《仪器分析》第十四章分子发光光谱法
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分子发光光谱法
内转换
内转换：同多重度电子能级中，等能级间的无辐 射能级交换。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子 跃回第一激发单重态的最低振动能级。
外转换 外转换：激发分子与溶剂或其他 分子之间产生相互作用而转移能 量的非辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或“ 猝灭”。
系间跨越 系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非 辐射跃迁。 改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道 耦合进行。
荧光强度对温度变化敏感。
一般地，随温度降低，溶液中荧光物质的量子效率和荧光强
度将增大，并伴随光谱的蓝移。温度增加，碰撞频率增加， 使外转换的去激发几率增加。
(3) pH的影响
对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制； 如苯胺：在pH 5-12溶液中，以分子形式存在，有荧光。
pH< 5时以苯胺阳离子形式存在，无荧光
ex em
（3）可变波长同步扫描荧光法：使两单色器在扫描过程中以 不同的速率同时进行扫描，即波长可变。
同步扫描荧光法的特点：
优点：
（1）使光谱简化； （2）使谱带窄化；
（3）减小光谱的重叠现象；
（4）减小散射光的影响。
例如：采用同步扫描技 术检测如图萘、蒽、菲 、芘混合物，可简化光 谱，减少光谱重叠，提 高分辨率。 缺点： 因为同步扫描荧光损失了 其它光谱带所含的信息， 对光谱学的研究不利。
比较法：
在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，直接
比较。
三、荧光分析法的应用
可采用直接测定法或间接测定（荧光猝灭）法
1、无机化合物的分析
与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定
仪器分析原理4-1分子发光分析法
荧光光谱具有如下特性： ① 斯托克斯位移： 由于振动驰豫而损失了能量，所以
荧光波长大于激发光的波长。 ② 荧光光谱的形状与激发光波长无关，分子的吸收谱可
能有几个吸收带，但是荧光光谱只有一个发射带—从 第一激发态的最低振动能级回到基态，所以荧光光谱 和激发波长无关。 ③ 镜像对称：有些物质的荧光光谱和吸收光谱之间存在 “镜像对称”关系。
(2) 分子为刚性的平面结构 平面刚性结构可以减少分子自身的振动，使分子与溶 剂或其它溶质刚性的平面结构的相互作用减少，降低 了碰撞去激发的可能性，有比较强的荧光。
O
O
OO
O
C COO
C COO
荧光黄 发荧光 酚酞 不发荧光
H3C CH3
CH 2OH
萘
荧光强
维生素A 荧光弱
(3) 取代基效应 苯环上不同的取代基及取代基位置对该化合物的荧光 强度和荧光光谱有较强的影响。 △ 给电子取代基加强荧光 如: –NH2、–NHR、–NR2、–OH、–OR、–CN等； △ 得电子基取代基一般将使荧光减弱，使磷光加强 如: 羰基(＞C=O、–COOH、)，硝基(−NO2)和重氮 基等； △ 重原子取代，即卤素取代，芳烃取代上卤素之后， 其化合物的荧光随卤素原子量增加而减弱，而磷光 则相应地增强。
度随反应时间增加而迅速下降
(如图)，定量以峰值(或总的发
光强度)与被分析物的浓度成线
性关系。
时间
2. 化学发光反应类型 (1) 气相化学发光 气相化学发光反应主要有O3、NO
和S的化学发光反应。可以用于监测空气中的O3、 NO、NO2、H2S、SO2 和CO等。 (2) 液相化学发光 用于液相化学发光的物质有鲁米诺 (Lominol)、光泽精、洛粉碱、没食子酸、过氧化草 酸盐、硅氧烯和芳香游离基离子等。
仪器分析分子发光分析法讲课文档
