症反应的细胞因⼦（如IL-1、IL-6、TNF-α）、粘附因⼦和蛋⽩酶类基因的转录过程，以应答多种胞外信号刺激，包括病毒侵染、细菌和真菌感染、肿瘤坏死因⼦、⽩细胞介素等细胞因⼦，甚⾄离⼦辐射，产⽣免疫、炎症和应激反应。
并影响细胞增殖、分化及发育。
NF-κB通常以异⼆聚体形式存在于细胞质中，两个亚基p65和p50在N端共享⼀个同源区，以确保其⼆聚化并与DNA结合，核定位信号（NLS）也位于此同源区。
在细胞处于静息状态时，NF-κB在细胞质中与⼀个抑制物I-κBα结合，处于⾮活化状态，同源区的NLS也因抑制物的结合被掩盖。
当细胞受到外界信号刺激时，胞质中异三聚体I-κB激酶（I-κBkinase）被激活并磷酸化I-κB抑制物N端2个丝氨酸残基。
E3泛素连接酶快速识别I-κB的磷酸化丝氨酸残基并使I-κB发⽣多聚泛素化，进⽽导致I-κB被泛素依赖性蛋⽩酶体降解。
I-κB 的降解使NF-κB解除束缚并暴露NLS，然后NF-κB转位进⼊核内激活靶基因的转录。
在多种免疫系统细胞中，受NF-κB激活转录的基因有150多种，包括编码细胞因⼦和趋化因⼦的基因，在炎症反应中NF-κB能促进嗜中性粒细胞受体蛋⽩的表达以利细胞迁移，以及在应对细菌感染时刺激可诱导的⼀氧化氮合酶（iNOS）的表达。
NF-κB信号通路除了在免疫和炎症反应的作⽤之外，在哺乳动物的发育中也起关键作⽤，NF-κB对发育中肝细胞的存活也是必须的。
实验表明，如果⼩⿏胚胎不能表达I-κB激酶的⼀种亚基，那么在妊娠中期即发⽣夭折，原因是发育中的肝细胞过度衰竭。
NF-κB信号的终⽌是负向调节的关键，其中活化的NF-κB除激活靶基因转录外，还能激活I-κB基因的表达，新和成的I-κB与核中的NF-κB结合，然后NF-κB/I-κB复合物返回到细胞质，抑制NF-κB的活性。
氧化应激指标nfkb-概述说明以及解释
氧化应激指标nfkb-概述说明以及解释1.引言1.1 概述NF-κB是一种重要的转录因子，对于细胞内的信号传导和基因表达起着至关重要的调控作用。
氧化应激是一种生物学过程，指的是细胞内氧化物质产生过多，导致细胞内环境失衡，产生一系列不利影响的情况。
NF-κB与氧化应激之间存在着密切的关系，氧化应激可以激活NF-κB信号通路，进而调控多种基因的表达。
因此，NF-κB在氧化应激过程中扮演着重要的角色。
本文将从NF-κB的基本概念、氧化应激与NF-κB的关系以及NF-κB 作为氧化应激指标的意义进行深入探讨，以期能够更好地理解NF-κB在氧化应激过程中的作用机制。
1.2 文章结构本文主要包括引言、正文和结论三部分。
- 引言部分介绍了本文研究的背景和意义，以及整个文章的框架和目的。
- 正文部分分为三个小节，分别介绍了NF-κB的基本概念、氧化应激与NF-κB的关系以及NF-κB作为氧化应激指标的意义。
- 结论部分对整篇文章进行了总结，展望了未来可能的研究方向，并提出了一些结论性的观点。
通过这样的结构，读者可以清晰地了解文章的内容和逻辑，从而更好地理解作者对氧化应激指标NF-κB的研究。
1.3 目的本文的目的是探讨氧化应激对NF-κB的影响以及NF-κB在氧化应激中的作用，进一步阐明NF-κB在细胞内的重要作用机制。
同时，通过研究NF-κB作为氧化应激指标的意义，希望可以为相关疾病的预防和治疗提供理论依据，为保障人体健康提供新思路和方法。
通过本文的阐述，读者可以更加深入地了解NF-κB在氧化应激中的重要性，从而为深入研究氧化应激机制提供参考。
2.正文2.1 NF-κB的基本概念NF-κB是一种重要的转录因子，它在细胞内起着关键的调控作用。
NF-κB的全称为核因子κB，是一种能够调控基因表达的蛋白质。
NF-κB通常以蛋白质复合物形式存在于细胞的胞质中，当受到特定信号刺激后，NF-κB会被激活并进入细胞核，与DNA结合，启动特定基因的转录。
