染色体文库的构建及筛选
1、自身引导合成法（经典方法）：首先热或碱处理将cDNA-mRNA杂合分子变 性和RNA降解。然后以3'发夹结构为引物，在DNA聚合酶的作用下合成第二链。 最后用单链特异的S1核酸酶消化双链cDNA中对应于mRNA5&
粘粒(菌落) 酵母人工染色体 (构建高等真核生物基因的提取
采取高丰度mRNA（特定mRNA达细胞总mRNA的半数以上） 对mRNA进行富集或分级分离（方法繁琐) 现多采用cDNA进行富集（琼脂糖凝胶电泳）
载体一般为质粒或视觉提载体
cDNA克隆片段的获得
第一链
第二链
末端处 理
cDNA第一链的合成
以mRNA为模板，反转录酶催化，人工合成的poly T引物80 library）：是用分子克隆的方法将某种生物 或其组织细胞的所有DNA片段插入适当载体，转化适当宿主菌后进行段是基因组DNA，后者的插入片段是以mRNA为模板 合成的互补cDNA。
2、置换合成法（现在采用）：在焦磷酸钠存在下合成cDNA第一链，用RNA酶H 处理杂合分子，使mRNA产生一系列缺口，成为一系列引物，再在大肠杆菌DNA 聚合酶 I的作用下合成第二链。该方法高效、无需纯化杂合分子、不需处理 发夹结构避免cDNA损失
3、PCR合成法（新策略）：在cDNA第一链的3'端加一段oligo C尾为引物，通 过PCR扩增获得多拷贝双链cDNA。这种方法不会丢失末端的少数核苷酸。
组子才能被装入噬菌体的外壳内，形成有感染能力的 颗粒。 然后，经过转导将外源DNA克隆化，达到建库目的。
C、酵母人工染色体载体
酵母人工染色体（Yeast artificial chromosomes 简称YAC）， 是一种能够克隆长达400Kb的DNA片段的载体，含有酵母细胞中必 需的端粒、着丝点和复制起始序列。酵母菌的复制原点，端粒， 着丝粒序列都已清楚，可用于完整真核基因的克隆。
重组DNA的产生
在正式连接反应之前，应通过理论实验确定载体、目的基因的最 佳用量比。
尽量使用新购-—转录形成的cDNA与适当的载体连接后转 化受体菌。这种包括特定组织细胞所有mRNA信息的cDNA插入的酶切位点。 替代型载体，具有两个酶切位点，两个位点之间的
DNA片段可以被外源DNA取代。 替代型载体应用最广泛 如 λEMBL1-4是一类取代型载体系列
B．粘粒
质粒＋噬菌体
粘粒作为载体的特点是： 一般质粒的特性外还能装载大片段的外源DNA， 有可以识别噬菌体包装的“cos”位点。 包装时，只有能够达到所需片段的分子量标准的重
双链cDNA末端的处理
1、同聚物加尾法：利用小牛胸腺末端转移酶将dNTP添加到单链或双链DNA3' 羟基端的能力，将互补的同聚物分别加到载体与cDNA上，使二者相连。 2、接头法：将限制性核酸内切酶识别位点的接头（ｌｉｎｋｅｒ ln(1―f)
载体DNA的制备
1、载体DNA的酶切 限制性核酸内切酶部分消化 酶切是否完全 碱性磷酸酶去磷酸化处理后将其灭活
2、载体DNA的纯化 对粘粒载体：酚：氯仿混合物抽提或酒精沉淀法 对噬菌体载体：蔗糖密度梯度离心等。
基因组DNA克隆片段的制备
一、基因组DNA的提取 1、提取的DNA分子越长，酶切后产生的有效末端的片段数越多链接反应效率越高。 2、经典方法：在EDTA和SDS存在条件下，用蛋白酶K消化细胞刘姐物，然后用酚：氯 仿混合物抽提法除杂蛋白，再用透析法除低分子量杂质。 二、DNA克隆片段的制备 1、关键：将DNA切割成大小适中的随机片段。 常用方法：机械剪切法，限制性核酸内切酶消化法。（后者更常用、高效） 2、采取部分消化，通过控制限制性核酸内切酶的用量以及消化时间。 3、消化后分离只取长度适宜的片段。（蔗糖密度梯度离心法，琼脂糖凝胶电泳） 4、最好消化成35-45kb的片段，并用碱性磷酸酶处理。
f为某一特定cDNA（mRNA）的分子数目与全部cDNA 大致相同，但个别或部分基因表达有差异 的不同组织提取mRNA，反转录合成cDNA后，在一定条件下用过量 的不含目的基因的一方作为驱动方（driver），与含有目的基因 的实验方（tester）进行杂交选择性去除两部分共同基因杂交产 生的复合物，多次重复杂交去除，将含有目的基因的一、核酸杂交法
1、用于核酸杂交的探针 （1）、同源探针：至少含有一部分与目的片段。部分同源探针： 用于探测与其序列相关但不同的克隆，其来源包括不同种属之间的相同基因 或同属某一基因家族的不同基因。 （2）、RNA探针：来源是对克隆在载体中的核酸片段进行体外转录获得。 （3）、寡核苷酸探针：通过明确的序列人工合成 2、菌落和空斑的原位杂交
鸭细菌人工染色体文库的构建及连锁群的FISH定位的开题报告
鸭细菌人工染色体文库的构建及连锁群的FISH定位的开题报告一、研究背景人工染色体（artificial chromosome，AC）是指在体外合成的、能够与真核细胞染色体相媲美的一个或多个染色体。
AC具有许多优点，如能够容纳大的外源DNA片段、稳定遗传和高效表达等。
由于AC的这些优点，目前在人类、动物和植物等领域均有广泛的应用。
鸭细菌是一种重要的饲料添加剂，在家禽和畜牧业中广泛使用。
但是鸭细菌对抗生素具有抗性，因此对鸭细菌的研究对于制定合适的饲养管理计划具有非常重要的意义。
二、研究目的本研究的主要目的是构建鸭细菌人工染色体文库，并利用FISH技术对连锁群进行定位，以期实现对鸭细菌的更深入研究。
三、研究内容和方法1.构建鸭细菌人工染色体文库本研究采用现代分子生物学技术，包括基因组DNA的提取、文库的构建、高通量测序和数据分析等步骤。
