野生稻OrufipogonW19431888条全长cDNA序列的数据分析
野生稻O. rufipogon W1943 1888条全长cDNA序列的数据分析.ppt
2个exon合并成单exon
2019年8月23
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8
41 putative tissue-specific genes10/rice/
四、组织特异性高表达基因
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2019年8月23
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ESTs or mRNA hits CT859459 AK099287 CT856885
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protein
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dual-specificity phosphatase protein
野生稻DNA导入栽培品种获得变异后代的抗病性分析
病性 上 变异都 优 于受 体 ， 富 了宁 夏 水 稻 抗 性 遗 传 丰 资源 ， 建 了新材 料 、 创 新方 法 、 技术 。 新
的作 物变 异种质 。由于 该技 术克 服 了远缘 杂交 中的 生殖 隔离 ， 因而在 利 用 远 缘 种 质 拓 展 栽 培作 物 遗传
Ｌ ｕ Ｌ ｈ ． ｕ ＨＡ ｕ ． ｎ ， ｉｇ ｉＨ ａ ， ＩＳ ｕ ｈ ａ ， Ｎ Ｇ ｏｍｉ ＭＡ Ｊｎ （ ． ｉ ｘ ｃｄｍ ｆ ｇ ｃｌ ｒ Ｓ ｉ ｃｓＹ ｎｈ ａ ７ ０ ， ｈｎ ； １ Ｎｎ ｉ Ａ ａ ｅ ｙｏ Ａ ｒ ｕ ｕｅ ｃ ｎｅ， ｉ ｕ ｎ ５ １ ５ Ｃ ｉａ ｇａ ｉ ｔ ｅ ｃ ０ ２ Ｂｏ ｃｎｌｇ ｅｔ ， ｉｇｉ Ａ ａｅ ｙｏ ｇ ｃｌ ｒ， ｉｃｕｎ ７ ０ ０ ， ｈ ａ ． ｉ ｅｈ ｏ ｙＣ ｎｅ Ｎｎｘ ｃｄ ｍ ｆ ｒ ｕｔ ｅＹ ｎｈ ａ ５０ ２ Ｃ ｉ ） ｔ ｏ ｒ ａ Ａｉ ｕ ｎ
基础方 面 具有重 要 作用 。本 研究 利用 花 粉管通 道 技 术将野 生 稻 基 因组 总 Ｄ Ａ导入 栽 培 稻 宁粳 ２ Ｎ ３号 、
１ 材料 Ｄ Ａ供 体为 野生 稻 ， Ｎ 由宁夏 农 科 院生 物 中心 提
取 。受 体为 宁夏农 科 院农 作 物 所水 稻室 提供 的栽培 稻 宁粳 ２ 号 、 粳 １ ３ 宁 ６号 。材 料 均 通 过 自交 繁 殖 保
李 华 李树 华 韩 国敏 马 静 ， ， ，
（ ． 夏农 业 科 学 院 农 作 物 研 究 所 ， １宁 宁夏 银 川 ７００ ，． ５１５２ 宁夏 大 学 ， 夏 银 川 宁 ７０２ ， 宁夏 农 业 科 学 院 生物 中 心 ， 夏 银 川 ５０ １３． 宁 ７００ ） ５０２
海南普通野生稻（Oryza rufipogon Griff.）Adh2基因多态性分析
作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2009, 35(11): 2122−2126/zwxb/ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@本研究由国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2007CB109202)和转基因生物新品种培育重大专项课题(2008ZX08011-001)资助。
*通讯作者(Corresponding author): 彭于发, E-mail: yfpeng@; Tel: 010-********Received(收稿日期): 2009-03-31; Accepted(接受日期): 2009-06-25.DOI: 10.3724/SP.J.1006.2009.02122海南普通野生稻(Oryza rufipogon Griff.) Adh2基因多态性分析董轶博1 裴新梧2 袁潜华3 彭于发1,*1中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室, 北京 100094; 2中国农业科学院生物技术研究所, 北京 100081; 3海南大学生命科学与农学院热带生物资源教育部重点实验室, 海南海口 570228摘 要: 海南岛的4个保护区和2个非保护区内普通野生稻与2种栽培稻(Nipponbare, 9311)的Adh2基因序列在编码区共有单现突变 9个, 信息位点4个, 同义突变8个, 替代突变5个。
内含子内有单现突变21个, 信息位点29个, 插入/缺失位点161个。
Adh2基因在整个区域的多态性(πR , θR )均为0.011, 内含子区域的多态性明显高于编码区域。
在编码区域, 同义位点多态性明显高于替代位点。
中性测试表明虽然Adh2各区域的净化选择在统计上不具有显著性, 但编码区的净化选择作用明显大于内含子区域。
聚类分析表明海南普通野生稻可以划分为2大类, 其中一类(QH, LD)与中国大陆普通野生稻和栽培稻更接近, 另一类(WC, WA, WN, DZ)则更接近东南亚普通野生稻。
东乡普通野生稻（OryzarufipogonGriff）原位保存群体的遗传分化和保护策略研究
中国农业科学 2007,40(6):1085-1093Scientia Agricultura Sinica东乡普通野生稻(Oryza rufipogon Griff.)原位保存群体的遗传分化和保护策略研究杨庆文1，余丽琴2，张万霞1 ，时津霞1，任军方1，苗 晗1（1中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081；2江西省农业科学院水稻研究所，南昌 330200）摘要：【目的】东乡野生稻是世界上分布最北的普通野生稻居群，研究其遗传分化不仅能够阐明居群的起源、演化规律，而且可为其保护提供理论依据。
【方法】利用SSR（简单序列重复）分子标记对江西东乡普通野生稻仅存的2个原位保护居群进行了30个位点的遗传多样性分析和遗传分化研究。
【结果】东乡野生稻2个居群内和居群间的遗传多样性指数分别为0.4120和0.0564，居群间遗传分化系数仅为0.1219，即87%以上的遗传变异存在于居群内。
POPGENE聚类分析结果也显示，东乡野生稻的2个居群实际属于一个大群体，水桃树居群可看作庵家山居群的一个分支。
利用同样方法对庵家山居群人为隔离的3个小群体进行的研究结果表明，虽然3个小群体间遗传分化系数也很低（0.0975），仍然属于同一居群，但人工隔离引起的小生境变化已使得3个群体发生了遗传分化。