nfkb信号通路基因
nfkb信号通路基因NFKB信号通路基因NFKB（核因子κB）信号通路是一种重要的细胞信号传导通路，参与调控免疫、炎症、细胞增殖和凋亡等生物学过程。
NFKB信号通路基因是该通路的核心组成部分，起着关键的调控作用。
NFKB信号通路基因是指参与NFKB信号通路的基因，包括NFKB家族的基因、信号传导分子和调控因子等。
这些基因在NFKB信号通路中通过相互作用和调控，参与信号转导的传递和调节。
NFKB信号通路基因的表达异常与多种疾病的发生和发展密切相关，如肿瘤、炎症性疾病和自身免疫性疾病等。
NFKB家族是NFKB信号通路的核心成员，包括NFKB1（p50）、NFKB2（p52）、REL（c-Rel）、REL A（p65）和REL B。
这些家族成员通过形成二聚体或三聚体结合到DNA上，调控下游基因的转录。
NFKB家族在免疫和炎症反应中发挥重要的调节作用，参与T细胞发育、B 细胞激活、细胞因子产生和炎症反应等过程。
除了NFKB家族，NFKB信号通路还包括一系列的信号传导分子和调控因子。
其中，IKK复合物（IKKα、IKKβ和IKKγ）是NFKB信号通路的重要调控因子，通过磷酸化NFKB的抑制因子IκB，使其受到降解，从而释放出NFKB分子。
释放的活化NFKB分子可进入细胞核，结合到特定的DNA序列上，启动下游基因的转录。
NFKB信号通路中还存在一些负调控因子，如IκBα、IκBβ和IκBε等。
这些负调控因子通过结合NFKB家族成员，抑制其活性，从而限制NFKB信号的传导。
这些负调控因子的异常表达和功能缺陷与多种疾病的发生和发展密切相关。
NFKB信号通路基因在免疫和炎症反应中起着重要的调控作用。
当机体受到外界刺激时，NFKB信号通路基因的表达会发生变化，进而导致信号通路的激活或抑制。
这种变化可以调节炎症因子的产生和细胞因子的释放，从而影响机体的免疫和炎症反应。
近年来的研究表明，NFKB信号通路基因在肿瘤的发生和发展中也起着重要的调控作用。
NF-kB 炎症相关肿瘤的启动因子
NF-kB 是炎症相关肿瘤的启动因子NF-kB 是炎症相关肿瘤的启动因子，目前关于致癌物质的研究比较多，但关于慢性炎症所致肿瘤形成的分子机理尚不十分清楚。
PIKARSKY应用the Mdr2-knockout mouse（自发性胆汁郁积致肝癌模型），发现肝内皮细胞和炎细胞通过上调肿瘤坏死因子引发NF-kB，NF-kB与肿瘤形成密切相关，提示NF-kB 是在慢性炎症相关肿瘤形成过程中不可缺少的因子，可能为慢性炎症所致肿瘤的预防提供可能的靶点。
我们还不清楚人类癌症的起因，但是，可以估计到，致癌物质的检测和慢性炎症是肿瘤发展的两个潜在条件，慢性炎症能够解释约20%的人类癌症1。
因此，致癌物质的检测和癌症之间的因果关系已被广泛研究2。
关于慢性炎症所致肿瘤发生的分子细胞机理仍不十分清楚。
我们知道，在肿瘤中检常能测到核因子kB (NF-kB)（一种炎症反应的标志因子）的活性4,5，它可能是一种炎症和肿瘤的过度环节。
为了验证这一假设，我们研究了敲除Mdr2基因的小鼠品系，能够通过肝细胞癌自发发生胆小管性肝炎6，它是一种炎症与癌症相关的典型例子7。
我们观察了敲除Mdr2基因小鼠的肝炎和癌演进，结果显示，在邻近的内皮和炎症细胞中，随着肿瘤坏死因子的上升，炎症过程能够触发肝细胞中的NF-kB因子。
在七个月鼠龄的小鼠中，通过使用一种特殊肝细胞可诱导的超级转基因抑制物IkB，来阻断NF-kB，这种抑制物对肝炎和早期肝细胞转化都无影响。
作为对照，通过抗肿瘤坏死因子的治疗或在肿瘤发展的后期阶段，使用具有IkB的超级抑制物进行诱导，来抑制NF - kB的作用，导致转化的肝细胞发生细胞凋亡，破坏肝细胞癌的进展。
