杀菌剂生物测定技术
实验七杀菌剂生物活性测定方法――抑菌圈法
实验七杀菌剂生物活性测定方法――抑菌圈法一、实验目的掌握抑菌圈法测定杀菌剂的生物活性的方法及步骤。
二、实验原理本实验主要采用抑菌圈法来测定杀菌剂的生物活性。
抑菌圈法是利用杀菌剂在琼脂平板上产生的抑菌效果来对其生物活性进行测定的一种方法。
通常，将杀菌剂溶液滴加到琼脂平板上，使其均匀地分布在琼脂上。
然后，将含有细菌培养物的琼脂平板放入恒温箱中进行培养。
在培养一段时间后，观察平板上是否出现了抑菌圈，并测量抑菌圈的直径来评估杀菌剂的生物活性。
三、实验仪器和材料1.显微镜2.恒温箱3.滴定管或移液管4.琼脂平板5.细菌培养物6.杀菌剂溶液四、实验步骤1.准备琼脂平板。
将琼脂平板置于恒温箱中，加热至溶化状态后取出，待其稍微冷却后均匀地倒入培养皿中。
2.滴加杀菌剂溶液。
将杀菌剂溶液滴加到琼脂平板上，并用移液管在平板上转动，使杀菌剂均匀地分布在琼脂上。
3.检验杀菌剂效果。
取一定量的细菌培养物，将其在琼脂平板上均匀涂布。
4.培养细菌。
将含有细菌培养物的琼脂平板放入预先恒温箱中，设置合适的温度和培养时间。
5.观察抑菌圈。
在培养一段时间后，取出琼脂平板，用显微镜观察平板上是否出现了抑菌圈。
6.测量抑菌圈直径。
使用直尺或量角器等工具测量抑菌圈的直径，并记录结果。
五、实验注意事项1.操作时要注意无菌技术，以避免细菌污染。
2.滴加杀菌剂溶液时要均匀并轻柔，以保证杀菌剂能充分分散在琼脂平板上。
3.培养细菌时要控制好温度和培养时间，以确保细菌能够充分生长。
4.观察抑菌圈时要注意使用合适的放大倍数，以免错过细小的抑菌圈。
5.测量抑菌圈直径时要使用准确的测量工具，以获得准确的结果。
六、实验结果处理根据实验所得的抑菌圈直径数据，可以通过计算其平均值、标准差等统计指标来评估杀菌剂的生物活性。
较大的抑菌圈直径通常表示杀菌剂具有较强的抑菌效果，反之则表示其抑菌效果较弱。
可以将实验结果与已有的标准值进行比较，以判断杀菌剂的生物活性。
七、实验结果分析根据测得的抑菌圈直径结果，可以对杀菌剂的生物活性进行分析。
（整理）农药生物测定实验指导.
（整理）农药⽣物测定实验指导.农药⽣物测定实验指导（⾃编试⽤1.0）主编：姜兴印副主编：赵春青张卫光制药⼯程专业⽤⼭东农业⼤学植物保护学院2008年9⽉棉铃⾍⼈⼯饲料制备⼀、实验⽬的学习棉铃⾍⼈⼯饲料制备技术和⽅法。
本⽅法还适合⽟⽶螟等⼈⼯饲料的制备。
⼆、实验⽤品和仪器设备仪器设备：天平、⾼压灭菌器、罐头瓶、电饭锅、筛⼦（40⽬）、量筒、搪瓷盘、温度计实验物品：⼩麦粉、⽟⽶粉、黄⾖粉、啤酒酵母粉、琼脂、棉叶、V C、棉油、苯甲酸钠、⼭梨酸钾、兽⽤链霉素、⽔等三、实验⽅法1. 配⽅：2. ⼩麦粉、⽟⽶粉、黄⾖粉、酵母粉和棉叶装⼊罐头瓶中，⾼压灭菌40min.（120℃）3. ⽔+琼脂煮开冷却⾄70℃，加⼊Vc、防腐剂、棉油混匀，再加⼊混合好的其他成分，充分混匀。
4. 倒⼊搪瓷盘，加盖冷却后放⼊冰箱中备⽤。
四、质量检查饲料冷却后观察颜⾊和固化成型情况。
五、实验报告农药⽣物测定药剂配制⼀、实验⽬的学习⽣物测定药剂配制的实验操作技术和⽅法。
⼆、实验⽤品和仪器设备电⼦天平、计算器、烧杯、移液管、吸⽿球、记号笔、容量瓶、量筒等。
实验原药：93%顺式氯氰菊酯，95%吡⾍啉实验制剂：50%多菌灵WP，2.5%功夫EC(w/w)，33%施⽥补EC(w/v)三、实验⽅法1. 原药母液的配制与稀释（1）⽤丙酮配制2％顺式氯氰菊酯母液50mL，然后稀释成200mg/L 50mL 丙酮液。
（2）⽤丙酮配制1％吡⾍啉母液50mL，然后稀释成125mg/L 50mL丙酮液（3）将顺式氯氰菊酯和吡⾍啉按照5：2的⽐例混合，配制1.5%混剂50mL 丙酮液。
2. 制剂的稀释（1）50%多菌灵WP，稀释成200mg/L 100mL的⽔溶液（烧杯）。
（2）2.5%功夫EC，稀释成1000mg/L 100mL的⽔溶液（烧杯）。
（3）33%施⽥补EC，稀释成150mg/L 100mL的⽔溶液（烧杯）。
