实验三 霉菌、放线菌及土壤中微生物的分离纯化共27页
微生物实验指导书-教材
微⽣物实验指导书-教材微⽣物学实验指导书⽬录实验⼀玻璃器⽫清洗、包扎与常⽤灭菌技术 (3)实验⼆培养基的配制 (8)实验三从⼟壤中分离微⽣物及纯化 (11)实验四微⽣物的接种技术 (14)试验五细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的形态观察 (17)实验六细菌的简单染⾊和⾰兰⽒染⾊ (20)实验七⼤肠杆菌⽣长曲线的测定 (23)实验⼋实验室环境和⼈体表⾯微⽣物的检查 (25)实验九乳酸菌的检测 (28)实验⼀玻璃器⽫清洗、包扎与常⽤灭菌技术【⽬的要求】1. 学习并掌握棉塞制作的⽬的、原理及⽅法；2. 学习并掌握玻璃器⽫清洗及包扎⽅法；3.掌握⾼压蒸汽灭菌的基本原理及操作⽅法。
4.了解其它常⽤消毒灭菌技术原理及技术【基本原理】棉塞的作⽤有⼆：⼀是防⽌杂菌污染，⼆是保证通⽓良好。
因此，棉塞质量的优劣对实验的结果有较⼤的影响。
微⽣物学实验所⽤的器⽫，⼤多数要进⾏清洗、消毒、灭菌，才能⽤来培养微⽣物。
玻璃器⽫的包扎⽅法正确合理，在使⽤过程中才能有效防⽌杂菌的污染。
玻璃器⽫包扎好后，⼀般⽤⾼压蒸⽓灭菌法进⾏灭菌。
⾼压蒸⽓灭菌是将待灭菌的物品放在⼀个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的⽔沸腾⽽产⽣蒸⽓。
待⽔蒸⽓急剧地将锅内的冷空⽓从排⽓阀中驱尽，然后关闭排⽓阀，继续加热，此时由于蒸⽓不能溢出，⽽增加了灭菌锅内的压⼒，从⽽使沸点增⾼，得到100℃以上的⾼温，导致菌体蛋⽩质凝固变性⽽达到灭菌的⽬的。
此外，常见灭菌⽅法还有⼲热灭菌、灼烧灭菌、紫外线灭菌、过滤除菌等。
对空间灭菌常使⽤甲醛加⾼锰酸钾熏蒸、喷洒消毒灭菌药剂等消毒灭菌⽅法。
【实验⽤品】棉花，试管，培养⽫，纱布，三⾓瓶，棉线，量筒，⽜⽪纸（或旧报纸），LDZX-50KBS ⽴式⾼压蒸⽓灭菌锅，常⽤灭菌⽤具、药剂等等。
【⽅法步骤】⼀、棉塞的制作正确的棉塞要求形状，⼤⼩，松紧与试管⼝（或三⾓瓶⼝）完全适合，过紧妨碍空⽓流通，操作不便；过松则达不到滤菌的⽬的。
制作过程见图1，包括取棉花、整理、折⾓、卷紧、成形、塞试管等步骤。
实验三霉菌放线菌形态观察及微生物菌落观察
观察青霉菌 丝和分生孢 子着生情况：
1.单轮生青霉群；2.对称二轮 生青霉群；3.多轮生青霉群；4. 不对称生青霉群
担子菌担孢子的观察
切片标本的制作：现场演示
下次实验准备
每组两个平板，分别是马铃薯培养基（培养 真菌），另一个高氏培养基（培养放线菌）
实验室环境中微生物的检查 用棉签取实验室环境条件下的微生物进 行涂板。
一、实验目的
了解放线菌、霉菌、酵母菌和大型真菌的特点 并观察其形态特征
学习掌握霉菌染色的基本方法
二、实验原理
原核微生物
放线菌：
由不同长短的纤细的菌丝所形成的单细 胞菌丝体。菌丝体分为两部分，即潜入 培养基中的营养菌丝（或称基内菌丝） 和生长在培养基表面的气生菌丝。有些 气生菌丝分化成孢子丝，呈螺旋形、波 浪形或分枝状等。孢子常呈圆形、椭圆 形或杆状。气生菌丝及孢子的形状和颜 色常作为分类的重要依据。
真核微生物
酵母菌：酵母菌细胞一般呈卵圆形、圆形、圆柱形或
柠檬形。酵母细胞核与细胞质有明显的分化，个体直 径比细菌大几倍到十几倍。繁殖方式也较复杂，无性 繁殖主要是出芽生殖，有些酵母能形成假菌丝。有性 繁殖是通过接合形成子囊及子囊孢子。
霉菌：凡在营养基质上形成绒毛状、棉絮状或蜘蛛网
形丝状菌体的真菌，统称为霉菌。霉菌包括分类学上 许多不同纲或类的真菌，它们分别属于藻状菌纲、子 囊菌纲、担子菌纲和半知菌类。
常见大型真菌：在分类上属于子囊菌纲和担子菌纲，
均为丝状真菌。
三、实验材料
放线菌和真菌培养物
1. 放线菌培养物：青色链霉菌四天插片培养物。 2. 啤酒酵母24至28h液体培养物。 3. 黑曲霉和根霉4d搭片培养物。 4. 各种真菌示范片。 5. 市售平菇
实验三霉菌、放线菌及土壤中微生物的分离纯化
． 黑 曲 霉 培 养 物 ．
一
插 片 培 养 物 ．
放 线 菌 培 养 物 ： 链 霉 菌
． 放 线 菌 和 真 菌 培 养 物
三 、 实 验 材 料
碘
灯环
四
液
、、
天
、
四、实验步骤
观察放线菌气生菌丝和基内 菌丝的区别 取插片一片，直接在显微镜 下进行观察，注意分界面两 侧菌丝形态的差异 插片法培养放线菌
分离真菌的同学取一瓶马丁-孟加拉红培养基 （200ml／瓶）熔化后冷至50℃后加链霉素 2ml倒平板。