• 自熄灭——荧光物质发射的荧光被荧光物 质的基态分子所吸收，即自吸收现象
第三十五页，共57页。
五、荧光和磷光分析仪器
（一）荧光分析仪器
——主要由光源、单色器、样品池、 检测器和显示器组成。
第三十六页，共57页。
I0
I
光源
第一单色器
液池
检测器
ex
第二单色器
与分光光度计有两点不同
em
①两个单色器
团 • 由于基团的 n 电子（孤对电子）的电子云与
苯环上的 轨道平行，共享了共轭 电子， 扩大了共轭体系，使荧光波长长移，荧光强 度增强
第二十五页，共57页。
（2）减弱荧光的取代基
-COOH 、 -NO2 、-COOR 、-NO、-SH 吸电子基 团, 使荧光波长短移，荧光强度减弱 • 芳环上被F、Cl、Br、I 取代后，使系间窜跃加强， 磷光增强，荧光减弱。磷光相应增强，这种效应为 重原子效应。
2. 无辐射去激
外部转移—激发态分子与溶剂分子或溶质分子的 相互作用产生能量转移，荧光或磷光减弱或消失 • 振动驰豫(VR)—同一电子能级中，从较高振动能 级到较低振动能级的过程 • 内部转换(IC)—相同的多重态之间的转换 S-S • 系间窜跃(ISC)—不同的多重态之间的转换S-T 发生系间窜跃电子需转向，S1—T1间进行，比内 部转换困难
第八页，共57页。
VR S2
IC
VR
S1
VR：振动驰豫 IC：内部转换 ISC：系间窜跃
ISC T1
S0
S0
吸光 吸光
第九页，共57页。
3.辐射去激—荧光和磷光产生
• S1或T1 发光 S0 这种过程叫辐射去激
(1) 荧光：
第三十五页，共57页。
五、荧光和磷光分析仪器
（一）荧光分析仪器
——主要由光源、单色器、样品池、 检测器和显示器组成。
第三十六页，共57页。
I0
I
光源
第一单色器
液池
检测器
ex
第二单色器
与分光光度计有两点不同
em
①两个单色器
团 • 由于基团的 n 电子（孤对电子）的电子云与
苯环上的 轨道平行，共享了共轭 电子， 扩大了共轭体系，使荧光波长长移，荧光强 度增强
第二十五页，共57页。
（2）减弱荧光的取代基
-COOH 、 -NO2 、-COOR 、-NO、-SH 吸电子基 团, 使荧光波长短移，荧光强度减弱 • 芳环上被F、Cl、Br、I 取代后，使系间窜跃加强， 磷光增强，荧光减弱。磷光相应增强，这种效应为 重原子效应。
2. 无辐射去激
外部转移—激发态分子与溶剂分子或溶质分子的 相互作用产生能量转移，荧光或磷光减弱或消失 • 振动驰豫(VR)—同一电子能级中，从较高振动能 级到较低振动能级的过程 • 内部转换(IC)—相同的多重态之间的转换 S-S • 系间窜跃(ISC)—不同的多重态之间的转换S-T 发生系间窜跃电子需转向，S1—T1间进行，比内 部转换困难
第八页，共57页。
VR S2
IC
VR
S1
VR：振动驰豫 IC：内部转换 ISC：系间窜跃
ISC T1
S0
S0
吸光 吸光
第九页，共57页。
3.辐射去激—荧光和磷光产生
• S1或T1 发光 S0 这种过程叫辐射去激
(1) 荧光：
分子发光光谱法
由于物理主义的进步，人们发现分子发光光谱的重要性，它的应用也
越来越普遍。
分子发光光谱是一种用来测量分子光学性质的技术。
它
通过测量发光分子的光谱图，可以获得更多完整且准确的信息，而这
些信息有助于揭示分子结构与性质的关系。
分子发光光谱是一种活性技术，它利用光谱来了解化学反应物的结构。
这项技术利用发出的光的频率和强度来分析分子，由于分子的结构它
们发出的光每个都有不同的频率和强度。
另外，分子发光光谱还能够
反映分子间的相互作用，从而在实验室中观察分子间的相互作用。
分子发光光谱法在科学研究中也得到广泛应用，它被用来研究分子的
结构、反应机理、生物活性及其过程，广泛应用于有机合成、药物研
究及生物化学等领域。
它已经成为结构和生物活性异质性测定的重要
手段，其应用范围也得到了显著的扩展。
例如，分子发光光谱被用来
研究有机和无机分子的生物活性和结构特征，以及有机分子間的相互
作用。
它还可以用来分析酶的结构和功能，从而帮助人们了解酶的作
用机制，还可以检测药物的生物学活性和结构。
未来，分子发光光谱将继续在科学研究中得到广泛应用，将在许多实