四、结果计算和处理将以上每⼀种母液配制和稀释需要原药和制剂的量计算，并详细描述配制和稀释过程。
09第二章 第三节 杀菌剂的生物测定方法
水溶性药剂、乳油稀释液或稳定的悬浮液（胶悬剂的稀释液）可用此
法，而WP由于是悬浮性差，不宜采用。 优点：操作简单迅速，无需特殊设备
缺点：药剂和孢子始终充分接触，与病害防治的实际相差很大，测得
的毒力往往偏高。
第二章 杀菌剂生物测定
第三节 杀菌剂的生物测定方法
二、杀菌剂温室植株测定方法
针刺法测定农药对番茄灰霉病防治效果的活体试验
二、杀菌剂温室植株测定方法
对照（3d）
40%多菌灵WP1500×（3d）
一种植物精油1000×
针刺法测定农药对番茄灰霉病防治效果的活体试验
二、杀菌剂温室植株测定方法
盆栽法测定农药对小麦白粉病的防治效果
二、杀菌剂温室植株测定方法
第二章 杀菌剂生物测定
第三节 杀菌剂的生物测定方法
一、杀菌剂皿内生物测定 （一）孢子萌发法
3、孢子悬浮液的准备
菌种
无菌水，搅匀
菌种悬浮液
二层纱布过滤 除去菌丝体及破碎培养基
离心 无菌水洗
洗净的孢子
调至浓度5000个/mL（10×10倍，35个孢子）
Байду номын сангаас
第二章 杀菌剂生物测定
第三节 杀菌剂的生物测定方法
第二章 杀菌剂生物测定
第三节 杀菌剂的生物测定方法
一、杀菌剂皿内生物测定 （一）孢子萌发法
3、孢子悬浮液的准备
菌种应是标准菌种，供试菌种应符合以下条件： ①菌种纯粹，在一般培养基上易大量产生孢子； ②多代繁殖不易产生变异； ③孢子个体较大，易于在显微镜下观察萌发情况；
④在分类上有一定的代表性，而且是重要的植物病害病原菌。
2、生长速率法
杀菌剂生物测定技术
2.含毒介质培养法
有3种： （1）抑菌圈法 （2）生长速率法 （3）最小浓度法
（1）抑菌圈法的原理
基本原理是在已经接种供试菌的洋菜培养基 （通常在培养皿内）表面，利用各种方法（管 碟法，滤纸片法，孔碟法 ）使药液和培养基接 触，恒温培养一定时间后，由于药剂的渗透扩 散作用，施药部位周围的病菌被杀死或生长受 到抑制，从而产生了抑制圏。根据抑菌圈的大 小来比较不同杀菌剂的毒力大小。
用十字交叉法测量抑菌圈的直径
孔碟法
用灭菌后的打孔器直接在凝固好的 含孢培养基上打成圆孔，将定量的药 液滴入圆孔中，恒温培后测量抑菌圏 的大小，进行杀菌剂毒力比较。
影响抑菌圈法测定结果的因素
主要有以下几个方面的
1 对供试菌的要求 在较粗放的比较 杀菌剂毒力的测定中，对菌种的要求不 必过严，只要在培养基中容易培养而且 抑菌圈清楚的均可采用。
孢子萌发的标准
以病菌孢子作为指示物进行杀菌剂毒力测定。 用孢子液和不同浓度的药液混合，恒温保湿培养， 培养一定时间后即可检查孢子萌发率。一般在低 倍镜下，每处理随机检查200个孢子。
抑制率计算
孢子萌发率（%）＝萌发孢子数/检查孢子数X100 若对照组有20%以上孢子不萌发，则应重做。
对照萌发率－处理萌发率 抑制孢子萌发率（%）＝－－－－－－－－－X100
抑菌圈法示意图
注意事项
上述操作应尽量在无菌条件下进行，
以防污染
操作室的温度最好在26～28℃左右，
如室温太低，则50℃左右的培养基在操作 过程中迅速冷凝，无法制作平板
十字交叉法测量抑菌圈的直径 ，消除误
差
滤纸片法
（1） 配制不同浓度的药液
（2） 配孢子悬浮液
（3） 制含孢子的平板
农药室内生物测定技术与方法
农药室内生物测定技术与方法张宗俭(沈阳化工研究院农药生物测定中，沈阳110021)一、农药生物测定的含义及其用途农药生物测定是指利用靶标生物(昆虫、螨类、病原微生物、线虫、植物等)的活体或离体器官、组织、细胞或其代谢物等(如酶、蛋白质等)为试材，测试或鉴别生物活性物质的类型、反应症状或其活性大小的一种方法。
简单地说，农药生物测定技术就是利用靶标生物等对药剂的反应来鉴别农药毒力或药效的一种技术。
农药生物测定主要包括杀虫剂(杀螨剂)、杀菌剂(杀线虫或抗病毒剂等)、除草剂、杀鼠剂以及植物生长调节物质等的生物测定技术。