四．悬液涂布(演示): 无菌操作(从稀至浓将菌液涂布均匀)采用10 －2，10－3，10 －4稀释液涂布马丁－孟加拉红平板；采用 10－3，10－4，10－5稀释液涂布牛肉膏蛋白胨平板,每人用 剩下的1个平板做划线分离，从三角瓶中取土壤悬液作划线分 离（演示）
2、霉菌：
霉菌是一些“丝状真菌”的统称，不是分类学上的名词。凡是在基质上长成毛状、棉絮 状或蜘蛛网状的丝状真菌统称霉菌。
霉菌形态比细菌、放线菌复杂，个体比较大，具有分枝的菌丝体和分化的繁殖器官。因 此，在观察是要注意菌丝的直径大小，菌丝体有无隔膜，营养菌丝有无假根，无性繁殖 或有性繁殖时形成的孢子是哪一种，孢子是怎样着生的。
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实验三 放线菌、霉 菌的形态观察 及微生物的分离纯 化
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一、实验 目的
实验（一）放线菌、霉菌的形态 观察
观察放线菌、霉菌的形态结构特征
学习掌握霉菌染色的基本方法 基本掌握细菌、放线菌、酵母菌、霉 菌菌落形态特征
二、实验原理
放线菌：放线菌是介于细菌与丝状真菌之间而又接近于细菌的一类丝状原核生物，因菌落呈放射状 而得名。 放线菌的菌落在培养基上着生牢固，不易被接种针挑取，由于孢子的存在，常使菌落表面呈粉末状。 它和细菌单染色一样，可用石炭酸复红和吕氏美蓝等染料着色后，在显微镜下观察它们的形态。放 线菌是由不同长短的纤细的菌丝所组成的单细胞菌丝体，菌丝内无隔膜，菌丝体分为两部分，即潜 入培养基中的营养菌丝（基内菌丝）和有营养菌丝向上生长的气生菌丝，有些气生菌丝分化成各种 孢子丝，呈螺旋状、波浪形或分枝状等，着生形式有丛生、互生和轮生三种。孢子的表面光滑或粗 糙，圆或椭圆和干形。孢子有各种颜色。这些形态特点都是鉴别放线菌的重要依据。
土壤中微生物的分离纯化(电子版实验报告)
微生物实验报告土壤中微生物的分离与纯化指导教师：李海花周四晚第四组实验成员: 杜玉琪180112010009董天涵180112010008蒋怡菲180112010018逄颖180112010035【摘要】利用分离纯化微生物的基本操作技术对土壤中的微生物进行分离和纯化，通过观察微生物的菌落形态特征判断菌的类型并通过平板划线进行分离纯化【关键词】土壤、微生物、菌落观察、分离纯化1.实验目的（1）通过对几种培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。
（2）掌握倒平板的方法、接种和无菌操作技术。
（3）初步观察来自土壤中的几类微生物的菌落形态特征，并能判断菌的类型。
（4）学习平板菌落计数的基本原理和方法，并掌握其基本技能。
2.实验原理（1）培养基的配制与灭菌培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴别、保存各种微生物或积累代谢产物。
一般的培养基应包含适合微生物生长的6大营养素即水分、碳源、氮源、能源、无机盐和生长因子。
不同微生物对pH要求不一样，霉菌和酵母菌的培养基的pH一般是偏酸的，而细菌和放线菌培养基的pH一般为中性或微碱性。
所以配制培养基时还要根据不同微生物的要求将培养基的pH调到合适的范围。
已配制好的培养基必须立即灭菌，如来不及灭菌，应暂存冰箱，以防止其中微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养基酸碱度所带来不利影响。
（2）微生物的培养及鉴定接种：将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。
接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。
接种的关键是要严格的进行无菌操作。
鉴定：常见与常用的微生物中,根据它们的主要形态可分为细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类。
细菌菌落光滑，易于基质脱离；放线菌菌落质地致密，菌落较小，广泛延伸；酵母菌菌落较细菌菌落大而厚；霉菌形成的菌落较稀松，多成绒毛状，絮状。
（3）平板分离与活菌计数倒平板：按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称、土样编号和实验日期等。
土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化