际领域，如医学、农业等方面发挥重要作用。
它将为人们提供更多关
于分子结构和性质的信息，从而有助于更深入地探索分子的特性和机制。
《分子发光光谱法》课件
分子对光的吸收具有选择性，激发光谱和发射光谱是荧光物 质的基本特征。
Δ 绘制激发光谱曲线时，固定测量波长为荧光（磷光）最大发
射波长 em，改变激发波长 ex，根据所测得荧光发射强度与
激发波长的关系，可绘制激发光谱曲线。
Δ 固定激发光波长为最大激发光波长 ex，测量不同的波长所
发射的荧光（磷光）强度时，使激发波长和强度保持不变，
二、化学发光分析仪器
⒈ 分立取样式仪器
放大器
数字 显示器
记录仪
高压 稳压电源
分立取样式化学发光仪器示意图
1－反应器 2－反应池 3－恒温水箱 4－贮液管 5－滤光片 6－光电倍增管
⒉ 流动注射式仪器
V
R
D
P
流动注射式化学发光仪器示意图
R-试剂载流 S-样品 P-蠕动泵 V-进样阀 D-检测器
第十四章 分子发光光谱法
Molecular Luminescence Analysis
本章要求
⒈ 掌握分子荧光和分子磷光的基本原理； ⒉ 了解荧光光谱仪的结构； ⒊ 了解化学发光分析法的原理及应用。
分子发光法研究高能态分子释放能量回到基态时所发生的 光辐射，包括：光致发光（分子荧光和分子磷光）、化 学发光、生物发光和电化学发光等 。
14.1 分子荧光光谱法
一、分子荧光的产生
分子吸收了电磁辐射后处于激发态，激发态分子经历一个 碰撞及发射的去激发过程。
1. 分子能级与跃迁
分子能级比原子能级复杂； 每个电子能级上，都存在振动、 转动能级；基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)；
激发态→基态：多种途径和方式， 速度最快、激发态寿命 最短的途径占优势。
⑴ 光源：高压汞灯和氙弧灯（最广泛的光源，可发射 200~800 nm）。
Δ 绘制激发光谱曲线时，固定测量波长为荧光（磷光）最大发
射波长 em，改变激发波长 ex，根据所测得荧光发射强度与
激发波长的关系，可绘制激发光谱曲线。
Δ 固定激发光波长为最大激发光波长 ex，测量不同的波长所
发射的荧光（磷光）强度时，使激发波长和强度保持不变，
二、化学发光分析仪器
⒈ 分立取样式仪器
放大器
数字 显示器
记录仪
高压 稳压电源
分立取样式化学发光仪器示意图
1－反应器 2－反应池 3－恒温水箱 4－贮液管 5－滤光片 6－光电倍增管
⒉ 流动注射式仪器
V
R
D
P
流动注射式化学发光仪器示意图
R-试剂载流 S-样品 P-蠕动泵 V-进样阀 D-检测器
第十四章 分子发光光谱法
Molecular Luminescence Analysis
本章要求
⒈ 掌握分子荧光和分子磷光的基本原理； ⒉ 了解荧光光谱仪的结构； ⒊ 了解化学发光分析法的原理及应用。
分子发光法研究高能态分子释放能量回到基态时所发生的 光辐射，包括：光致发光（分子荧光和分子磷光）、化 学发光、生物发光和电化学发光等 。
14.1 分子荧光光谱法
一、分子荧光的产生
分子吸收了电磁辐射后处于激发态，激发态分子经历一个 碰撞及发射的去激发过程。
1. 分子能级与跃迁
分子能级比原子能级复杂； 每个电子能级上，都存在振动、 转动能级；基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)；
激发态→基态：多种途径和方式， 速度最快、激发态寿命 最短的途径占优势。
⑴ 光源：高压汞灯和氙弧灯（最广泛的光源，可发射 200~800 nm）。
《仪器分析实验》分子荧光分析法
标示量 的百分数
西北大学基础化学实验