【结论】在建立东乡野生稻原生境保护点时，一方面，应以有效保护庵家山居群为重点，另一方面，对庵家山居群的保护应充分考虑原居群的生态环境，拆除原有围墙，进行生态恢复。
关键词：普通野生稻；SSR；遗传多样性；原生境保护The Genetic Differentiation of Dongxiang Wild Rice (Oryza rufipogon Griff.) and Its Implications for In-Situ Conservation YANG Qing-wen1, YU Li-qin2, ZHANG Wan-xia1, SHI Jin-xia1, REN Jun-fang, MIAO Han1(1Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081; 2 Institute of Rice Research, Jiangxi Academyof Agricultural Sciences, Nanchang 330200)Abstract: 【Objective】Dongxiang wild rice (Oryza rufipogon Griff.) distributes at 28°14′N in Dongxiang County, Jiangxi Province, where is recognized to be the northernmost habitats for O. rufipogon populations in China, as well as in the World. Studies on the genetic differentiation could not only reveal the principle of origination and evolution of the populations, but also provide theoretical evidence of their conservation. 【Method】To analyze the genetic differentiation of the populations, 30 pairs of SSR primers were used to amplify the selected samples and POPGENE ver1.31 statistic software was applied to cluster the SSR data,. 【Result】The results indicated that the genetic diversity indices within and between populations were 0.4120 (H S) and 0.0564 (D ST) respectively, and the coefficient of genetic differentiation (G ST) was 0.1219, meaning that the genetic variability between populations was low. The cluster analysis also showed that Shuitaoshu population is one branch of Anjiashan population, inferring that the two natural populations were once from a large population. For Anjiashan population, three sub-populations were formed because of the construction of the in-situ facilities (brick walls) in 1985. The same methods were also applied to analyze the genetic diversity of the sub-populations in Anjiashan population. The results showed that the coefficient of genetic differentiation (G ST) was only 0.0975, the sub-populations still belonged to the same population but gene differentiation actually happened. Though the brick walls have played significant roles for the conservation of wild rice in Dongxiang, it caused the genetic differentiation among three sub-populations. 【Conclusion】Two aspects should be considered during designing in-situ conservation strategies for Dongxiang wild rice: (i) Anjiashan population should be effectively conserved first, and (ii) the brick wall built in 1985 should be removed and the original收稿日期：2006-05-09；接受日期：2006-09-05基金项目：国家财政专项“农业野生植物保护与可持续利用”资助作者简介：杨庆文（1964-），男，湖北广水人，研究员，博士，研究方向为野生稻的保护生物学。
稻瘟病菌发育cDNA文库构建与表达序列标签分析pdf
农业生物技术学报ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２００６，１４（６）：９６３￣９６９・研究论文・稻瘟病菌发育ｃＤＮＡ文库构建与表达序列标签分析*金庆超１，董海涛１＊＊，彭友良２，陈保善３，邓晔１，戴承恩１，方永启１，邵菁１，娄沂春１，李有志３，李德葆１＊＊（１．浙江大学农业与生物技术学院生物技术研究所，杭州３１００２９；２．中国农业大学农业部分子植物病理学重点实验室，北京１０００９４；３．广西大学亚热带生物资源保护和利用实验室，南宁５３０００４）摘要：利用稻瘟病菌（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅｇｒｉｅｓａ）连续６个发育时期的材料构建了一个混合ｃＤＮＡ文库。