首先，利用列式法对鸭细菌进行基因组DNA提取，并使用限制酶将DNA片段进行切割。
然后，将DNA 片段连入人工染色体载体中，得到一个鸭细菌人工染色体文库。
最后，进行高通量测序和数据分析，鉴定所得序列。
2.连锁群的FISH定位首先，根据测序获得的序列信息设计合适的探针，并进行标记。
然后，准备与其亲缘关系较近的鸭细菌菌株作为目标，将探针引入目标细胞内，进行FISH技术的检测，定位目标序列及连锁群。
四、研究意义和预期结果本研究利用人工染色体技术构建了鸭细菌文库，并利用FISH技术对连锁群进行定位，实现对鸭细菌的深入研究。
预期结果包括：获得鸭细菌人工染色体文库，识别出鸭细菌基因组中的重要序列，为后续的生物学功能研究提供基础，并掌握FISH技术，为针对鸭细菌及其它细菌的基因定位研究提供基础设施。
基因文库的构建
为了最大限度保证度的断裂。制备的
DNA分子规方法制备的染色体 DNA的长度一般在100 kb左右 如果先将细胞固定在低融点凝 构建流程
随机引物引导的 cDNA 合成是采用 6－10 个随机 碱基的寡核苷酸短片段来锚定 mRNA 并作为反转录的 起点。 由于随机引物可能在一条 mRNA 链上有多个结合 位点而从多个位点同时发生反转录，比较容易合成特 长的 mRNA 分子的 5‘端序列。 随机引物 cDNA 合成的方法不适合构建 cDNA 文 库，一般用于克隆特定 mRNA 的 5' 末端，如 RTPCR 和物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA
种类不同（即基因
① 细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离； ② 第一链 cDNA 合成； ③ 第二链 cDNA 合成； ④ 双链 cDNA 克隆
Total RNA的提取 mRNA的分离 cDNA双链的合成 载体的制备 cDNA双链和载体的连接 转化或转染 快速鉴定 pBlueScript cDNA库扩增
5’
AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ T4-DNA ligase AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’
5’ 3’
cDNA第二链的合成
引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的5’端序列
G 5‘ppp’5 G
AAAAAOH 3’ TTTTTp 5’ TdT dCTP AAAAACCCCCCCOH 3’ TTTTTp 5’ NaOH TTTTTp 5’
A A A A
白酶K、RNaseA的缓冲液中浸泡，可获得 >100 kb大小的DNA片段基因的构建程序③基因组DNA的切割
鹌鹑Z染色体特异文库的构建及其同源性检测
口 ｅ ｒ ｔ 粒 中 ， 建 了 鹌鹁 Ｚ染 色体 的 特异 Ｄ Ａ文 库 。 以该 文 库 中 分离 的 插 ＾ Ｄ Ａ作 为 探 针 ． 鹌 鹑 染 色 体 瑚ｕｓ ｉ 质 ｃｐ 构 Ｎ Ｎ 对
进行 了描绘 。结果在 鹌鹑的分裂相 中， ｚ染色体 被强烈 的特异荧 光信号完全覆盖 ， 而特异 的， 以用 来制备性染色 体的描绘探针 ， Ｎ 可 在其 他相关物种
Ａｂ ｔａ ｔ ｓ ｒ ｃ ：Ａ ｉ ｌ ｔｏ ｉ ｓｄ ｔ ｄ ｐ ｔｎ ａｄ ｆｇ ｔｍｉｒｓ ｏ ｅｆ ｒｔ ｅｃ ｌ ｃｉ ｎｏ ｕ ｉ Ｚ ｃ ｒ ｍｏ ｓｍｐｅ ｍｅ ｈ ｄ ｗｌ ｕ ｅ ｏａ ａ ｔａ ｓ ｄ ｒ ｈ ｃｏ ｃ ｐ ｏ ｈ ｏｌ ｔ ｆｑ ａｌ ｈ ｏ － ｔ ８ ａ ｉ ｅ ｏ
４ ０７ ； 湖北 太 学生 科 学 学 院 ， 汉 ３０２ ２ 武 ４ ０６ ） ３０２ （ 武 汉 大 学 生 命 科 学 学院 ， 汉 １ 武
摘要 ： 运用染 色体显微分离技术 ， 鹌鹑有 丝分裂相 中分 离 了 ｚ染 色体 ， Ｄ ＰＰ Ｒ扩增 后 ． 从 经 Ｏ －Ｃ 将扩增 产物 克睦到
维普资讯
遗 传 学 报 ，９ ３ ：２ ～２９ ２０ ２ （ ）２６ ２ ０ ２
Ａｅａ Ｇ 删 ４ Ｓ ｒ ｃ ｔ ｉ ａ ｄ
鹌 鹑 Ｚ染 色体 特异 Ｄ Ａ 文 库 的构 建 Ｎ 及 其 同源 性 检 测
DNA文库的构建和目的基因的筛选
第八章 DNA文库的构建和目的基因的筛选第一节 概述基因工程主要是通过人工的方法分离、改造、扩增并表达生物的特定基因，从而深入开展核酸遗传研究或者获取有价值的基因产物。
通常将那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段，称为目的基因。
因目的基因片段需插入载体，导入宿主细胞内复制，所以对宿主细胞DNA而言，又称它为外源性基因。
目的基因主要是编码蛋白质(酶)的结构基因，诸如抗逆性相关基因、生物药和保健品相关基因、毒物降解相关基因以及工业用酶相关基因等。
随着生物长期的进化，生物界积累了大量对人类有用的基因。
它是大自然恩赐于人类的宝贵资源，等待人们去开发利用。
目的基因用途很广，主要有以下几个方面：①研究该基因的全貌与内涵，如详细分析其结构、功能及调控。
②与正常基因对比，寻找异常基因的异常点，进而探索疾病发生的分子生物学机理及治疗对策。
③研究生物种系进化与相关同源性。
④应用某种基因大量表达，生产所需要的蛋白质或多肽（如胰岛素、干扰素等药物）。