jkzq!0&G%A7MhAj3XCnPBAigZ1iUUR7CjPlKDa+ kbJ9fv3(tCBZ% hT mEM k3b!L)YX9hQ*izToSTQ!Wo*alD75dez+Bdml xHtp7*rJEciGl01S%j0dXj xs6WxxD0C W wW%cO)H C5q%FZG2q-YcX)4afp2%(R dD$)YA%lA1#Mfvdn( 13JQqKdRIV8io3#VpNVNr w5QD v0J7ir3N d$oj vjr 1x&UKa))-uQUN7I#LsTgij WIo9wyYQpJSVECg4bTN4+ b3 v36GYph9+ ef9OBPTGSG7JOUU F kbYPHh2XgI*OC64%)rQQuOIlqpf$6Etc x5wMAx-DQ6&b+6TACIMBfKNY7i %bm8) xjfyDObYnQ)Z aPffM HEKvkqSUsH hEqPOvYJLw5*Loc4T Ih1x7eiaApMW5%9%fqKuDoL&)(LgWObFPVQ8HT GGN w&3F Wd*a9R2$KEi*euIQ*Z+z hf#43jnPxyRR rAUI$30wA&SfLdFLbQ-UK8$9g$NLe-BGH58bXo1yXOk-ek)BU A*9pN uTNRH tFoV0qKlM!lkrfgh+dQaFtSU 3&r* m-7fv!GKoU9Ls E53b6Q* xW*q-2gxdD vLtqqWPF+r SIT$%T f1zGla63m-2o5MB$xAOpdWrZ!59Z8GDz zZhAlFq+h&ILCMu2zXYPmf!8+IYXVaTbrI9TE
西北大学基础化学实验
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仪器分析课件 荧光一
φf=0.75
1-二甲胺基-8磺酸盐 φf=0.03
H C=C H
H C=C
H
反式二苯乙烯 有强荧光
顺式二苯乙烯 无强荧光
4.取代基
（1）对共轭体系作用大的给电子基 团，增加共轭效应，使荧光效率增 强，荧光波长长移。 例：-OH，-OR，-NH2，-CN，-NR2等 饱和杂原子基团。
（2）对共轭体系作用大的吸电子基 团，减弱 π 电子共轭性，使荧光 减弱甚至熄灭。
电子处于激发态是不稳定状态，返回基 态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等 方式失去能量；
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光
延迟荧光
磷光
系间跨越
内转移
外转移
振动弛预
• 振动弛豫：从同一电子能级的各较高振 动能级逐步返回到最低振动能级。
• 内部能量转换：两个电子能级之间的能
量转换。 • 外部能量转换：激发态分子与溶剂分子 或其它荣指分子相互作用及能量转移。 • 体系间跨越：指不同多线态间的无辐射 跃迁。
的关系曲线。 激发光谱曲线的最高处，处于激发态的 分子最多，荧光强度最大；
发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波
长), 化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射
光波长关系曲线(图中曲线II或III)。
激发光谱与发射光谱的关系
a.Stokes位移
激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发
射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消
V4 V3 V2 V1 V0
(e)体系间跨越
(b)
V4 V3 V2 V1 V0
T1
第一激 发 态 三线态
λ1
基 态S 0 (a)吸收
λ′
V4 V3 V2 V1
1-二甲胺基-8磺酸盐 φf=0.03
H C=C H
H C=C
H
反式二苯乙烯 有强荧光
顺式二苯乙烯 无强荧光
4.取代基
（1）对共轭体系作用大的给电子基 团，增加共轭效应，使荧光效率增 强，荧光波长长移。 例：-OH，-OR，-NH2，-CN，-NR2等 饱和杂原子基团。
（2）对共轭体系作用大的吸电子基 团，减弱 π 电子共轭性，使荧光 减弱甚至熄灭。
电子处于激发态是不稳定状态，返回基 态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等 方式失去能量；
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光