它涉及靶标生物、测试物质(药剂)、反应症状及强度、测试环境条件等多方面的因素。
一个好的生物测定技术或方法应具备易于操作、结果反应灵敏、重现性好、且使用物质的剂量与反应之间有良好的相关性。
农药生物测定技术与农药的使用和开发同时产生，经过长期不懈创新、完善和发展，已经成为研究生理活性物质、靶标生物以及反应强度三者关系的一项专门技术，被广泛应用于新农药的筛选以及作用特性和应用技术评价等研究之中。
纵观目前农药生物测定的研究概况，室内农药生物测定技术主要应用于以下几个方面：1．刨制农药生物活性筛选研究：随着农业生产的发展和人们对地球环境生态和人类健康等的要求不断提高，高效、低毒、环境友好型新农药的开发应用给人类社会和生产企业带来巨大的效益，但同时也由于新农药开发的难度与费用日益增加，如何利用生物测定技术快速高效地筛选新化合物，并准确评价其生物活性以及应用技术，估测其农药生物评价技术报告会市场前景及将来在市场上的占有率和利润额，是决定其创制农药研究成功与否的关键。
利用生物测定方法研究同一类结构或同一作用类型化合物的化学结构与生物活性关系的规律(sAR)以及与靶标作用位点的结合关系，为定向创制新农药和计算机辅助设计新化合物提供基础数据和理论依据。
生物活性筛选被称为农药创制的“眼睛”．对新农药开发研究起着举足轻重的作用。
霉菌--生长速率法
菌落生长速率的表示方法 菌落达到一个给定的大小所需要的时间（天或小时） 在单位时间内菌落直径的大小
生长速率法常用的菌种 苹果腐烂病菌（Valsa mali） 小麦纹枯病菌（Rhzoctonia solani ） 棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporium） 葡萄白腐病菌（Coniothyrium diplodiella） 小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces graminis） 辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）
6
7
五、实验数据及其处理 纯生长量=菌落平均直径-菌饼直径 抑菌率（%）=[(对照菌落纯生长量-处理菌落纯生长量/ 对照纯生长量]×100%
8
50%多菌灵对苹果腐烂病菌的抑制作用(生长速率法)
菌落直径（mm）
药 剂
浓度（mg/L）
浓度 对数
ⅠⅡ
ⅢⅣ
平均
ห้องสมุดไป่ตู้
抑制 （%）
机 率 值
9
机率值
6 y = 0.9624x + 2.8171
大家好
1
实验十 杀菌剂的生物测定--生长速率法
2
一、实验目的 学习并掌握杀菌剂的生物测定方法之一--生长速率法
二、实验原理 生长速率法是杀菌剂毒力测定的常规方法之一，适用于不 长孢子而菌丝生长较快的真菌，是通过菌落生长的速度快 慢来衡量药剂的毒力大小 生长速率法又叫含毒介质法，它是将供试药剂与培养基混 合，以培养基上菌落的生长速度来衡量化合物的毒力大小。 一般多用于那些不产孢子或孢子量少而菌丝较密的真菌
4
三、试剂和仪器设备 高压灭菌锅、超净工作台、酒精灯、接种针、纱布、吸 管、消毒培养皿、打孔器、无菌小烧杯 PDA培养基 病原菌（苹果腐烂病菌） 供试杀菌剂(多菌灵)
实验十杀菌剂的生物测定生长速率法
五、实验数据及其处理
纯生长量=菌落平均直径-菌饼直径 抑菌率（%）=[(对照菌落纯生长量-处理菌落纯生长量/ 对照纯生长量]×100%
50%多菌灵对苹ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ腐烂病菌的抑制作用(生长速率法)
菌落直径（mm）
药 剂
浓度（mg/L）
浓度 对数
ⅠⅡ
ⅢⅣ
平均
抑制 （%）
机 率 值
6 y = 0.9624x + 2.8171
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机率值
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2