⑤在农、林、牧、副、渔业中，改造某些目的基因，以改良品种，促进经济发展。
⑥建立基因疗法院，选用某种正常基因,引入患者体内，对某些先天性遗传疾病进行治疗。
根据研究对象的研究目的不同，目的基因可来自原核细胞或真核细胞。
原核生物基因组较简单，较易获得目的基因。
哺乳动物真核细胞基因组庞大复杂，可根据不同的要求选择适宜方法，从中获得目的基因。
要从数以万计的核苷酸序列中挑选出非常小的所感兴趣的目的基因，是基因工程中的第一个难题。
欲想获得某个目的基因，必须对其有所了解，然后根据目的基因的性质制定分离的方案。
目的基因的制备是基因工程研究和应用的关键内容之一。
根据实验需要，待分离的目的基因可能是一个完整的有功能的基因，除了编码区，还包含转录启动区和终止区序列，或者是一个完全的操纵子或基因簇，也可能是只具有编码序列的基因区，甚至是只含启动子或终止子等部件的DNA片段。
细菌人工染色体基因组文库的构建及应用
ｄｉ Ｏ３６ ０ｉ ｎ１０— ５６２ １．１ １ ｏ： ． ９ ．ｓ． ８ ７ １． ００ ． ２ ｌ ９ ｓ ０ ０ ０细菌人工染 色体基 因组 的构 建及应用 任 斐
（ 南科 技 学 院 ， 南 新 乡 ４ ３ ０ ） 河 河 ５ ０ ３ 摘要： 细菌人工染色体 （Ａ ） Ｂ ｃ 载体由于稳定复制 、 嵌合体少 、 分离纯化简单、 转化效率高等优点 在 构 建 基 因组
ｇ ｎ ｍ ｉ ｉ ｒ ｒ ｅ ｏ ｃ ｌｂ ａ ｙ
Ｒｅ ｅ ｎＦ ｉ
（ ｅａ Ｉｓｔｔ ｏ ｃｅｃ ａ ｄＴ ｃ ｎｌｇ， ｉｘａｇ４ ３ ０ ， ｈｎ ） Ｈ ｎ ｎ ｎｔｕｅ ｆ ｉ ｅ ｎ ｅｈ ｏ ｙＸ ｎ ｉ ５ ０ ３Ｃ ｉａ ｉ Ｓ ｎ ｏ ｎ
Ａｂ ｔ ａ ｔ ａ ｔｒ ｌ ｔ ｃａ ｈ ）ｌｓＨｅ （ ＡＣ）ｅ ｔｒ ｒ ｒａ ｌ ｓｄｉ ｅ ｏ ｃｌ ｒｒ ｃｎ ｔｕ ｔ ｎ ｂ ｃ ｕ ｅ ｓｒ ｃ ：Ｂ ｃｅｉ ｉ ｉｌ ￣ｎｏｏ ｌ Ｂ ａ Ａｒ ￣ ｃ ｖ ｃｏｓａｅｂｏ ｄｙｕ ｅ ｎｇ ｎ ｍｉ ｉ ａｙ ｏ ｓｒｃｉ ｅ ａ ｓ ｂ ＂ ｏ
关 键 词 ：Ａ Ｂ Ｃ载体 ； 因组 ； 基 图位克隆 ； 物理图谱
中图分类号 ： ３３ Ｑ４． １
文献标识 码 ： Ａ
文章 编号 ：０８７ １（ １ ）１０４—５ １０—５６２ ００—０４０ ０
Ｃｏ ｔ ｕ ｔｏ ａ ｐｐ ｉａ ｉ ｎ ｏ ａ ｔ ｒａ ｒ ｉ ｃａ ｈｒ ｍ ｏ ｏ ｅ ｎｓｒ ｃ ｉｎ ｎｄ ａ ｌｃ ｔｏ ｆｂ ｃ ｅ ｉ ｌａ ｔｆ ｉ ｌｃ ｏ ｉ ｓｍ
Ｋｅ ｒ ｙ ｗｏ ｄｓ：ＢＡＣ ｖ ｃｏ ，ｅ ｏ ｃｌ ｒｒ ， ｐ ｂ ｓｄ ｃｏ ｉｇ，ｈ ｓｃ ｌ ｐ ｅｔｒｇ ｎ ｍｉ ｉ ａｙ ｍａ — ａｅ ｌｎｎ ｐ ｙ ｉａ ｂ ｍａ
DNA文库的构建和目的基因的筛选
按照外源DNA片段的来源来分：基因组、 片段的来源来分：基因组、 按照外电泳
色 体 文 库 构 建
红色Ura+,Try+转化子菌落（四）基因组的筛选利用同源探针克隆基因
三、cDNA的构建 的构建构建cDNA应满足的条的筛选（一）构建cDNA应满足的条件 构建 应满足的条件
的代表性 重组cDNA的序列完整性 的序制备 的制备 细胞总 及mRNA的分离 的分离 cDNA第一链的合 第一链的合 成 双链cDNA链的合 链的合 双链 成 与载体的连接 噬菌体颗粒的大于研究基因的平均长度 含有相邻DNA片段的独立克隆间 片段的独立克隆间 含有相邻 克隆片段易于从载体上完整卸下最好不带任何载体序列 重组克隆应能稳定保存、扩增及筛选。 重组克隆应能稳定保存、扩增及筛选。ຫໍສະໝຸດ （二）基因组的构建过程
基因组DNA的分离制备 的分离制备 基因组 基因组DNA的片段化 基因组 的片段化 载体制备 重组连接 噬菌体离体包装 重组噬菌体感 X
B
Ori
X
ARS1
pYAC4
酵 母
TRP1 CEN4 Sup4 S E
Sm
第十一章 DNA文库的构建和目的基因的筛选.pp t
总RNA中富集mRNA是构建cDNA的一个重 要步骤。通过降低rRNA和tRNA含量，可大大 提高筛选到目的基因的可能性。
二、第一链cDNA的合成 由mRNA到cDNA的过程称为反转录，由反转录 酶催化。
常用的反转录酶有2种：AMV（来自禽成髓细
的各种信息（如表达丰度、蛋白性内切酶或机械力量切割成一定长 度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重 组并转化相应的宿主细胞体外反转录成cDNA，与适当的载体连接后 转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并 能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息 的自Moloey鼠白血 病病毒）。两者都是依赖于RNA的DNA聚合酶， 有5’→3’DNA聚合酶活性。（目前常用的反转 录酶多是通过点突变去掉RNase H活性的MoMLV）
反转录酶合成DNA时需要引物引导。常用的 引物主要有oligo（dT）引物和随机引物。 ① oligo（dT）引物一般包含15-30个脱氧胸 腺嘧啶核苷和一段带有稀有酶切位点的寡 核苷酸片段； ② 随机引物一般包含6-10个盖基因组的倍数。
1975年Clar（1-p）/ln均插入片段的 长度和： 1）采用部分酶切或随机切割的方法来打断染 色体DNA，以保的插入片段大小所得到的平 均值。