延迟荧光
磷光
系间跨越
内转移
外转移
振动弛预
• 振动弛豫：从同一电子能级的各较高振 动能级逐步返回到最低振动能级。
• 内部能量转换：两个电子能级之间的能
量转换。 • 外部能量转换：激发态分子与溶剂分子 或其它荣指分子相互作用及能量转移。 • 体系间跨越：指不同多线态间的无辐射 跃迁。
的关系曲线。 激发光谱曲线的最高处，处于激发态的 分子最多，荧光强度最大；
发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波
长), 化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射
光波长关系曲线(图中曲线II或III)。
激发光谱与发射光谱的关系
a.Stokes位移
激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发
射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消
V4 V3 V2 V1 V0
(e)体系间跨越
(b)
V4 V3 V2 V1 V0
T1
第一激 发 态 三线态
λ1
基 态S 0 (a)吸收
λ′
V4 V3 V2 V1
分子荧光光谱法
菲
线状环结构比非线状 结构的荧光波长长
• 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系， 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系， 多数能发生荧光 • 多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光 多环芳烃是重要的环境污染物， 法测定 • 3，4 - 苯并芘是强致癌物 ， 苯并芘是强致癌物
λ ex = 386 nm λem = 430 nm
（二）荧光与有机化合物结构的关系
物质只有吸收了紫外可见光，产生π 物质只有吸收了紫外可见光，产生π → π*，n → π* 跃迁， 跃迁，产生荧光 跃迁相比，摩尔吸收系数大10 π → π*与n → π*跃迁相比，摩尔吸收系数大102~103， 寿命短 跃迁常产生较强的荧光， π → π*跃迁常产生较强的荧光， n → π*跃迁产生的 荧光弱
1. 电子自旋状态的多重性
大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道 大多数分子含有偶数电子， 中两个电子自旋方向总是相反的↑↓ 中两个电子自旋方向总是相反的↑↓ ，处于基态单 重态。 当物质受光照射时， 重态。用 “S0” 表示 ；当物质受光照射时，基态 分子吸收光能产生电子能级跃迁， 分子吸收光能产生电子能级跃迁，由基态跃迁至 更高的单重态，电子自旋方向没有改变， 更高的单重态，电子自旋方向没有改变，净自旋 = 0 .这种跃迁是符合光谱选律的 第一激发单重态 S1
VR S2 IC VR S1 ISC
VR：振动驰豫 ： IC：内部转换 ： ISC：系间窜跃 ：
T1
S0 吸光 吸光
S0
3. 荧光光谱的产生—辐射去激 荧光光谱的产生—
处于S 处于S1或T1态的电子返回S0态时，伴随有发光现 态的电子返回S 态时， 象，这种过程叫辐射去激 发光 S0 S1或T1 荧光： （1）荧光： 当电子从第一激发单重态S 当电子从第一激发单重态S1的最低振动能级回到基 态S0各振动能级所产生的光辐射叫荧光 荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快， 荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快， 10-9~10-6s，又叫快速荧光或瞬时荧光，外部光源停 又叫快速荧光或瞬时荧光， 止照射， 止照射，荧光马上熄灭 无论开始电子被激发至什么高能级，它都经过无辐 无论开始电子被激发至什么高能级， 射去激消耗能量后到S 的最低振动能级，发射荧光， 射去激消耗能量后到S1的最低振动能级，发射荧光， 荧光波长比激发光波长长。 荧光波长比激发光波长长。 λ 荧>λ激