因此，我们的研究表明，NF –kB能促进炎症相关的癌症，因此，是一种为慢性炎症所致癌症的预防提供潜在靶点。
肝癌是引起全世界癌症死亡率的第三大原因，通常是在慢性炎症的基础上发生8。
根据在敲除Mdr2基因小鼠中的肿瘤发展，我们已经证实了前期已开展实验的结果6，9，这和人类的肝癌非常相似，包括以下几个不同时期：炎症，异型增生，不典型增生结节（腺瘤样），癌转移（附图1a，b）。
nfkb转录因子结合位点
nfkb转录因子结合位点1.引言1.1 概述概述：NFKB（核因子κB）转录因子是一个广泛存在于许多细胞类型中的关键调控因子。
它在各种生物过程中起着重要的作用，包括免疫应答、炎症反应、细胞增殖和细胞凋亡等。
NFKB转录因子通过结合位点，调控多个靶基因的转录和表达，从而影响细胞的生理和病理过程。
NFKB转录因子的结合位点是DNA序列上的特定区域，其中含有NFKB结合位点序列（NFKB binding site），这些序列通常是GGGRNNYYCC（R为嘌呤，Y为嘧啶，G表示鸟嘌呤或胸腺嘧啶）的保守模式。
NFKB转录因子通过与这些结合位点相互作用，形成复合物，进而调控下游基因的转录。
在细胞内，NFKB转录因子通过NF-κB信号通路的活化而被激活。
此时，NFKB转录因子分子将从细胞质中转位到细胞核中，与特定的DNA 序列结合位点相结合。
这一过程的高效性和特异性是由NFKB转录因子结合位点的特殊序列和NF-κB信号通路的复杂调节机制共同决定的。
通过研究NFKB转录因子结合位点的分布、序列特征和调控机制，我们可以更深入地理解NFKB转录因子的功能和调控网络。
这对于解析疾病发生发展的分子机制、寻找新的治疗靶点以及开发药物具有重要意义。
本文将首先概述NFKB转录因子的基本特征和功能，然后重点介绍NFKB转录因子结合位点的研究进展和相关研究方法。
最后，总结NFKB转录因子结合位点的研究意义，以及进一步研究的前景和建议。
通过全面系统地探讨NFKB转录因子结合位点的特征和调控机制，我们将为深入了解细胞的基因调控网络以及开发相关疾病治疗策略提供有益的参考。
文章结构部分的内容应该介绍整篇文章的结构和组织，让读者对文章的整体框架有一个清晰的了解。
可以按照以下方式来编写1.2文章结构部分的内容：1.2 文章结构本文按照以下结构组织内容：引言：在引言部分，我们将对NFKB转录因子的概念和研究背景进行概述，介绍相关的研究成果和现有的问题。
nfkb医学术语
nfkb医学术语NFKB医学术语解析引言：NFKB（核因子κB）是一种转录因子家族，它在许多生物过程中起着重要的调控作用。
NFKB通过调控多个靶基因的转录来参与免疫反应、炎症反应、细胞凋亡、细胞增殖和肿瘤发生等生物学过程。
本文将对NFKB的结构、功能以及与疾病的关系进行详细解析。
一、NFKB的结构NFKB是一种由蛋白质组成的转录因子，它由五个亚单位组成：p50，p52，p65（RelA），RelB和c-Rel。
这些亚单位可以形成不同的复合物，其中最常见的是p50/p65和p52/RelB复合物。
这些复合物通常以非活化状态存在于细胞质中，并与IκB蛋白结合。
当细胞受到刺激，IκB蛋白被磷酸化并降解，使NFKB复合物得以释放并转位到细胞核中。
二、NFKB的功能NFKB在细胞凋亡、细胞增殖、炎症反应和免疫反应等生物过程中发挥重要的调控作用。
在炎症反应中，NFKB通过调控炎症介质的产生和细胞黏附分子的表达，参与炎症细胞的活化和炎症反应的调控。
在免疫反应中，NFKB可以调节T细胞和B细胞的活化、增殖和分化。
此外，NFKB还参与了细胞凋亡的调控，可以通过调控凋亡相关基因的表达来影响细胞的生存和死亡。
三、NFKB与疾病的关系NFKB在多种疾病的发生和发展中起着重要的作用。
在炎症性疾病中，NFKB的活化可以导致炎症介质的过度产生，进而引发炎症反应。