插入效率表示有插入片段的克隆在所检测的
克隆中所占的比例，也是通过电泳检测的。
基因组覆盖倍数的估算方法有2种：
①用公式计算，基因组覆盖倍数=平均插入片 段长度×克隆数/基因组DNA的长度（一般是 约数）； ②结合基因组针筛选到的阳性克隆 的总个数除以使用的总探针数。
三、第二链cDNA的合成 cDNA第二链的合成就是将上一步形成的 mRNA-cDNA杂合双链变成互补双链cDNA的过 程。 cDNA合成的方法： ①自身引导合成法； ②臵换合成法； ③引导合成法； ④引物-衔接头合成法。
基因组文库的构建和池化筛选
基因组文库的构建和池化筛选综述与专论?生物技术通报BloTECHNoLoGYBULLETIN201O年第5期基因组文库的构建和池化筛选陈献伟娜日苏朱超.王会'雷娜,高剑峰关伟军马月辉(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京100193;2石河子大学生命科学学院,石河子832003;广西大学动物科学技术学院,南宁530004;山西农业大学,太谷030801)摘要:作为物种保护策略的重要部分,建立濒危畜禽的基因组文库,可有效保存濒危畜禽种质资源.BAC(bacterialartificialchromosome)文库具有高容量,遗传特性稳定和嵌合体少等优点,因而被用于畜禽基因组文库的构建.对BAC文库的构建方法和文库池化筛选系统作一综述.关键词:BAC栽体基因组文库池化筛选ConstructionandScreeningofGenomicLibrary ChenXianweitNaRisuZhuChaofWangHuifLeiNa?GaoJianfengGuanWeijunMaYuehui ('InstituteofBeijingAnimalScienceandV eterinary,CAAS,Beijing100193;CollegeofLife Science,ShiheziUniversity,Shihezi832003; CollegeofAnimalScienceandTechnology,GuangxiUniversity,Nanning530004;ShanxiA griculturalUniversity,raigu030801)Abstract:ConstructionofthegenomicLibraryofdomesticanimalasthebasiccompone ntofs peciesconservationstrategycan preserveendangeredanimalgermplasmresourcesefficiently.Beingcapableofinsertinglarg efragments,maintainingthestabilityofin—sertedDNAinE.coli,producingfewchimerismes,BAClibraryhavebeencontributedtorese archesofconstructionofgenomiclibrary. ThispaperdescribedtheconstructionmethodandscreeningsystemofBAClibrary. Keywords:BACvectorsGenomiclibraryPoolingScreening高分子量的DNA文库是基因组研究的基础,如重要经济性状基因的图位克隆,比较基因组研究,基因组测序及物理图谱的构建.BAC载体具有容量大,遗传特性稳定和嵌合体少等优点,非常适合于基因组文库的构建.1BAC文库的研究进展基因组文库是利用DNA重组技术将某种生物细胞的核DNA的全部或大部分片段随机地连接到克隆载体上,之后转移到适当的宿主细胞中,通过细胞增殖而形成的各个片段的无性繁殖系的总集.基因组文库构建的关键取决于所使用的克隆载体.自Cohen等构建第一个质粒载体pSC101以来,相继出现了大量的克隆载体.克隆载体大致可分为噬菌体系列和人工染色体系列.前者主要包括质粒(plasmid),噬菌体(bacteriophage),柯斯质粒(cosmid,又称粘粒)等,其主要特点是载体在宿主细胞内能稳定遗传,易分离,转化效率高,但克隆容量有限,一般小于45kb.许多真核生物的基因庞大而复杂,难以克隆到这些载体中.后者主要有酵母人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC),细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome,BAC)以及可转化人工染色体(TransformationArtificialChromo—some,TAC)和哺乳动物人工染色体(mammalianarti—ficialchromosome,MAC)等,显着特点是载体的容载收稿日期:2009—12-29基金项目:国家科技支撑项目(2006BAD13BOB,2008BADB2B01),转基因重大专项(2008ZX08009-003),国家"863"计划项目(2006AA10Z1982007AA10Z170)作者简介:陈献伟,男,硕士,主要从事分子生物学研究工作;E.mail:****************通讯作者:关伟军,男,教授,博士生导师,主要从事动物细胞分子生物学方面研究工作;E—mail:********************.cn马月辉,男,研究员,博士生导师,主要从事动物遗传资源保护方面研究工作;E—mail:yuehui—**********12生物技术通报BiotechnologyBulletin2010年第5期能力大,约100—350kb.