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分子发光光谱法
基本要求： 1. 理解分子荧光和分子磷光的基本原理 2. 理解分子荧光激发光谱、发射光谱、同步光谱
和三维荧光光谱的含义 3. 掌握分子荧光发射光谱的特性 4. 了解荧光光谱仪的组成和各部分作用 5. 掌握荧光分析法和磷光分析法的主要应用范围 6. 了解化学发光分析法的原理和应用
分子发光光谱法包括： 光致发光 ➢ 分子荧光 ➢ 分子磷光 化学发光 生物发光
振动驰豫－受激溶质分子向溶剂分子转移过剩 的能量，以10-13s~10-11s的极快速度
荧光发射－以10-9s~10-7s左右的短时间内发射光 量子回到基态的各振动能级
内部转换－激发能转化为热能。其速度取决于 此过程所包含的两个能态之间的相对能量差。 当两个电子能级非常靠近，以至其振动能级有 重叠时，内部转换十分容易发生。如两个单重 激发态或两个三重激发态的较低激发态的高振 动能级常常与较高激发态的低振动能级重叠， 重叠的地方两激发态能量一致，内部转换效率 很高，速率很快，一般只需要10-13s~10-11s的时 间。
这是由于荧光分子无论被激发到哪一个激发态，处于激 发态的分子经振动驰豫即内转换等过程最终回到第一激发态 的最低振动能级上，而分子荧光的发射总是从该能级跃迁到 基态的各振动能级上，因此其形状与激发波长无关。
反映在光谱图上就是具有一个吸收带和两个吸收带的不 同物质，一般都发射一个荧光谱带（个别例外）。
影响荧光强度的因素
荧光发射光谱－固定激发波长，扫描发射波长得到 的荧光强度－发射波长的关系曲线，反映了在某一 固定激发波长下，不同波长处分子的相对发射强度。 荧光光谱用于进行荧光测定时选发射单色器波长的 条件下，测绘光谱图，所得荧光强度-激发波长（或 发射波长）曲线为同步荧光光谱。
分子处于激发态时，某个电子可能会改变自旋方 向，即自旋平行，此时S＝1/2+1/2=1，分子处于这样 的激发态为三重态，以T表示。由于自旋平行比自旋 配对的状态更稳定，因此三重态能级比单重态略低。
根据光谱选律，分子直接被激发到三重态T1的概 率比较小，因为是S0－T1禁阻跃迁。
分子的去激发过程 速率最快，激发态寿命最短的途径占优势。
灵敏度较紫外-可见吸收光谱法高几个数量级。
1 荧光和磷光的基本机理
分子荧光与磷光的产生：
3
S2
2 1
0
内转换
2 S1 1
0
振动驰豫
系 间 跨 越
外转换
2 1 T2
0 4 3 2 T1 1 0
3 S0 2
1
0吸收 1
吸收 2 荧光 3
磷光 4
对于大多数有机物分子，其电子数为偶数，净自 旋之和为S＝0，即基态分子为单重态（M＝ 2S+1=1）。
① 固定波长同步扫描荧光法：= em -ex不变 ② 固定能量同步扫描荧光法：= (1/ex -1/em)不变 ③ 可变波长同步扫描荧光法：两个单色器以不同的速率扫描
④特点：光谱简化，谱带窄化，减小光谱重叠，减 小散射光的影响，选择性提高，但损失其他光谱带 含有的信息
并四苯的激 发光谱和发 射光谱（a）
磷光发射－经过系间跨越后到达激发三重态， 并经过迅速的振动驰豫到达第一激发三重态（T1） 的最低振动能级上，从T1态分子经发射光返回基 态称为磷光发射。磷光发射属于不同多重态之 间的跃迁（ T1 － S0 ），是“禁阻”跃迁，因此 磷光的寿命比荧光长得多，约为10-3s~10s。
由于分子结构和所处环境不同，各去激发过 程的速率不同。如荧光发射过程较其它过程快， 则可观察到荧光现象。
荧光的量子效率 发荧光的分子数与总的激发态分子数之比
发射的光子数
吸收的光子数
Kf
Kf Ki
Kf荧光发射过程速率常数，主要取决于分子结构；
∑Ki系间跨越、外转换等其他无辐射跃迁的速率常 数的总和，主要取决于环境。
荧光激发光谱和发射光谱
荧光激发光谱－固定发射波长，扫描激发波长得到 的荧光强度－激发波长的关系曲线，反映了在某一 固定发射波长下，不同激发波长激发的荧光的相对 效率。激发光谱用于进行荧光测定时选择恰当的激 发波长。