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浓度对数
六、问题讨论
根据实验结果比较各种供试药剂之间对病原菌菌丝生长 的抑制作用
菌落生长速率的表示方法 菌落达到一个给定的大小所需要的时间（天或小时） 在单位时间内菌落直径的大小
生长速率法常用的菌种 苹果腐烂病菌（Valsa mali） 小麦纹枯病菌（Rhzoctonia solani ） 棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporium） 葡萄白腐病菌（Coniothyrium diplodiella） 小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces graminis） 辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）
三、试剂和仪器设备 高压灭菌锅、超净工作台、酒精灯、接种针、纱布、吸 管、消毒培养皿、打孔器、无菌小烧杯 PDA培养基 病原菌（苹果腐烂病菌） 供试杀菌剂(多菌灵)
四、实验步骤
将培养基加热溶化，冷却至45-50℃，加入供试药液制成 含药液的培养基，并分别倒入培养皿中冷却
以无菌操作手续，用打孔器打取圆形菌块后用接种针挑至 培养皿中央，然后将培养皿置于培养箱（27℃）中培养即可
一、实验目的
学习并掌握杀菌剂的生物测定方法之一--生长速率法
常用杀菌剂生物测定中稀释母液的配制方法
Ｐ ｅ ａ ａ ｉｎｏ ａ ｅ ｌｔ ｎ ｆ ｕ ｇｃｄ ｓｉ ｂ Ｔｏ ｉｉ ｏ ｓａ ｒ ｐ ｒ ｔｏ ｆ Ｗ ｔｒＤｉ ｉ ｓｏ ｎ ｉｉｅ Ｌａ ｘｃｔ Ｂｉａ ｓ ｙ ｕ ｏ Ｆ ｎ ｙ
１ ａ ｔ ｅｉ ｇ ｅ ｉ ｎ ． ｈ ｏ ａ ｅ ｏ ｙ ｌ ｈ ｘ ｎ ｎ ｓ０ ｔ ． ％， ｎ ％ ｎ Ｂｕ ｙ ｌｏ ｏ ｓ ｄ ｅ ｔ ｎ ｒ ａ ｅｔ ｅ ％ ｃｉ ｒ ｄ ｅ ｔ ｔ ｅ ｄ ｓ ｇ ｆ ｃ ｏ ｅ ａ ｏ ｅ ｗａ ２５ ｖ ｎ ｃ ｏ ａｄ１ － ｔｌ ｃ ｈ ｌ ａ Ｗａ ａ ｄ ｄ ｉ ｏ ｔ ｉ ｃｅ ｓ ｎ ｏ ｈ
Ｔｈ ｂ ｖ ｙ ｔ ｍｓ ｃ ｕ ｄ ｒｄ ｃ ｈ ｉ ｕ ｂ ｃ ｆ ｓ ｌｅ ｔ ｎ ｕ ｆｃ ａ ｔ ｎ ｔ ｅ ｂ ｏ ｓ ｙ ｒ ｓ ｌ ，ｉ ｒ ｖ ｅｒ ｅ ａ ｏ ｅ ｓ ｓｅ ｏ ｌ ｅ ｕ ｅ ｔ ｅ ｄ ｓ ｒ ａ ｅ ｏ ｏ ｖ ｎ ｓ ａ ｄ ｓ ｒａ ｔ ｎ ｓ ｏ ｈ ｉ ａ ａ ｕ ｔ ｍｐ ｏ ｅ ｔ ｉ ｔ ｎ ｓ ｅ ｓ ｈ ｒ ｌ ｂｌ ｙａ ｄｃ ｍｐ ａ ｉ ｔ ． ｅｉ ｉ ｔ ｏ ａ ｂ ｌ ｙ ａ ｉ ｎ ｒ ｉ ）
配制成 ｌ ％水悬浮剂母液 ，其 中润湿分散 剂为 ２ １０ ｌ 农乳 ５０，粘度调节剂为 ０ ％黄原 ％ ６２和 ％ ０ ． ２
胶。上述母液体 系组成简单 ，减 少了 有机溶剂、表面活性剂等对毒 力测定结果的干扰，便于提 高
生物测定结果的可靠性和可比性 。
关键词：杀菌 剂；母 液 ；配制
２ １ １） ７ ０ 摘要： 介绍了杀菌剂生物测定 中常用杀菌剂稀释母 液的配制方法。 于杀菌剂原油及 易溶于环 对
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三、杀菌剂室内主要生测方法
孢子萌发法 含毒介质培养法
叶碟法
管碟法 滤纸片法 孔碟法 生长速率法 最小浓度法
抑菌圈法
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1.孢子萌发法
孢子萌发法是历史最悠久而广泛被采用 的 杀 菌 剂 毒 力 测 定 方 法 。 早 在 1807 年 。 Prevost 就采用此法，后经不少学者改进， 使之日趋规范、合理。
第三章 杀菌剂生物测定技术
供试菌种 杀菌剂生测的应用 杀菌剂生测方法 杀线虫生测方法 杀菌剂盆栽试验 杀菌剂田间药效试验