这些具有较大外源片段承受能力的人工染色体对于真核生物基因组文库的构建极为有利.近年来得到广泛应用的克隆载体主要是细菌人工染色体(BAC).细菌人工染色体是在大肠杆菌F一因子基础上发展而来的.F.因子的复制是严谨型的,在每个细胞中仅有1—2个拷贝,这样就减少了质粒所携带的外源片段发生重组的可能性,而且F.因子能携带的外源片段可达1mb,表明F一因子更适合于克隆大片段的DNA.BAC克隆体系的第一代载体pBAC108L(图1).pBAC108L能克隆的外源片段可达300kb,但它存在的一个问题是只有10%一50%的转化子是重组子.自从BAC载体问世以来,出现了许多目的在于增加易用性和用于特定系统和环境的修饰.pBeloBAC11和pBACe3.6是对pBAC108L进行修饰构建的载体,通常作为进一步修饰的基础载体(图2).pBeloBAC11代表了第二代的BAC克隆系统,也是应用非常广泛的一种BAC载体.其外源DNA片段的容量最大可至300kb以上,可应用于基因组文库的构建工作.主要特点是在pBAC108L的多克隆位点上增加了LacZ基因,可用于蓝白斑筛选.然而pBeloBAC11仍是低拷贝质粒.T7—?'_SP6SalINotIBHNotI卜口_[卜卜—)—EcoRV图1pBAC108L载体H/ndmBamHIrepE图2pBeloBACll载体Frengen等构建了pBACe3.6载体(图3).pBACe3.6是在pBAC108L的基础上构建的,但比pBeloBAC11修饰程度高.此外,它利用了不同于pBeloBAC11蓝白斑选择的另一选择机制,其多克隆位点位于蔗糖致死基因sacB上,这样重组克隆可以在含有蔗糖的培养基上进行阳性选择.OCM(R)mHIfl1lCIIf811c0RInO,SacIf2O)胁II(221PUC—LINKLI(766)LI(2012)ApaLI(2509)南R322NotI(2850)图3pBACe3.6载体1997年,Hamilton等"结合根癌农杆菌双元载体和BAC载体的特点,构建了一种"双元BAC载体(abinaryBAC)",即BIBAC.BIBAC作为第三代文库载体,不仅具有第二代载体的特征,而且有植物2010年第5期陈献伟等:基因组文库的构建和池化筛选转化的功能.BIBAC转化技术在双子叶植物中已经建立,Hamilton等'通过农杆菌介导的方法把克隆在BIBAC2中的完整的150kb大小的人类DNA片段转进了番茄和烟草.TAC(transforma.petentartificialchromosome)也是一种直接用于转化的人工载体.1999年,Liu等结合PAC载体和双元载体的特点,构建了植物可转化基因人工染色体TAC载体Pyltae7和Pyhac17.TAC载体能在大肠杆菌和根癌农杆菌中以单拷贝形式复制.目前,已有人和一些哺乳动物的基因组DNABAC文库建成,如猪",牛,大熊猫"和鲶鱼H等动物.通过BAC文库的构建,不仅长久而有效地保存动物基因遗传资源,而且,为进一步研究,开发和利用其与重要经济性状,生殖和遗传性疾病相关的功能基因,提供可靠的基因材料平台.2BAC文库的构建方法基因组DNA文库的构建流程相对简单,但其需要很多特殊的处理以及必要的仪器设备,成功的关键都体现在操作的细节上.BAC文库的构建过程包括以下几个步骤.2.1BAC载体的制备载体制备的好坏,直接关系到文库中空白载体的比例和文库的质量,载体的纯度越高,获得阳性克隆的概率越高,文库的质量也越好.采取酶切的同时进行彻底的脱磷处理,以减少或避免空白载体的比例,保证其符合建库要求.载体的制备主要包括BAC载体的大量提取和纯化,CsCL.EtBr密度梯度离心纯化得到的超螺旋质粒,BAC载体的后期处理(酶切和去磷酸化),载体脱磷效果检测,载体自连回收.2.2高分子量(HMW)DNA的制备由于构建BAC文库需要得到尽可能完整的大片段DNA,因此,首先要保证将细胞核包埋在琼脂糖凝胶块中的质量,即细胞核的质量和浓度,琼脂糖凝胶的浓度等.而且如果是组织样品,一般使用液氮将组织捣碎,并在整个研磨过程中使组织浸泡在液氮中,然后包埋在低熔点琼脂糖中形成"Plugs",以此来保护核DNA免受降解.2.3高分子量DNA的不完全消化高分子量DNA的不完全消化的目的使通过限制性内切酶的不完全消化,产生大量比较适合和集中的片段,一般通过脉冲场凝胶电泳进行两次片段选择'.DNA的分离一般有一次尺度选择和二次尺度选择(尺度选择即脉冲电泳),在脉冲场电泳条件下,由于不同分子量的DNA片段发生"共迁移",在大片段中混有很多小片段DNA,而这些小片段DNA 在连接过程中效率要明显高于大片段DNA,从而影响基因组文库的构建质量.二次尺度选择法得到的DNA连接转化效率较高,转化后插入的片段整齐度好,空载率低.为了获得纯度高,含量多的大片段,减少大片段的降解,同时又尽可能的去除小片段,采用二次尺度法进行大片段DNA的分离,按照部分酶切所确定的最佳酶用量,对基因组Plugs进行大量酶切,然后进行脉冲场电泳.2.4大片段DNA和载体的连接大片段DNA能否有效地连接到载体上,主要取决于插入片段与载体的比例,对于不同的生物采用的比例不同,大部分处于1:5—15(摩尔比)范围.2.5将连接产物转化入受体细胞对于转化大肠杆菌而言,电转化是目前使用最普遍的一种方法.