土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化一、实验目的1. 学习、掌握从土壤稀释分离、划线分离各类微生物的技术。
2. 学习从样品中分离、纯化出所需菌株。
3. 学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的培养条件和培养时间。
4. 学习平板菌落计数法。
二、实验原理将待分离的样品进行一定的稀释，使微生物的细胞（或孢子）尽量呈分散状态，选用有针对性的培养基，在不同温度、通风等条件下培养，让其长成一个纯种单个菌落。
要想获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。
微生物四大类菌的分离培养基、培养温度、培养时间见表2-1所示。
表2-1 微生物四大类菌的分离和培养要求样品来源分离对象分离方法稀释度培养基名称培养温度/℃培养时间/d土样细菌稀释分离10-5，10-6，10-7牛肉膏蛋白胨30～37 1～2土样放线菌稀释分离10-3，10-4，10-5高氏1号28 5～7 土样霉菌稀释分离10-2，10-3，10-4马丁氏琼脂28～30 3～5面肥或土样酵母菌稀释分离10-4，10-5，10-6马铃薯葡萄糖28～30 2～3细菌分离平板细菌单菌落划线分离10-2 牛肉膏蛋白胨30～37 1～2三、实验材料1. 菌源土样2. 培养基牛肉膏蛋白胨培养基，马丁氏培养基，高氏合成1号培养基，马铃薯葡萄糖培养基(制平板和斜面)，见附录Ⅲ。
3. 无菌水 250 mL锥形瓶，每瓶装99 mL无菌水(或95mL为分离霉菌用)，内装10粒玻璃珠。
4.5 mL无菌水试管(每人5～7支)。
4. 其他物品无菌培养皿，无菌移液管，无菌玻璃涂棒(刮刀)，称量纸，药勺，橡皮头，10%酚溶液。
（一）系列稀释平板法1. 取土样选定取样点，按对角交叉（五点法）取样。
先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。
盛土的容器应是无菌的。
将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等杂物，装入已灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。
土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化
土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化一、实验目的1. 学习、掌握从土壤稀释分离、划线分离各类微生物的技术。
2. 学习从样品中分离、纯化出所需菌株。
3. 学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的培养条件和培养时间。
4. 学习平板菌落计数法。
二、实验原理将待分离的样品进行一定的稀释，使微生物的细胞（或孢子）尽量呈分散状态，选用有针对性的培养基，在不同温度、通风等条件下培养，让其长成一个纯种单个菌落。
要想获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。
微生物四大类菌的分离培养基、培养温度、培养时间见表2-1所示。
表2-1 微生物四大类菌的分离和培养要求样品来源分离对象分离方法稀释度培养基名称培养温度/℃培养时间/d土样细菌稀释分离10-5，10-6，10-7牛肉膏蛋白胨30～37 1～2土样放线菌稀释分离10-3，10-4，10-5高氏1号28 5～7 土样霉菌稀释分离10-2，10-3，10-4马丁氏琼脂28～30 3～5面肥或土样酵母菌稀释分离10-4，10-5，10-6马铃薯葡萄糖28～30 2～3细菌分离平板细菌单菌落划线分离10-2 牛肉膏蛋白胨30～37 1～2三、实验材料1. 菌源土样2. 培养基牛肉膏蛋白胨培养基，马丁氏培养基，高氏合成1号培养基，马铃薯葡萄糖培养基(制平板和斜面)，见附录Ⅲ。
3. 无菌水 250 mL锥形瓶，每瓶装99 mL无菌水(或95mL为分离霉菌用)，内装10粒玻璃珠。
4.5 mL无菌水试管(每人5～7支)。
4. 其他物品无菌培养皿，无菌移液管，无菌玻璃涂棒(刮刀)，称量纸，药勺，橡皮头，10%酚溶液。
（一）系列稀释平板法1. 取土样选定取样点，按对角交叉（五点法）取样。