文库滴度，重组率和插入片段长度等质量分析表明，构建的文库包含完整的稻瘟病菌基因，可用于病菌基因表达分析。
利用该文库获得了７４５６条５′端表达序列标签（ＥＳＴｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ收录号：（ＣＫ９０９９４４￣ＣＫ９１３６６６和ＣＫ９２８５８３￣ＣＫ９３２５８２），生物信息分析表明：ＥＳＴ序列拼接出２９７５个假定独立转录本（ＴＵＴｓ），冗余度为６０．１％；从ｃＤＮＡ文库中筛选出大量的低丰度表达基因，约占ＴＵＴ总数的７９．８％，说明在文库中基因组成类型的复杂性较高；在所有ＴＵＴｓ中，功能未知基因约占８５．５％，编码ＥＣＭ３３蛋白和疏水蛋白等病菌致病相关的注释基因高丰度表达，进一步表明该ｃＤＮＡ文库反映了病菌侵染和发育过程中基因表达的状况。
关键词：稻瘟病菌；ｃＤＮＡ文库；表达序列标签中图分类号：Ｓ１８８文献标识码：Ａ文章编号：１００６－１３０４（２００６）０６－０９６３－０７ＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅｇｒｉｓｅｓａＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｃＤＮＡＬｉｂｒａｒｙＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｅｄＳｅｑｕｅｎｃｅＴａｇｓＡｎａｌｙｓｉｓ＊ＪＩＮＱｉｎｇ－ｃｈａｏ１，ＤＯＮＧＨａｉ－ｔａｏ１＊＊，ＰＥＮＧＹｏｕ－ｌｉａｎｇ２，ＣＨＥＮＢａｏ－ｓｈａｎ３，ＤＥＮＧＹｅ１，ＤＡＩＣｈｅｎｇ－ｅｎ１，ＦＡＮＧＹｏｎｇ－ｑｉ１，ＳＨＡＯＪｉｎｇ１，ＬＯＵＹｉ－ｃｈｕｎ１，ＬＩＹｏｕ－ｚｈｉ３，ＬＩＤｅ－ｂａｏ１＊＊（１．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＺｈｅｊｉａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ３１００２９，Ｃｈｉｎａ；２．ＴｈｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌｏｇｙ，ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，ＣｈｉｎａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００９４，Ｃｈｉｎａ；３．ＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＳｕｂｔｒｏｐｉｃａｌＢｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅＣｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎａｎｄＵｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，ＧｕａｎｇｘｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｎｉｎｇ５３０００４，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎｍｏｄｅｌｏｆｍｅｃｈａｎｉｃａｌｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎｏｆｐｌａｎｔｓｕｒｆａｃｅｓｂｙＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅｇｒｉｓｅａｈａｓｂｅｃｏｍｅａｆｏｃｕｓｏｆｍｏｌｅｃｕ－ｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｔｈｅｆｕｎｇａｌｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｏｖｅｒａｌｌａｎａｌｙｚｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｄｕｒｉｎｇｉｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ａｍｉｘｅｄｃＤ－ＮＡｌｉｂｒａｒｙｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｗｉｔｈｍａｔｅｒｉａｌｓｆｒｏｍｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓｓｉｘｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｔａｇｅｓｏｆＭ．ｇｒｉｓｅａ．Ｓｏｍｅｑｕａｌｉｔｙａｎａｌｙｓｉｓ，ｓｕｃｈａｓｔｈｅｔｉｔｅｒ，ｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｒａｔｅａｎｄｉｎｓｅｒｔｃＤＮＡｌｅｎｇｔｈｏｆｔｈｅｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｙ，ｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｌｉｂｒａｒｙｃｏｎｔａｉｎｅｄｉｎｔａｃｔｇｅｎｅｓａｎｄｃｏｕｌｄｂｅｕｓｅｄｆｏｒｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆＭ．ｇｒｉｓｅａ．Ｔｏｔａｌ７４５６ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇｓ（ＥＳＴｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ（ＣＫ９０９９４４￣ＣＫ９１３６６６ａｎｄＣＫ９２８５８３￣ＣＫ９３２５８２）ｏｆ５′ｅｎｄｓｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍｔｈｅｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｙ．ＲｅｓｕｌｔｓｏｆｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓｆｏｒａｌｌＥＳＴｓｄａｔａｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＥＳＴｓｅｑｕｅｎｃｅｓａｓｓｅｍｂｌｅｄｏｕｔ２９７５ｔｅｎｔａｔｉｖｅｕｎｉｑｕｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ（ＴＵＴｓ）ａｎｄｅｎｄｕｅｄ６０．