例如，风湿性关节炎和炎症性肠病等疾病中，NFKB的活化被认为是疾病发生和进展的关键因素。
此外，NFKB还参与了肿瘤的发生和发展。
在某些肿瘤细胞中，NFKB被过度激活并调节多个与肿瘤相关的基因的表达，从而促进肿瘤细胞的增殖和转移。
四、NFKB的调控机制NFKB的活化受到多种因素的调控，包括炎症因子、氧化应激、病毒感染和DNA损伤等。
炎症因子如肿瘤坏死因子（TNF）和白细胞介素（IL）可以激活细胞内的NFKB信号通路，从而促进NFKB 的活化。
氧化应激可以通过氧化反应激活NFKB信号通路，病毒感染和DNA损伤也可以激活NFKB信号通路。
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NF-kB 是炎症相关肿瘤的启动因子NF-kB 是炎症相关肿瘤的启动因子,目前关于致癌物质的研究比较多,但关于慢性炎症所致肿瘤形成的分子机理尚不十分清楚。
PIKARSKY 应用 the Mdr2-knockout mouse (自发性胆汁郁积致肝癌模型 ,发现肝内皮细胞和炎细胞通过上调肿瘤坏死因子引发 NF-kB , NF-kB是在慢性炎症相关肿瘤形成过程中不可缺少的因子, 可能为慢性炎症所致肿瘤的预防提供可能的靶点。
我们还不清楚人类癌症的起因, 但是, 可以估计到, 致癌物质的检测和慢性炎症是肿瘤发展的两个潜在条件, 慢性炎症能够解释约 20%的人类癌症 1。
因此, 致癌物质的检测和癌症之间的因果关系已被广泛研究 2。
关于慢性炎症所致肿瘤发生的分子细胞机理仍不十分清楚。
我们知道,在肿瘤中检常能测到核因子度环节。
为了验证这一假设,我们研究了敲除 Mdr2基因的小鼠品系,能够通过肝细胞癌自发发生胆小管性肝炎 6,它是一种炎症与癌症相关的典型例子 7。
我们观察了敲除 Mdr2基因小鼠的肝炎和癌演进,结果显示,在邻近的内皮和炎症细胞中,随着肿瘤坏死因子的上升,炎症过程能够触发肝细胞中的因子。
在七个月鼠龄的小鼠中,通过使用一种特殊肝细胞可诱导的超级转基因抑制物 IkB , 来阻断 NF-kB , 这种抑制物对肝炎和早期肝细胞转化都无影响。
作为对照, 通过抗肿瘤坏死因子的治疗或在肿瘤发展的后期阶段, 使用具有 IkB 的超级抑制物进行诱导,来抑制 NF - kB的作用,导致转化的肝细胞发生细胞凋亡,破坏肝细胞癌的进展。
因此,我们的研究表明, 能促进炎症相关的癌症, 因此,是一种为慢性炎症所致癌症的预防提供潜在靶点。
肝癌是引起全世界癌症死亡率的第三大原因, 通常是在慢性炎症的基础上发生8。
根据在敲除 Mdr2基因小鼠中的肿瘤发展,我们已经证实了前期已开展实验的结果 6, 9,这和人类的肝癌非常相似,包括以下几个不同时期:炎症,异型增生,不典型增生结节(腺瘤样,癌转移(附图 , 。
在敲除基因小鼠中,肝炎是疾病的最早迹象,其特点是广泛的导管和汇管混合炎性浸润, 在阳性细胞中最丰富(附图。
NF-kB 的活性常在人类肝癌中被检测到, 尤其是在肝炎中 8。
根据 RelA (p65免疫染色, NF-kB 的活性可能与敲除了 Mdr2的肝癌形成有关 (Fig. 1a。
细胞核染色表明, NF-kB 的活性在基因敲除小鼠的所有年龄中都很明显。
但在正常、年龄匹配的小鼠,这促使研究 NF- kB活性在基因敲除小鼠的来源。
在一些肿瘤, 如霍奇金病和某些淋巴瘤, NF - kB的活化具有一种内在的,肿瘤自发的特点, 可能与它的信号通路中的突变有关 10。
如果类似机制发生在 Mdr2敲除的肝癌, 在所有肿瘤的肝细胞中,人们会观察核 NF- kB发生活化。
然而,这并非如此 ; NF - kB的活化在实质中是分散的,主要是靠近有炎症的肝门(图 1e 中,左图,这意味着一个炎症引起的现象。