研究表明,文库中载体的平均插入大小主要与转化效率相关.插入片度越大,转化效率越低;反之,越高.此外,转化条件也直接影响转化效率,插入片段大小及假阳性克隆的含量.2.6挑选阳性克隆,构建文库阳性克隆的分检有人工和使用机器手技术两种.一般通过lacZ的插入失活,显示蓝白斑的负同选择来筛选重组子,但是在基因组文库构建中常常发现有1%一10%左右的假阳性,用机器人操作时假阳性更高.现在又产生了正向选择的BAC载体pBACe3.6,pBAC/SACB¨,利用sacB的插入失活,产生的零背景可使机器人进行挑选重组子时不必进行菌落间的分辨,便于自动挑取收集.2.7文库的保存管理与质量检测文库构建完成后,还需要对文库进行评价,其质量的高低标准包括文库中克隆的数量,平均插入片l4生物技术通报BiotechnologyBulletin2010年第5期段的大小,克隆的稳定性,细胞器DNA的含量以及假阳性克隆的含量等.3BAC文库的池化和筛选基因组BAC文库有数万到数十万个克隆组成,因此建立高效的管理和筛选系统是必要的.筛选系统有PCR筛选系统和Southern杂交筛选系统两种.3.1PCR筛选系统建立PCR筛选系统需要对所有的克隆进行保存和池化.整个BAC文库由若干个超级池组成,每个超级池有10个384孔板组成.将一个超级池的行克隆,列克隆和每板的克隆分别合并成池,提取质粒DNA作为第二步PCR筛选的模板,同时将10个板的克隆合并提取DNA,即有了第一步筛选超级池的DNA.对BAC文库进行两步.3D筛选的过程:首先,用目的序列的PCR引物筛选文库的若干个超级池的DNA,得到阳性超级池号;之后用阳性超级池的板池,行池,列池的DNA进行第二步筛选,得到阳性的板池号,行池号,列池号;从冻存的文库中依照筛选结果得出的克隆地址,挑出阳性克隆,再次做PCR验证.Bonet等¨构建了野草莓的BAC文库,共有18432个克隆,存于48块384孔板中,压缩到48个96孔板中.他将每6块96孔板的克隆混在一起,共形成8个超级池.用70个分子标记进行PCR分析,以超级池质粒为模板通过PCR的方法确定含有目的片段的阳性单克隆.Wang等.构建了尖吻鲈的BAC文库,49152个克隆保存在128块384孔板中,由11个超级池构成,每个超级池分成48个96 孔板,对文库进行超级池,板池和行列池3步法筛选,用24个微卫星和15个EST对文库进行PCR筛选表明文库具有较好的基因组覆盖率.3.2HD杂交膜筛选系统一般材料BAC文库库容量都是数以万计,若同时对这些数目庞大的BAC进行分析,非常困难.常规BAC文库的研究一般都是以尼龙膜为载体,用机械手将整个文库顺序点到膜上.将膜在固体培养基上培养一段时间后进行菌落原位裂解,将DNA结合在膜上,再用特异性探针进行Southern杂交筛选阳性克隆.每张膜可容纳50000以上的克隆.一个库用6—7张膜就可以包括.杂交膜筛选缺点是Southern杂交要用到同位素,存在假阳性和污染,放射性元素对人和环境都会产生影响,成本也高.对于功能基因克隆的筛选,用PCR筛选系统得到的结果比从高密度杂交膜筛选系统得到的结果更为可靠,假阳性少,而且方法简单,快速.但是对于构建大区域的物理重叠群,高密度膜杂交筛选阳性克隆可以一次得到一个标记的所有重叠克隆,更有利于快速的构建BAC重叠群.4展望细菌人工染色体(BAC)具有容量大,易于分离和操作等特性,比其它载体系统构建的基因组文库有更高的覆盖率和稳定性.利用BAC文库容量大的特点,进行基因筛选,目的基因定位,表达调控等研究是BAC文库利用的发展方向.BAC文库将在动物基因资源保存,基因组学,后基因组学等研究中发挥重要的作用.参考文献[1]QuiniouSM,WaldbieserGC,DukeMV,eta1.Afirstgeneration BACbasedphysicalmapofthechannelcatfishgenome.JBMCGe? nomics,2007,8:40.[2]JungS,MainD,StatonM,eta1.Syntenyconservationbetweenthe PrunusgenomeandboththepresentandancestralArabidopsisge- nomes.JBMCGenomics,2006,7:81.[3]ZhebentyayevaTN,Swire-ClarkG,GeorgiLL,eta1.Aframework physicalmapforpeach,amodelRosaceaespecies.JTreeGenetics andGenomes,2008,4:745-756.[4]CookRJ,LloydRS,WagnerC.IsolationandcharacterizationofcD? NAclonesforratliver10?formyhetrahydrofolatedehydrogenase.J BiolChem,1991,266(8):4965-4973.[5]ShizuyaH,BirrenB,KimUJ,eta1.Cloningandstablemaintenanceof300一kilobase—pairfragmentsofhumanDNAinEscherichiacoliU? singanF—factor-basedvector.JProcNatlAcadSciUSA,1992,89: 8794-8797.