１％ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ；ｍｏｓｔｇｅｎｅｓｅｘ－ｐｒｅｓｓｅｄｗｉｔｈｌｏｗａｂｕｎｄａｎｃｅｇｅｎｅｒａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｙａｎｄｏｃｃｕｐｉｅｄ７９．８％ｏｆａｌｌＴＵＴｓ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈｅｌｉｂｒａｒｙｈａｄａｇｏｏｄｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙｏｆｇｅｎｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ；ａｂｏｕｔ８５．５％ＴＵＴｓｃｏｕｌｄｎｏｔｂｅａｓｓｉｇｎｅｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｎｄｉｎｆｅｃｔｉｏｎｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓ，ｓｕｃｈａｓＥＣＭ３３ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｎｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｔｈｉｇｈａｂｕｎｄａｎｃｅｌｅｖｅｌａｍｏｎｇｔｈｅｒｅｍａｉｎｅｄａｎｎｏｔａｔｅｄｇｅｎｅｓ，ｆｕｒｔｈｅｒｌｙｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｙｒｅｆｌｅｃｔｅｄｃｏｒｒｅｃｔｌｙｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｄｕｒｉｎｇＭ．ｇｒｉｓｅａｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．ＳｏｔｈｅｍｉｘｅｄｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｙｐｒｏｖｉｄｅｓａｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅｒｅ－ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｓｔｕｄｙｏｆｔｈｅｆｕｎｇｕｓａｎｄｉｓｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｙｆｏｒｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｉｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＭ．ｇｒｉｓｅａ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅｇｒｉｓｅａ；ｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｙ；ｅｘｐｒｅｓｓｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅｔａｇｓ＊基金项目：国家高技术研究与发展计划（８６３）项目（Ｎｏ．２００２ＢＡ７１１Ａ１５）资助。
普通野生稻叶绿体dna的多态性
［收稿日期］ ２０１４ ０３ １２；２０１４ ０８ １４修回 ［基金项目］ 湖南省重点学科建设项目资助 ［作者简介］ 肖辉海（１９６２－），男，教授，博士，从事植物发育生物学研究。
Ｅ ｍａｉｌ：ｘｈｈ ０７＠１２６．ｃｏｍ［文章编号］１００１ ３６０１（２０１４）０９ ０５１５ ００３５ ０５普通野生稻叶绿体ＤＮＡ的多态性肖辉海１，欧立军２（１．湖南文理学院生命科学系，湖南常德４１５０００；２．怀化学院生命科学系，湖南怀化４１８００８） ［摘 要］为水稻亚种间杂交育种优势的利用引入普通野生稻基因提供分子依据，从序列水平上比较不同经纬度普通野生稻叶绿体ＤＮＡ的多态性，运用ＰＣＲ法对１６个普通野生稻的叶绿体部分序列扩增后纯化产物测序，用软件ＭＥＧＡ３．１分析测序结果。
结果表明，普通野生稻叶绿体ＤＮＡ多态性比典型籼、粳稻丰富；分布于低纬度（１８°～２２°Ｎ）的崖县、乐东、东方、昌江、合浦、公馆和高州的普通野生稻和较高纬度（＞２８°Ｎ）的东乡野生稻的叶绿体偏籼，而中纬度（２２°～２７°Ｎ）的扶绥、增城、田阳、柳江、桂林、江永、安仁和茶陵普通野生稻以粳型叶绿体为主。
结论：普通野生稻的分型分布主要与纬度相关，与经度关系不大；同时从叶绿体水平证明了普通野生稻出现了籼粳分化趋势，普通野生稻在驯化过程中出现了基因丢失现象。
［关键词］普通野生稻；叶绿体ＤＮＡ；多态性；纬度［中图分类号］Ｓ５１１［文献标识码］ＡＣｈｌｏｒｏｐｌａｓｔＤＮＡＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｏｆＣｏｍｍｏｎＷｉｌｄＲｉｃｅＸＩＡＯＨｕｉｈａｉ，ＯＵＬｉｊｕｎ（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＨｕｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＡｒｔｓａｎｄＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｈａｎｇｄｅ，Ｈｕｎａｎ４１５０００；２．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＨｕａｉｈｕａＣｏｌｌｅｇｅ，Ｈｕａｉｈｕａ，Ｈｕｎａｎ４１８００８，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔＤＮＡｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｏｆ１６ｃｏｍｍｏｎｗｉｌｄｒｉｃｅｖａｒｉｅｔｉｅｓｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｏｎｇｉｔｕｄｅａｎｄｌａｔｉｔｕｄｅｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙＰＣＲａｎｄＭＥＧＡ３．１ｓｏｆｔｗａｒｅｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｌｅｖｅｌｔｏｐｒｏｖｉｄｅｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｂａｓｉｓｆｏｒｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｃｏｍｍｏｎｗｉｌｄｒｉｃｅｇｅｎｅｓｉｎｈｅｔｅｒｏｓｉｓｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｒｉｃｅｓｕｂｓｐｅｃｉｅｓ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔＤＮＡｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｏｆｃｏｍｍｏｎｗｉｌｄｒｉｃｅｉｓｍｏｒｅａｂｕｎｄａｎｔｔｈａｎｔｙｐｉｃａｌｉｎｄｉｃａｒｉｃｅａｎｄＪａｐｏｎｉｃａｒｉｃｅ，ａｎｄｔｈｅｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆｃｏｍｍｏｎｗｉｌｄｒｉｃｅｆｒｏｍＹａｘｉａｎ，Ｌｅｄｏｎｇ，Ｄｏｎｇｆａｎｇ，Ｃｈａｎｇｊｉａｎｇ，Ｈｅｐｕ，ＧｏｎｇｇｕａｎａｎｄＧａｏｚｈｏｕｗｉｔｈ１８°～２２°ＮａｎｄＤｏｎｇｘｉａｎｇｗｉｔｈ＞２８°ＮｉｓｓｉｍｉｌａｒｔｏｉｎｄｉｃａｒｉｃｅｂｕｔｔｈｅｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆｃｏｍｍｏｎｗｉｌｄｒｉｃｅｆｒｏｍＦｕｓｕｉ，Ｚｅｎｇｃｈｅｎｇ，Ｔｉａｎｙａｎｇ，Ｌｉｕｊｉａｎｇ，Ｇｕｉｌｉｎ，Ｊｉａｎｇｓｈｕｉ，ＡｎｒｅｎａｎｄＣｈａｌｉｎｇｗｉｔｈ２２°～２７°Ｎｂｅｌｏｎｇｓｔｏｊａｐｏｎｉｃａｒｉｃｅ．Ｉｎｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ，ｔｈｅｔｙｐｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｃｏｍｍｏｎｗｉｌｄｒｉｃｅｉｓｍａｉｎｌｙｒｅｌａｔｅｄｔｏｌａｔｉｔｕｄｅ．Ｔｈｅｉｎｄｉｃａａｎｄｊａｐｏｎｉｃａｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｔｒｅｎｄｉｎｃｏｍｍｏｎｗｉｌｄｒｉｃｅｃａｎｂｅｐｒｏｖｅｄａｔｔｈｅｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｌｅｖｅｌａｎｄｇｅｎｅｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎｏｃｃｕｒｓｄｕｒｉｎｇｔｈｅｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｏｆｃｏｍｍｏｎｗｉｌｄｒｉｃｅ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｃｏｍｍｏｎｗｉｌｄｒｉｃｅ；ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌＤＮＡ；ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ｌｏｎｇｉｔｕｄｅａｎｄｌａｔｉｔｕｄｅ 普通野生稻资源极为丰富，具有非常丰富的栽培稻不具备的基因。
水稻抗病基因Lrr19类似物序列分析研究
水稻抗病基因Lrr19类似物序列分析研究摘要根据GeneBank数据库中已知水稻抗病基因Lrr19类似物序列，设计引物，比较普通野生稻、粳稻和籼稻的基因序列，初步分析了3种水稻Lrr19类似物的序列差异，与小麦抗病基因Lrr19编码序列的同源性。
结果发现在水稻不同品系间发生部分位点碱基的变化，相似性为97%～98%；水稻中该类似物编码的蛋白质与小麦的LRR19有较高的同源性（54%～55%），籼稻、粳稻和普通野生稻编码蛋白都在相同的位置存在NB-ARC和LRR结构域，并且与小麦LRR19蛋白相似。
推测水稻Lrr19基因类似物是抗性相关基因，并且在水稻不同品种间序列差异不大，相对较为保守。
关键词水稻；抗病基因；Lrr19；类似物自1992年第1个植物抗病基因Hm1被克隆[1]以来，人们不断发现已克隆的抗病基因存在一些相似的结构域，如NBS、LRR、TIR、STK、LZ、CC等[2-5]。
1996年Kanazin和Yu开展了使用这些结构域设计简并引物从基因组DNA中进行扩增的研究[6-7]。
由于扩增的产物与抗病基因有较高的同源性，一些研究者将其分别称为抗性基因同源类似物Resistance gene analog（RGA）[6]。
亮氨酸富集重复序列（LRR）是长度在24个氨基酸之内的多重重复，它含有多个亮氨酸或其他亲水残基，也含有有分配规律的脯氨酸和天冬氨酸。
LRR 存在于许多功能不同的蛋白质中，它与蛋白质之间的相互作用及信号转导有着非常密切的关系。
人们还发现在抗病基因RPS2、RPM1和N的LRR结构域中单个氨基酸的变化可导致抗病反应的消失和减弱[7]，而且如果单独在水稻中表达Xa21蛋白的LRR，也可表现出对水稻白叶枯病菌的部分抗性[8]。
这些研究表明LRR结构中微小的修饰就容易破坏LRR的功能，表明LRR在植物抗病过程中具有重要作用[9]。
Lrr19是一个小麦抗白粉病相关基因，其编码蛋白的分子功能是与ATP非共价键结合并选择性相互作用，是一种普遍的重要的辅酶和酶调节因子[10]，其功能与蛋白激酶有关[11]。
云南野生稻抗稻瘟病Pi
云南野生稻抗稻瘟病P i Ｇt a 基因的检测及分析赵国珍１㊀蒋春苗２㊀刘吉新１㊀陈于敏１㊀余腾琼２㊀程在全２,∗(１云南省农业科学院粮食作物研究所,昆明６５０２０５;２云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所,昆明６５０２２３;∗通讯联系人,E Ｇm a i l :c h z a qu １＠h o t m a i l ．