为了评估这种可能性, 我们给基因敲除和野生型小鼠饲喂非甾体抗炎药(NSAID 布洛芬 10天。
通过组织学分析(图 1b ,这种治疗方法能明显导致炎症减少,显着降低血清谷丙转氨酶(ALT ,一种肝细胞损伤标志物(图 1C 及中性粒细胞减少(图 1C ,D 。
p65的免疫染色结果表明,在类固醇消炎药治疗组的肝细胞 NF - kB的活化程度明显低于对照组。
与此相反,在腹腔内的肿瘤坏死因子作用下,布洛芬并没有对肝细胞 NF – kB活性产生影响 (数据未显示。
因此,在基因敲除肝细胞中,似乎由炎症细胞引起的在肝炎中, TNFa 是一种类似 NF-kB 活性的介质,特别是它对细胞膜形成的作用,在基因敲除的肝脏中,属于正调节 (Fig. 2a。
为了研究这一可能性,我们用具有中和作用的抗 -TNFa 抗体处理基因敲除的小鼠三天,然后进行分析肝细胞中 NF-kB 的活性。
抗肿瘤坏死因子的治疗能消除肝细胞 p65的核染色 (图 2b , 进一步确定了 NF - kB的活化主要由 TNFa诱导的预测。
要确定肝炎中肿瘤坏死因子的来源,我们把肝细胞分为野生型和基因敲除型(80%苏木纯度和 -曙红(H &E 染色及其他细胞(2%肝细胞。
通过实时定量 PCR 分析 TNFa 表达的两种成分,已经确定 TNFa 的主要来源于无肝细胞部分,基因敲除型小鼠比野生型小鼠的细胞和 NF-kB 活性间的关系,肝切片分别。
TNFa 表达主要在肝门静脉处被检测到, 包括内皮和炎症细胞 (Fig. 2d。
由 p65 染色的肝细胞核主要位于 TNFa 阳性的肝门静脉处 (Fig. 2f,这表明肝细胞 NF-kB 主要经 TNFa 旁分泌的刺激引起活化。
为了验证 TNFa 的产生者并能区分他们哪些是来自结合 TNFa 的细胞,野生型的肝切片和用布洛芬处理过的基因敲除小鼠肝切片分别通过 mRNA 的原位杂交进行分析。
和免疫染色的数据非常相似,在基因敲除小鼠的内皮和炎症细胞中,我们发现TNFa mRNA 呈过高表达状态,野生型和用布洛芬处理过的基因敲除小鼠则很少表达。
在基因敲除小鼠和野生型小鼠的肝细胞中,几乎检测不到 TNFa 的表达 (Fig. 2e. 在基因敲除的肝细胞中,我们经常能检测到的活性,这表明炎症相。
为了能直接评估 NF-kB 在肝癌形成中的作用,我们用携带了两个转录基因的 D N-I k Bhep 小鼠繁殖了 Mdr2基因敲除的小鼠:一个是由调节四环素的启动子控制的非降解 D N-I k B ,另一个是由特异性肝细胞 C/EBPb启动子 (TALAP111控制的四环素反转录因子。
调节四环素的启动子也指导荧光素酶的表达,所以,可以用具有活性的小鼠荧光素酶11来检测转基因表达水平和组织特异性。
根据具有 Mdr2基因敲除的双转基因的DN - IkBhep 小鼠与 Mdr2敲除小鼠产生 Mdr22 / 2的 DN - IkBhep(双突变小鼠服从NF - kB的调节。
将来自具有抗荧光素酶抗体的相同的动物的肝脏进行免疫组织化学染色,结果表明,只有肝细胞表达转基因,而不是胆管上皮细胞, (Supplementary Fig. 2a。
因处理的小鼠中, p65 免疫染色检测到许多阳性的肝细胞核 , 但在未经处理的双突变小鼠中则没有检测到 (Supplementary Fig. 2b, c。
在基因敲除小鼠和双突变小鼠 (不分多 Dox (多西环素 (结果未显示染色呈阳性的胆道细胞和 Kupffer cells 都能被检测到,证明转基因在抑制活性方面具有特异性和有效性。
因为,在敲除 Mdr2小鼠中,肝炎起始于胆道系统 6,它不应该受到特异性肝细胞 D N-I k Bhep 的影响。
然而,在评估 NF-kB 在肿瘤形成中的作用之前 , 我们想要排除在炎症形成过程中任何可能抑制 NF-kB 的可能性因素。