[6]FrengenE,WeiehenhanD,ZhaoB,eta1.Amodular,positiveselec- tionbacterialartificialchromosomevectorwithmuhiplecloning sites.Genomics,1999,58(3):250-253.[7]HamihonCM.Abinary—BACsystemforplanttransformationwith hjgh—molecular—weightDNA.Gene,1997,200:107?116.[8]HamiltonCM,LewisC,eta1.Stabletransferofintacthighmolecular weightDNAintoplantchromosomes.ProcNatlAcadSciUSA,1996,93(18):9975.[9]HamiltonCM,FraryA,XuYTanksleySD,ZhangHB.Construction 201O年第5期陈献伟等:基因组文库的构建和池化筛选oftomatogenomicDNAlibrariesinbinary-BAC(BIBAC)vector PlantJ.1999,18:223-229.[1O]LiuYG,ShiranoY,FukakiH,eta1.c0mplementationofplantmu—tantwithlargegenomicDNAfragmentsbyatransformation??compe? tentartificialchromosomevectoracceleratespositionalcloning. PNAS,1999,96(11):6535-6540.[11]Rogel—GaillC,BourgeauxN,BillauhA,eta1.Constructionofa swineBAClibrary:applicationtothecharacterizationandmapping ofporcinetypeCendoviralelements.JCytogenetCellGenet, 1999,85:205-211.[12]EggenA,GautierM,BillautA,eta1.Constructionandcharacter- izationofabovineBAClibrarywithfourgenome-equivalentcover. age.JGenetSelEvol,2001,33:543—548.[13]LiuW,ZhaoYH,LiuZL,ZhangY,eta1.Constructionofa7-fold BAClibraryandcytogeneticmappingof10genesinthegiantpanda (Ailuropodamelanoleuca).JBMCGenomics,2006,7:294.[14]QuiniouSM,WaldbieserGC,DukeMV:AfirstgenerationBAC. basedphysicalmapofthechannelcatfishgenome.JBMCGenom- ics,2007,8:40.[15]KimUJ,Bi~enBW,SlepakT,eta1.Constructionandcharactefiza. tionofahumanbacterialartificialchromosomelibrary.JGenom. ics,1996,34:213-218.[16]ZhangY,ZhangX,SeheuringCF,eta1.Constructionandcharac- terizationoftwobacterialartificialchromosomelibrariesofZhikong scallop(ChlamysfarreriJonesetPreston),andidentificationof BACclonescontainingthegenesinvolvedinitsinnateimmunesys—tern.JMarBiotechnol,2008,10:358-365.[17]TaoQZandZhangHB.CloningandstablemaintenanceofDNA fragmentsover300kbinEscherichiacoliwithconventionalplas- mid—basedvectors.JNucleicAcidsRes,1998,26:4901-4909. [18]BendahmaneA.Zero-backgroundplasmidvectorforBAClibraryconstruction.JBioTeehniques,1999,26(2):228—230,232.[19]BonetJ,GironaEL,SargentDJ,eta1.Thedevelopmentandcharac—terisationofabacterialartificialchromosomelibraryforFragariavesca.JBMCResNotes,2009,2:188.[20]WangCM,LoLC,FengF,eta1.ConstructionofaBAClibraryand mappingBACclonestothelinkagemapofBarramundi,Latescal?carifer.JBMCGenomics,2008,9:139.