c o m )I d e n t i f i c a t i o n a n dA n a l ys i s o n t h eR i c eB l a s tR e s i s t a n c eG e n e P i Ｇt a i nW i l dR i c e f r o m Y u n n a n ,C h i n aZ H A O G u o Ｇz h e n １,J I A N G C h u n Ｇm i a o ２,L I U J i Ｇx i n １,C H E N Y u Ｇm i n １,Y U T e n g Ｇq i o n g ２,C H E N G Z a i Ｇqu a n ２,∗(１I n s t i t u t e o f F o o dC r o p s ,Y u n n a nA c a d e m y o f A g r i c u l t u r a lS c i e n c e s ,K u n m i n g ６５０２０５,C h i n a ;２B i o t e c h n o l o g y an dG e n e t i cR e Ｇs o u r c e s I n s t i t u t e ,Y u n n a nA c a d e m y o f A g r i c u l t u r a l S c i e n c e s ,K u n m i n g ６５０２２３,C h i n a ;∗C o r r e s p o n d i n g a u t h o r ,E Ｇm a i l :c h z a q u １＠h o t m a i l ．c o m )Z HA O G u o z h e n ,J I A N GC h u n m i a o ,L I UJ i x i n ,e t a l ．I d e n t i f i c a t i o n a n d a n a l ys i s o n t h e r i c e b l a s t r e s i s t a n c e g e n e P i Ｇt a i nw i l d r i c e f r o m Y u n n a n ,C h i n a ．C h i n JR i c eS c i ,２０１４,２８(６):６７５Ｇ６８０．A b s t r a c t :At o t a l o f １６a c c e s s i o n s o fw i l d r i c e f r o md i f f e r e n t r e g i o n s o fY u n n a nP r o v i n c ew e r e u s e d f o rP C Ra m pl i f i c a Ｇt i o nw i t h P i Ｇt a g e n es p e c i f i c p r i m e r s ．T h ea m p l i f i e dP C R p r o d u c t s w e r ec l o n e di n t o T o p oc l o n i n g ve c t o r ,a n ds e Ｇq u e n c e d ．A m o n g １６a c c e s s i o n s ,t h e i d e n t i c a l s e q u e n c ef r ag m e n t t oth er e si t a n c e P i Ｇt a g e n ew a sa m p l i f i e ds e p a r a t e l yf r o m７a c c e s s i o n s ．T h e P i Ｇt a a l l e l e i no n e a c c e s s i o no f O r y z a r u f i p og o n w i th p u r p l e s t e mf r o mJi n g h o n g c o n t a i n s a n i Ｇd e n t i c a lD N As e q u e n c e i n t h e c o d i n g r e g i o n t o t h e o r i g i n a l P i Ｇt a r e s i s t a n c e g e n e ．I t s u g g e s t e d t h a tY u n n a nm i g h t b e o n e o f t h e o r i gi n s o f t h e P i Ｇt a g e n e ．K e y w o r d s :w i l d r i c e ;r i c eb l a s t r e s i s t a n c e g e n e P i Ｇt a ;c l o n i n g ;s e q u e n c i n g a n a l y s i s 赵国珍,蒋春苗,刘吉新,等．云南野生稻抗稻瘟病P i Ｇt a 基因的检测及分析．中国水稻科学,２０１４,２８(６):６７５Ｇ６８０．摘㊀要:以１６个不同来源的云南野生稻作为供试材料,用抗稻瘟病P i Ｇt a 基因特异引物(K G ２/K G ４)进行P C R 扩增,并对P C R 产物进行克隆㊁测序及分析.结果表明,１６个野生稻中７个品种持有抗稻瘟病P i Ｇt a 基因,其中,来自云南景洪的紫秆普通野生稻中P i Ｇt a 基因的编码区与原始型的抗稻瘟病P i Ｇt a 基因的D N A 序列完全相同.可见,云南可能是抗稻瘟病基因P i Ｇt a 的起源地之一.关键词:野生稻;抗稻瘟病P i Ｇt a 基因;克隆;测序分析中图分类号:S ４３５．１１１．４＋１;S ５１１．０３４;S ５１１．９㊀㊀㊀㊀㊀文献标识码:A㊀㊀㊀文章编号:１００１Ｇ７２１６(２０１４)０６Ｇ０６７５Ｇ０６㊀㊀水稻是全世界重要的粮食作物之一,也是我国第一大粮食作物,全国超过６０％的人口以大米为主食[１],然而,稻瘟病严重威胁着水稻生产,每年都造成不同程度的产量损失.稻瘟病是由真菌M a g n a Ｇp o r t h e o r yz a e 引起的病害,水稻与稻瘟病菌的互作符合经典的 基因对基因 学说[２Ｇ４].稻瘟病抗性可分为完全抗性和部分抗性两种类型,前者由单个主效抗性基因控制,而后者由微效多基因控制[５Ｇ７].目前已定位了８４个稻瘟病抗性基因,这些基因大多数属于主效抗性基因,少数属于单基因控制的部分抗性基因[８].水稻抗稻瘟病P i Ｇt a 基因是最早被克隆的主效抗病基因之一,可以保护水稻不受携带A V R ＧP i t a 的稻瘟病菌生理小种的侵染,其编码的蛋白含有典型的D N A 结构域(n u c l e o t i d e b i n d i n g si t e ,N B S )和富含亮氨酸的结构域(l e u c i n e Ｇr i c h d o m a i n ,L R D )[９].水稻P i Ｇt a 基因和A V R ＧP i t a 蛋白可发生直接作用,互作的特异性由P i Ｇt a 蛋白９１８位点的丙氨酸/丝氨酸决定,当９１８位点上的丙氨酸被丝氨酸取代后,P i Ｇt a 和A V R ＧP i t a 的互作被削弱并收稿日期:２０１４Ｇ０３Ｇ１１;修改稿收到日期:２０１４Ｇ０５Ｇ０７.基金项目:云南省科技攻关计划资助项目(２０１２B B ０１３);N S F C 计划资助项目(U １３０２２６５,３１６００６７);农业行业专项(２０１００３０２１);云南省应用基础研究重点项目(２０１２F A ００５).