级结构，荧光光谱形状取决于基态中各振动能级的分布情况。 一般基态中振动能级与第一激发态振动能级分布是类似的， 因此荧光光谱的形状和吸收光谱极为相似。
苝的苯溶液的荧光光谱和吸收光谱
荧光光谱的特征
荧光发射光谱的形状与激发波长的选择无关：
荧光物质发射荧光的特性之一是不管引起物质分子激发 的波长是1还是2，荧光的波长都是3。
荧光光谱的特征
斯托克斯（Stokes）位移：在溶液中，荧光发射波长总
是比其相应的吸收（激发）光谱的波长长，该现象是1852年 由Stokes发现，因此称为Stokes位移。这种位移反映了荧光 激发与发射间产生的能量损失（来源于振动驰豫和溶剂的分 子的驰豫作用）。
镜像对称规则：吸收光谱形状表明了第一激发态的振动能
同步荧光光 谱 =3nm （b）
三维荧光光谱－20世纪80年代发展起来，以荧光强 度为激发波长和发射波长的函数得到的光谱图，也 称为总发光光谱，等高线光谱等。 ① 三维曲线光谱图 ② 平面显示的等强度线光谱图 ③特点：提高完整的光谱信息，可作为光谱指纹技 术用于环境检测和法庭试样的判证。
（a）蒽和萘的三维荧光光谱图 （b）8-羟基苯芘的等强度光谱图
外转换－激发态分子与溶剂和其它溶质分子之 间的相互作用即能量转换过程。它是荧光和磷 光的竞争过程，因此该过程使发光强度减弱甚 至消失，这种现象称为“淬灭”或“熄灭”。
体系间跨越跃迁－受激分子从激发单重态转至 能量较低的激发三重态。这一过程中分子的电 子自旋倒转，多重性发生变化。与内部转换一 样，如果两能态的振动能级重叠，这种跃迁的 概率增大。
分子结构
跃迁类型：*→量子效率高，因为跃迁摩尔吸光系数 大 100-1000 倍 ， 跃 迁 寿 命 短 （ 10-7~10-9s ） ， n→* （ 107~10-9s），其次，系间跨越速率常数小
共轭效应：稠环化合物一般发强荧光
取 代 基 效 应 ： 给 电 子 基 团 （ -NH2, -OH, -OCH3, NHCH3, -N(CH3)2等）荧光增强，吸电子基团（-Cl, -Br, I, -NHCOCH3, -NO2, -COOH等）荧光减弱 结构刚性效应：平面刚性结构有利于荧光发射, 荧光物 质吸附于固体表面可荧光增强
基本要求： 1. 理解分子荧光和分子磷光的基本原理 2. 理解分子荧光激发光谱、发射光谱、同步光谱
和三维荧光光谱的含义 3. 掌握分子荧光发射光谱的特性 4. 了解荧光光谱仪的组成和各部分作用 5. 掌握荧光分析法和磷光分析法的主要应用范围 6. 了解化学发光分析法的原理和应用
分子发光光谱法包括： 光致发光 ➢ 分子荧光 ➢ 分子磷光 化学发光 生物发光
振动驰豫－受激溶质分子向溶剂分子转移过剩 的能量，以10-13s~10-11s的极快速度
荧光发射－以10-9s~10-7s左右的短时间内发射光 量子回到基态的各振动能级
内部转换－激发能转化为热能。其速度取决于 此过程所包含的两个能态之间的相对能量差。 当两个电子能级非常靠近，以至其振动能级有 重叠时，内部转换十分容易发生。如两个单重 激发态或两个三重激发态的较低激发态的高振 动能级常常与较高激发态的低振动能级重叠， 重叠的地方两激发态能量一致，内部转换效率 很高，速率很快，一般只需要10-13s~10-11s的时 间。
这是由于荧光分子无论被激发到哪一个激发态，处于激 发态的分子经振动驰豫即内转换等过程最终回到第一激发态 的最低振动能级上，而分子荧光的发射总是从该能级跃迁到 基态的各振动能级上，因此其形状与激发波长无关。
反映在光谱图上就是具有一个吸收带和两个吸收带的不 同物质，一般都发射一个荧光谱带（个别例外）。
影响荧光强度的因素
荧光发射光谱－固定激发波长，扫描发射波长得到 的荧光强度－发射波长的关系曲线，反映了在某一 固定激发波长下，不同波长处分子的相对发射强度。 荧光光谱用于进行荧光测定时选发射单色器波长的 条件下，测绘光谱图，所得荧光强度-激发波长（或 发射波长）曲线为同步荧光光谱。
分子处于激发态时，某个电子可能会改变自旋方 向，即自旋平行，此时S＝1/2+1/2=1，分子处于这样 的激发态为三重态，以T表示。由于自旋平行比自旋 配对的状态更稳定，因此三重态能级比单重态略低。