与那些年龄匹配的野生型小鼠相比, 基因敲除小鼠和双突变小鼠都有较高的 ALT 水平 (Fig. 3b 。
将各组所有年龄的小鼠肝脏进行组织学分析,结果显示,和非化脓性胆管炎类似, 肝门静脉扩张是由于胆管增生, 一种混合性的肝门静脉炎性浸润和轻度至中度纤维化 (Fig. 3a。
在肝门束和肝实质。
这两个品系具有大量的阳性 CD3和阳性髓过氧化物酶(MPO 细胞。
因此, 好像Mdr2敲除小鼠的基本炎症过程主要维持在双突变小鼠,与肝细胞的 NF - kB活性无关。
Mdr2敲除肝细胞和野生型的区分主要依据几个异常功能:高增殖率,高染色体倍数和异常增生。
而第一点也是肝损伤和部分肝切除的特点 12,异型增生是恶化前的条件 13。
肝细胞增殖由溴脱氧尿苷 (BrdU 标记和 Ki - 67抗原染色进行测定。
与野生型小鼠相比, 这两种标记在基因敲除和双突变小鼠中明显增强(图 3b 。
与以往研究的相同点 14, 15, NF - kB的缺乏不会导致肝细胞增殖:在任何年龄的基因敲除和双突变小鼠中,无论 BrdU 标记还是 Ki - 67染色都没有明显的差别。
肝细胞异常增生有两大特点,组织破坏和细胞学异型性。
组织学分析显示, 在基因敲除和双突变小鼠中, 红细胞大小不均是一个显著特点, 在所有动物品系中, 4个月时,异常增生非常明显, 7个月后,异常增生会明显增加。
在基因敲除和双突变小鼠任何年龄组之间, 我们还不能检测到异常增生的宽度或深度 (Fig. 3c 。
以年龄相匹配的野生型小鼠作为对照,我们尝试量化分析肝细胞癌前变化, 并分析两个品系的肝细胞染色体倍数。
从肝脏中分离的细胞核用碘化丙叮进行染色,用荧光活化细胞分选系统 (FACS检测。
两组都有高程度的染色体倍数,我们注意到,在 4或 7个月的基因敲除和双突变小鼠中,细胞周期增殖之间没有显着性差异(图 3b 。
发现基因敲除和双突变小鼠显示差不多的增殖程度,高倍染色体和异常增生暗示 NF-kB 在肿瘤形成的早期不是必须的。
然而, NF - kB的抑制物对肿瘤早期阶段并没有影响,大龄小鼠的磁共振成像(MRI和组织学分析能清晰地辨认出基因敲除小鼠、经 Dox 处理的小鼠和未经处理的双突变小鼠((NF-kB缺乏。
在 10个月, 60%和 78%的基因敲除小鼠和经 Dox 处理的小鼠分别有肝癌, 而只有 10%未经处理的双突变小鼠发生肝癌 (P < 0.01, Fig. 4。
因此,消除肝细胞中 NF-kB 的活性能减少肿瘤的发生。
当比较这两个小鼠组的每只小鼠的肿瘤数量的平均值时,在 NF - kB缺乏动物中的类似的肿瘤抑制作用引起了人们的注意(数据未所示。
7个月, 在基因敲除和双突变小鼠的肿瘤发生早期仍没有观察到差别:两组都没有探测到肿瘤,仅有一些发育不良的实质。
因此,在第 7个月,我们去除转基因, 恢复肝细胞中 NF-kB 的活性。
使用 MRI 检测肿瘤发展,进行 3个月。
令人惊讶的是,在这三个月期间,饲喂 Dox (NF-kB proficient的 9只小鼠,有 7只能够用 MRI 探测到肿瘤。
在适当的鼠龄,来自基因敲除的这些肿瘤都不能区分大小 (Fig. 4b及组织学外观(数据未显示。
因此,似乎 NF – kB在癌前病变的早期阶段可有可无(即肿瘤开始,但这对肿瘤的后期发展有必要。
11和基 NF-kB 的抗细胞凋亡的作用能促进 IkB 超级抑制物的抑制肿瘤效应。
为了研究这一可能性,我们对有活性的半胱天冬酶 -3使用免疫染色来评估细胞凋亡。
在第 7个月,与野生型肝脏相比,基因敲除的肝脏(其中有大部分肝细胞是发育不良的 ; Fig. 3c显示更多的细胞凋亡, 可能是由于炎症的毒性效应 (Fig. 5a。
然而, 阻断肝细胞中的 NF – kB, 结果能诱导三倍多的肝细胞凋亡。