５７６中国水稻科学(C h i nJR i c eS c i ),２０１４,２８(６):６７５－６８０h t t p ://w w w．r i c e s c i ．c n D O I :１０．３９６９/j．i s s n ．１００１Ｇ７２１６．２０１４．０６．０１４导致水稻感病[２,９].P iＧt a基因具有保守的序列信息和功能特性,而与其相应的A V RＧP i t a位点序列却变异较多,进化速度快[１０Ｇ１１].因此,系统地分析水稻P iＧt a基因位点和蛋白序列的变异,有助于了解P iＧt a基因的变异与水稻抗病性之间的关系[１２].由于不同水稻品种间的P iＧt a基因存在大量的遗传多态性,通过分析P iＧt a基因在核苷酸水平上的多态性,可明确其蛋白９１８位点丙氨酸的功能,了解稻瘟病P iＧt a基因的起源与进化.野生稻作为栽培稻的祖先,长期处于野生状态,经受各种灾害和恶劣环境的选择,具有各种抗病虫性和耐不良环境的优良特性,如抗稻瘟病㊁高抗白叶枯病等.云南是亚洲栽培稻的起源地之一,具有我国三种野生稻.目前,针对P iＧt a基因的研究大多集中在其结构㊁功能及其调控机理等方面[９,１３Ｇ１６],而关于云南三种野生稻中P iＧt a基因序列㊁蛋白位点分析及起源进步等目前尚未见报道,因此本研究以云南不同地方的６个药用野生稻㊁４个普通野生稻和６个疣粒野生稻居群为研究材料,设计引物扩增P iＧt a基因的序列,通过测序分析云南野生稻中P iＧt a基因在核苷酸水平上的多态性,并与原始型的P iＧt a基因进行序列比对,旨在为研究抗稻瘟病P iＧt a基因的起源提供依据,为选育抗稻瘟病栽培品种提供材料.１㊀材料与方法１．１㊀水稻材料以１６个来源于云南省不同地方的野生稻作为本研究的供试材料,材料名称及来源详见表１.１．２㊀抗稻瘟病基因P iＧt a的扩增云南野生稻幼苗在温室内生长至３~４叶,取新鲜叶片参照C T A B法提取基因组D N A[１７],以抗稻瘟病P iＧt a基因K G２和K G４作为特异引物[１６](表２),对云南野生稻抗稻瘟病基因P iＧt a进行扩增. P C R体系总体积为２０μL,其中D N A１μL,上下游引物(K G２和K G４)各１μL,T a K a R aL A T a q D N A聚合酶(由美国Q i a g e n公司生产)１０μL, M g C l２１．５μL,蒸馏水５．５μL.在P e l t i e rT h e r m a l C y e l e rP T CＧ２０仪上进行(M JR e s e a r c h,W a l t h a m, MA)P C R,反应程序如下:９４ħ下预变性４m i n;９４ħ下３０s,５５ħ下３０s,７２ħ下２m i n,３０个循环;表１㊀供试材料基本情况T a b l e１．I n f o r m a t i o n o f t e s tm a t e r i a l s．序号C o d e 材料名称N a m e来源O r i g i n１药用野生稻(耿马)O．o f f i c i n a l i s(G e n g m a)云南省耿马县G e n g m aC o u n t y,Y u n n a n,C h i n a ２药用野生稻(勐海)O．o f f i c i n a l i s(M e n g h a i)云南省勐海县M e n g h a i C o u n t y,Y u n n a n,C h i n a ３药用野生稻(勐海)O．o f f i c i n a l i s(M e n g h a i)云南省勐海县M e n g h a i C o u n t y,Y u n n a n,C h i n a ４药用野生稻(勐遮)O．o f f i c i n a l i s(M e n g z h e)云南省勐遮县M e n g z h eC o u n t y,Y u n n a n,C h i n a ５药用野生稻１O．o f f i c i n a l i s１６药用野生稻２O．o f f i c i n a l i s２７普通野生稻(景洪)１O．r u f i p o g o n(J i n g h o n g)１云南省景洪县J i n g h o n g C o u n t y,Y u n n a n,C h i n a ８普通野生稻(景洪)２O．r u f i p o g o n(J i n g h o n g)２云南省景洪县J i n g h o n g C o u n t y,Y u n n a n,C h i n a ９普通野生稻(景洪,绿秆)O．r u f i p o g o n(J i n g h o n g,g r e e n s t e m)云南省景洪县J i n g h o n g C o u n t y,Y u n n a n,C h i n a １０普通野生稻(景洪,紫秆)O．r u f i p o g o n(J i n g h o n g,p u r p l e s t e m)云南省景洪县J i n g h o n g C o u n t y,Y u n n a n,C h i n a １１疣粒野生稻(澜沧江)O．m e y e r i a n a(L a n c a n g j i a n g)云南省澜沧江L a n c a n g j i a n g C o u n t y,Y u n n a n,C h i n a １２疣粒野生稻(郑康赤水关)O．m e y e r i a n a(C h i s h u i g u a n,Z h e n g k a n g)云南省澜沧县L a n c a n g C o u n t y,Y u n n a n,C h i n a １３疣粒野生稻(澜沧)O．m e y e r i a n a(L a n c a n g)云南省澜沧县L a n c a n g C o u n t y,Y u n n a n,C h i n a １４疣粒野生稻(景洪)O．m e y e r i a n a(J i n g h o n g)云南省景洪县J i n g h o n g C o u n t y,Y u n n a n,C h i n a １５疣粒野生稻(普洱)O．m e y e r i a n a(P u e r)云南省普洱市P u e rC i t y,Y u n n a n,C h i n a１６疣粒野生稻(孟定)O．m e y e r i a n a(M e n g d i n g)云南省孟定县M e n g d i n g C o u n t y,Y u n n a n,C h i n a表２㊀P iＧt a基因引物序列T a b l e２．P r i m e r s e q u e n c e f o r P iＧt a g e n e．