根据光谱选律，分子直接被激发到三重态T1的概 率比较小，因为是S0－T1禁阻跃迁。
分子的去激发过程 速率最快，激发态寿命最短的途径占优势。
灵敏度较紫外-可见吸收光谱法高几个数量级。
1 荧光和磷光的基本机理
分子荧光与磷光的产生：
3
S2
2 1
0
内转换
2 S1 1
0
振动驰豫
系 间 跨 越
外转换
2 1 T2
0 4 3 2 T1 1 0
3 S0 2
1
0吸收 1
吸收 2 荧光 3
磷光 4
对于大多数有机物分子，其电子数为偶数，净自 旋之和为S＝0，即基态分子为单重态（M＝ 2S+1=1）。
① 固定波长同步扫描荧光法：= em -ex不变 ② 固定能量同步扫描荧光法：= (1/ex -1/em)不变 ③ 可变波长同步扫描荧光法：两个单色器以不同的速率扫描
④特点：光谱简化，谱带窄化，减小光谱重叠，减 小散射光的影响，选择性提高，但损失其他光谱带 含有的信息
并四苯的激 发光谱和发 射光谱（a）
磷光发射－经过系间跨越后到达激发三重态， 并经过迅速的振动驰豫到达第一激发三重态（T1） 的最低振动能级上，从T1态分子经发射光返回基 态称为磷光发射。磷光发射属于不同多重态之 间的跃迁（ T1 － S0 ），是“禁阻”跃迁，因此 磷光的寿命比荧光长得多，约为10-3s~10s。
由于分子结构和所处环境不同，各去激发过 程的速率不同。如荧光发射过程较其它过程快， 则可观察到荧光现象。
荧光的量子效率 发荧光的分子数与总的激发态分子数之比
发射的光子数
吸收的光子数
Kf
Kf Ki
Kf荧光发射过程速率常数，主要取决于分子结构；
∑Ki系间跨越、外转换等其他无辐射跃迁的速率常 数的总和，主要取决于环境。
荧光激发光谱和发射光谱
荧光激发光谱－固定发射波长，扫描激发波长得到 的荧光强度－激发波长的关系曲线，反映了在某一 固定发射波长下，不同激发波长激发的荧光的相对 效率。激发光谱用于进行荧光测定时选择恰当的激 发波长。
级结构，荧光光谱形状取决于基态中各振动能级的分布情况。 一般基态中振动能级与第一激发态振动能级分布是类似的， 因此荧光光谱的形状和吸收光谱极为相似。
苝的苯溶液的荧光光谱和吸收光谱
荧光光谱的特征
荧光发射光谱的形状与激发波长的选择无关：
荧光物质发射荧光的特性之一是不管引起物质分子激发 的波长是1还是2，荧光的波长都是3。
荧光光谱的特征
斯托克斯（Stokes）位移：在溶液中，荧光发射波长总
是比其相应的吸收（激发）光谱的波长长，该现象是1852年 由Stokes发现，因此称为Stokes位移。这种位移反映了荧光 激发与发射间产生的能量损失（来源于振动驰豫和溶剂的分 子的驰豫作用）。
镜像对称规则：吸收光谱形状表明了第一激发态的振动能
同步荧光光 谱 =3nm （b）
三维荧光光谱－20世纪80年代发展起来，以荧光强 度为激发波长和发射波长的函数得到的光谱图，也 称为总发光光谱，等高线光谱等。 ① 三维曲线光谱图 ② 平面显示的等强度线光谱图 ③特点：提高完整的光谱信息，可作为光谱指纹技 术用于环境检测和法庭试样的判证。
（a）蒽和萘的三维荧光光谱图 （b）8-羟基苯芘的等强度光谱图
外转换－激发态分子与溶剂和其它溶质分子之 间的相互作用即能量转换过程。它是荧光和磷 光的竞争过程，因此该过程使发光强度减弱甚 至消失，这种现象称为“淬灭”或“熄灭”。
体系间跨越跃迁－受激分子从激发单重态转至 能量较低的激发三重态。这一过程中分子的电 子自旋倒转，多重性发生变化。与内部转换一 样，如果两能态的振动能级重叠，这种跃迁的 概率增大。
分子结构
跃迁类型：*→量子效率高，因为跃迁摩尔吸光系数 大 100-1000 倍 ， 跃 迁 寿 命 短 （ 10-7~10-9s ） ， n→* （ 107~10-9s），其次，系间跨越速率常数小
共轭效应：稠环化合物一般发强荧光
取 代 基 效 应 ： 给 电 子 基 团 （ -NH2, -OH, -OCH3, NHCH3, -N(CH3)2等）荧光增强，吸电子基团（-Cl, -Br, I, -NHCOCH3, -NO2, -COOH等）荧光减弱 结构刚性效应：平面刚性结构有利于荧光发射, 荧光物 质吸附于固体表面可荧光增强