[21]FengJ,VickBA,LeeMK,eta1.ConstructionofBACandBIBAC librariesfromsunflowerandidentificationoflinkagegroup-specific clonesbyovergohybridization.JTheorApplGenet,2006,113:23—32.病毒学精要概览(双语版)科学出版社新书(英)T.斯科恩着,朱俊萍李相辉安静译978—7—03-026886—7$50.002010年3月出版内容简介:本书是CoffeeHouseNotesonVirology一书的中英双语版本,内容涵盖了病毒学的基本原理,概念以及与病毒学密切联系的学科中各项热点议题,例如:病毒和肿瘤,病毒和免疫系统,病毒进化及新病毒等.书中丰富的病毒实例几乎囊括了医学病毒学中所有重要的类群和相关医学问题.本书语言极其精炼,简单,以解答75个问题的形式阐释了病毒学中最普遍的性质和规律,为庞杂丰富的病毒学世界搭建起一个精要概括的知识框架.相信该书有助于普通高等学校和医学高等院校相关专业的本科生,研究生,教师以及相关领域的科研人员在最短的时间内学习和掌握病毒学的基本原理和事实.更希望通过对本书的阅读,激发起读者探索病毒学世界的兴趣.欢迎各界人士邮购科学出版社各类图书(免邮费)邮购地址:北京东黄城根北街16号科学出版社科学出版中心生命科学分社邮编:100717联系人:周文宇(010—64031535)网上订购: 更多精彩图书请登陆网站,欢迎致电索要书目。
第十一章 DNA文库的构建和目的基因的筛选
(3) 引导合成法
Okayama-Berg方法
（4）引物-衔接头合成法
4、双链 cDNA连接到质粒或噬菌体载体并导入 大肠杆菌中繁殖的分子克隆
1.同聚100dA/dT, 20dG/dC) • 同聚尾结合的质粒： cDNA杂合分子转化 E.coli的效率随宿主不 同而不同。
该法聪明地利用了反转录过程中用接头锚定的方法， 与传统法相比，全长cDNA的比例得到大幅提高
2. G
1. 抑制性扣除杂交 suppression subtractive hybridization, SSH
含目的基因的cDNA：供体 tester 不含目的基因的cDNA：驱动 driver
• RsaI消化tester和driver • 将tester一分为二，分别加上接头1和接头2R • 第一轮杂交中，用过量的driver cDNA分别与带两种 接头的tester cDNA杂交 • 第二轮杂交中，将第一轮杂交的两个体系混合，再 加入过量的driver cDNA • 补平第二轮杂交产物的末端，进行两轮PCR扩增 • 巢式引物进行第二轮PCR扩增，富集差异表达基因 • T/A克length cDN因： • cDNA第二链合成工程中聚合酶的外切酶活性； • mRNA降解； • 反转录酶合成特性，从转录复合体上anism at 5' end of RNA • 指导合成高分子量蛋白质的能力 无细胞翻译体系（源于网织红细胞） 哺乳动物总mRNA可编码 10～100kDa蛋白
基因组文库、cDNA文库的构建和筛选
mRNA的提取
• 全长mRNA具有 一个polyA的3’ 末端，可以被用 于mRNA的分离；
• 可以用寡聚纤维 素柱，选择性地 吸附mRNA
• 纯化
• 用结合有寡聚（dT ）的磁珠加到细胞裂解 液，在用强磁铁吸出磁珠并洗出mRNA。
检测mRNA
• 翻译，检测翻译产物： 用无细胞翻译系统（如麦胚抽提液 或兔网织红细胞裂解液）来检测 mRNA的完整性，也可用凝胶电泳 直接检测，用杂交法分离 mRNA。
特特点点：： 对应的菌斑或噬菌斑位置不变， 可以直接找出阳性菌落。
寡聚核苷酸探针
抗体探针
• 表达筛选 通过抗体筛选来检测cDNA编码 的蛋白质
cDNA表达为与β半乳糖苷酶相嵌合的目的基因的融合 蛋白，用抗血清来筛选目的cDNA编码的融合蛋白。 筛选流程与噬菌斑杂交程序相似。
质粒蛋白 A
外源蛋白B
• 质粒载体：cDNA相对较短。 • 噬菌体载体：构建表达cDNA与载体的连接筛选流程
筛选• 从基因的大量克隆中鉴定出某个含有目的基 因的特定克隆的过程，称为筛选
• 筛选过程通常需要一个核酸探针进行杂交，该探 针可以与其互补序列结合从而检测出含目的基因 的克隆。
• 将菌落或噬菌斑转移到膜上，将其置入含放射性 标志探针溶液中保温，检出相应克隆。
• 合适的酶切片段可由琼脂糖凝胶电泳
质粒载体
蓝白筛选
YAC载体
置换型载体
• 允许外源 DNA 片段替换非必须 DNA 片段 的载体，称为置换型载体（replacement vectors）。一般情况下，置换型载体克隆 外源片段的大小范围是 9-2究 人 员 迫 切 地 寻 找 CFTR 及 HD 基 因 时 尚 无 YAC 可 用 。 疾 病 基 因 与 标 记 DNA 的 距 离 远 比 载 体 所 携 带 的 DNA 片 段 还 长 。 他 们 想 出 了染色体步移的方法。虽然标记 DNA 所 制 成 的 探 针 无 法 找 到 包 含 疾 病 基 因 的 片 段 ， 但 所 找 到 的 片 段 (即 与 探 针 杂 交 的 片 段) 有 一 部 分 可 能 比 标 记 DNA 更 接 近 疾 病 基 因 。 在 他 们 制 作 的 基 因 库 里 ， DNA 片 段 之 间 有 部分重叠。因此可以用新找到的片 段做为探针寻找与它重叠的片段。 如此重复许多次后，应该可以找到 包 含 疾 病 基 因 的 片 段。