先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。
盛土的容器应是无菌的。
将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等杂物，装入已灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。
土壤中微生物的分离
实验三土壤中微生物的稀释分离、纯化及无菌操作技术一、教学目标与基本要求：1、掌握倒平板的技术和分离纯化微生物的基本操作技术。
2、设计实验方案，分离目的菌，并通过后续实验做出初步鉴定。
二、实验内容：1．用稀释法从土壤中分离细菌、放线菌和霉菌。
2．用平板划线法分离纯化微生物。
3．学习斜宜接种、穿刺接种、平板接种、液体接种等接种方法。
三、实验步骤（一）微生物分离的方法有很多种，但常用的有两种：1.平板划线分离法借助划线使混杂的微生物在平板的表面分散开，二获得单个菌落，从而达到分离的目的，具体方法如下： 1)倒制平板：将固体培养基熔化，冷却至50-55℃，然后在酒精灯火焰旁，以右手持培养基，左手拿培养皿，以无菌操作将培养基注入培养皿内，约15ml，轻微转动培养基，使培养基均匀分布，然后静置于水平位置，凝固即成平板，并在皿该边贴上标签。
2.稀释平板分离法稀释手段，使样品分散到最低限度，然后吸取一定量注入平皿内，倒入培养基，摇匀静置凝固后培养，这样被分离的细菌被固定在原处而形成菌落，可作为一种记数方法。
1)制备土壤稀释液：（细菌的分离）以无菌操作，称取样品1g，加入装有99ml无菌水的锥形瓶中，振荡10-20分钟，使土样与水充分混合，即成10-2土壤稀释液，然后用无菌移液管吸取9ml无菌水的试管内，制成10-3的稀释液将此移液管在试管内反复吸冲三次，然后取出移液管，并将其通过火焰，再插入原来包移液管的纸套内，以备再用，振荡10-3 的稀释液试管，再从纸套取出原来的移液管插入已混匀的试管内，再吹洗三次，然后吸出1ml10-3的稀释液至另一支装有9ml 无菌水的试管中，制成10-4稀释液。
用同样方法再制成10-5、10-6的稀释液，稀释完毕后，可用原来的移液管，从菌液浓度最小的 10-6的稀释液开始吸取1ml10-6稀释液，加到相应编号10-6的无菌培养皿内，以相同方法分别吸取1ml10-5、10-4的稀释液加到相应编号为10-5、10-4的无菌培养皿内，整个分离过程见下图。
土壤微生物的分离和纯化实验
实验八土壤微生物的分离和纯化一、目的1.了解从土壤中分离与纯化微生物的基本原理及方法。
2.掌握几种常用的分离的基本操作技术。
二、原理在自然界中,土壤是微生物生活中的最适宜的环境,土壤中存在大量的微生物,但土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体,因此,为了研究某一微生物的特性,或者要大量地培养和利用某种微生物,必须把它们从这些混杂的微生物群中分离出来。
从而获得某一菌株的纯培养。
这种获得纯培养的方法称之为微生物的分离和纯化三、器材1.牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏l号培养基、马铃薯蔗糖琼脂培养基。
2.盛有100毫升无菌水的三角瓶,9毫升无菌水的试管,无菌吸管,无菌玻璃涂抹棒,10%的酚液,25%的乳酸,土样,接种环,标签。
四、方法(一)涂抹平板分离法1.制备土壤稀释液称取土样10克,放入装有玻璃珠和100毫升无菌水的三角瓶中,振摇15—20分钟,使土与水充分混合,将菌分散,静止片刻,用吸管从中吸取1毫升土壤悬液注人盛有9毫升无菌水试管中,吹吸三次,并振摇使之充分混匀,然后再吸取1毫升注入另一支盛有9毫升无菌水的试管中,以此类推制成10-1、10-2、l0-3、10-4、l0-5……的各种稀释度的土壤悬液。
2.倒平板将牛肉膏蛋白胨培养基,高氏1号培养基,马铃薯蔗糖培养基溶化。
待冷至50—60℃时,在高氏l号培养基中加入10%酚2滴,在马铃薯蔗糖培养基中加入25%乳酸2滴,然后分别倒平板,每支培养基倒一皿(用右手持盛培养基的试管,左手拨出棉花塞,试管口在火焰上灭菌,然后左手将培养皿在火焰附近打开少许,迅速注入培养基,加盖后轻轻摇动培养皿使培养基均匀分布,平放在桌面上,待凝后即成平板。
(见图18)。
3.涂抹将上述每种培养基平板标上10-3、10-4、10-5稀释度,然后用无菌吸管分别从10-5、10-4、10-3稀释度的试管中吸取土壤悬液,每一平板注入0.2毫升,再用灭菌玻璃涂抹刮棒在培养基表面轻轻地涂布均匀,静止5分钟。