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1
杀菌剂室内生物测定的主要内容 是将杀菌物质作用于细菌、真菌或 其他病原微生物，根据其作用的大 小来判定药剂的毒力。或将杀菌物 质施于植物，对病害发生的有无或 轻重观察比较来判定药剂的效果。
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原理：都是将供试药剂附着在载玻片上或其 他平面上，然后将供试病菌孢子悬浮液滴在 上面（或将施于悬浮液和药液混合后滴在玻 片上），在保温，保温条件下培养一定时间 后镜检，以孢子萌发率判断杀菌剂毒力。孢 子萌发法的突出优点是快速，试验当天即可 获得结果，尤其适合于保护剂的筛选。
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抑菌圏法的优缺点
抑菌圏法的优点
精确度高 操作简单
抑菌圏法的缺点
溶解性 扩散性
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抑菌圈法示意图
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含有孢子 的培养基
不同浓度 的药液
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根据施加药剂在洋菜培养基表 面的方式，抑菌圈法又分为管碟法 （牛津杯法）、滤纸片法、孔碟法。
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管碟法 又称牛津杯法
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注意事项
上述操作应尽量在无菌条件下进行，
以防污染
操作室的温度最好在26～28℃左右，
如室温太低，则50℃左右的培养基在操作 过程中迅速冷凝，无法制作平板
十字交叉法测量抑菌圈的直径 ，消除误
差
教学pptຫໍສະໝຸດ 25滤纸片法（1） 配制不同浓度的药液
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（4）在每皿培养基上按合适的间隔放置6个 不锈钢小管（即牛津杯，外径8.0士 0.lmm。 内径6.0士0.1mm，高10.0士0.lmm），其中1 个管为对照，其余5管为5个不同浓度的药液， 在适合的温度下培养一段时间，取出用十字 交叉法测是抑菌圈的直径。
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抑菌圈法示意图
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一、供试菌种
供试病原菌要求
在分类上有一定代表性，最好是重要的农 业植物病害的病原菌， 而且容易培养， 多代繁殖不易产生变异。
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常用的供试菌种
番茄灰霉病菌（Botrytis cintrea） 番茄早疫病菌（Alternaria solani） 辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici） 苹果轮纹病菌（Physalospora berengeriana） 苹果炭疽病菌（Glomerella cingulata） 苹果腐烂病菌（Valsa mali） 葡萄黑痘病菌（Elsinoe ampelina） 葡萄白腐病菌（Coniothyrium diplodiella）
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2.含毒介质培养法
有3种： （1）抑菌圈法 （2）生长速率法 （3）最小浓度法
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（1）抑菌圈法的原理
基本原理是在已经接种供试菌的洋菜培养基 （通常在培养皿内）表面，利用各种方法（管 碟法，滤纸片法，孔碟法 ）使药液和培养基接 触，恒温培养一定时间后，由于药剂的渗透扩 散作用，施药部位周围的病菌被杀死或生长受 到抑制，从而产生了抑制圏。根据抑菌圈的大 小来比较不同杀菌剂的毒力大小。
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水稻稻瘟病菌（Piricularia oxyzae） 小麦赤霉病菌 (Gibberella zeae) 小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces graminis） 玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum） 玉米弯孢病菌（Curvularia lunocto） 棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporium） 枯草杆菌（Bacillus subtilis） 白菜软腐病菌（Erwinia carotovora sub sp.carotovora） 水稻白叶枯病菌（Xanthomonas campestrispv.oryzae） 等。
（1） 用灭菌蒸馏水将供试药剂配制成一系列 梯度浓度，一般5~7个浓度。 （ 2 ） 制备一定“浓度”的供试菌悬浮液（如 真菌，则宜用孢子悬浮液），浓度以在低倍镜 （15X10倍）下每视野80一100个左右孢子为宜。
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（3）待培养基冷至50℃左右（凭经验估计）， 迅速吸取10ml菌液加入培养基内，充分混合后， 倒入灭菌的培养皿中，制成含菌培养基平板。
对照萌发率－处理萌发率 抑制孢子萌发率（%）＝－－－－－－－－－X100
对照萌发率
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LC50 和LC95的计算
将抑制孢子萌发率换算成机率值，作为Y； 药剂的浓度以对数值来表示作为X，直线回归， 求得回归方程Y＝a+bx，可得LC50和LC95.。
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孢子萌发法的适用范围
孢子萌发法只适用于产生孢子的真菌。 一般的供试病菌有： 马铃薯晚疫病菌（Phytophthora infestans） 水稻稻瘟病菌（Piricularia oryzae） 小麦赤霉病菌（Gibberella zeae） 玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）
孢子萌发的标准
以病菌孢子作为指示物进行杀菌剂毒力测定。 用孢子液和不同浓度的药液混合，恒温保湿培养， 培养一定时间后即可检查孢子萌发率。一般在低倍 镜下，每处理随机检查200个孢子。
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抑制率计算
孢子萌发率（%）＝萌发孢子数/检查孢子数X100 若对照组有20%以上孢子不萌发，则应重做。
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二、杀菌剂生物测定的应用
1 从大量合成化合物中筛选出有可能作为 杀菌剂的化合物
2 为特定的植物病害寻找有效的药剂，为 此需要进行筛选杀菌剂毒力的比较
3 杀菌剂作用方式及作用机制的研究
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4 杀菌剂抗性的研究 5 杀菌剂混用及剂型研究 6 杀菌剂抗雨水冲刷能力及残效作用的研究 7 某些杀菌剂（特别是农用抗菌素）的微量分析