引物名称P r i m e r n a m e序列(５ᶄＧ３ᶄ)S e q u e n c e(５ᶄＧ３ᶄ)退火温度A n n e a l i n g t e m p e r a t u r e/ħK G２T G CC A A A G CT A CA G G T T CA A T T５５．２K G４G A CT A G G A AC C AC A CC T TC T５３．６６７６中国水稻科学(C h i nJR i c eS c i)㊀第２８卷第６期(２０１４年１１月)表３㊀用于测序的P iＧt a基因引物序列T a b l e３．L i s t o f o l i gＧn u c l e o t i d e s u s e d f o r s e q u e n c e a n a l y s i s．引物P r i m e r序列(５ᶄＧ３ᶄ)S e q u e n c e(５ᶄＧ３ᶄ)退火温度A n n e a l i n g t e m p e r a t u r e/ħT３A T T A A CC C TC A CT A A A G４２．１T７T A A T A CG A CT C AC T A T A G G G４７．５M１３F G T A A A AC G AC G GC C A G T５２．６M１３R C A G G A A A C A G C T A T G A C C４５．０F８Ｇ５T C CT C A G A G G C G A T CT C CG５８．５Y L７１A G CA G T A A G T T G T A A T T T A T５０．２Y L８０C A G G A T G A CC T T G A CA C TC T６０．４Y L８３G G T A C CC G A G A A A A T A T A G G５８．４Y L８７C T AC C A A C A A G T T C A T C A A A５４．３Y L９０G T A T G A A A CA T G T A CT T TC A５２．２Y L６８G G CC G AC G GC G A G C CG A A G C７２．７Y L６９G G A T G T T T G G G A G G T T G A T C６０．４Y L８２A G A G A CT T G G A T G A A G A T T T５４．３Y L１００C C CA A T G C CG A G T G T G C A A A G G６６．４Y L１０２T C A G G T T G A A G A T G CA T A G C５８．４Y L１５３C A A C A A T T T A A TC A T A C AC G４４．８Y L１５４A T G A C AC C CT G CG A T G C A A５７．４Y L１５５A G CA G G T T A T A A G C T A G GC C５４．１XW２３G T T A G T A G A A T G A G G T G G G T５１．１X Y６G C T G C TC T TC T CT C TC T TC C T５６．０XW１３A A AC T A T C CG G AC G CA T T T G５３．２XW１４T G CC A A A G CT A CA G G T T CA A T T５５．２Y L７５C A AC A G A A A T T G A A CC T G T A５４．３Y L７６G G A A T GC A GC A A T G G A A TC A５８．４Y L７７T T T G A T G A AC T T G T T G G T A G５４．３Y L８５A C A G C A G T T G C TC T T G C A T C６０．４Y L８６C A T A C AC T T G A CT T G T C CG A５８．４７２ħ下延伸５m i n.反应结束后取６μLP C R产物并加入２μLL o a d i n g D y e,在０．１％琼脂糖凝胶(S BＧG R染色)中于８５V电压下电泳１h,用凝胶成像仪扫描拍照.１．３㊀P iＧt a基因的克隆及测序P C R产物的克隆采用T O P O４P C RC l o n i n g试剂盒进行,该试剂盒购自美国Q i a g e n公司.操作步骤如下:在P C R产物中加入１μL载体,室温下静置３０m i n后,加入２０μL感受态细胞,迅速进行电击转化.电击后,冰上静置５m i n,加入５００μLS O C 培养液,置于带振荡器的恒温箱中(３７ħ)培养１h,然后取１００μL培养液于含有５０m g/L卡那霉素的L B固体培养基中,用弹珠混匀,室温下静置３~５m i n,将培养皿倒置在３７ħ恒温箱中过夜培养.第２天观察培养情况,每一个培养皿中分别挑出５个白色克隆,转到S O C培养液中,置于带振荡器的恒温箱(３７ħ)中继续过夜培养,第３天收集培养液提取质粒D N A.质粒D N A的提取采用Q i a g e n K i t 试剂盒按规程进行(美国Q i a g e n公司).使用２７个抗稻瘟病基因P iＧt a特异引物进行测序(表３), D N A测序由美国密西西比州斯通维尔U S D AＧA R S M S A基因组学实验室完成.１．４㊀数据分析采用V e c t o rN T IV．１０软件进行序列拼接,野生稻的抗稻瘟病P iＧt a基因与原始抗稻瘟病基因P iＧt a的序列比对及相似性分析用M E G A４．０软件进行.２㊀结果与分析２．１㊀P iＧt a基因的扩增结果K G２/K G４引物能对供试野生稻中的７个品种扩增出特异性条带,片段大小为４２７５b p,与预期结果一致,说明供试的７个野生稻品种持有抗稻瘟病基因P iＧt a(图１).这７个品种分别是药用野生稻７７６赵国珍等:云南野生稻抗稻瘟病P iＧt a基因的检测及分析１－药用野生稻(耿马);２－药用野生稻(勐海);３－药用野生稻(勐海);４－药用野生稻(勐遮);５－药用野生稻１;６－药用野生稻２;７－普通野生稻１(景洪);８－普通野生稻２(景洪);９－普通野生稻(景洪,绿秆);１０－普通野生稻(景洪,紫秆);１１－疣粒野生稻(澜沧江);１２－疣粒野生稻(郑康赤水关);１３,疣粒野生稻(澜沧);１４,疣粒野生稻(景洪);１５,疣粒野生稻(普洱);１６,疣粒野生稻(孟定).１,O．o f f i c i n a l i s(G e n g m a);２,O．o f f i c i n a l i s(M e n g h a i);３,O．o f f i c i n a l i s(M e n g h a i);４,O．o f f i c i n a l i s(M e n g z h e);５,O．o f f i c i n a l i s１;６,O．o f f i c i n a l i s２;７,O．r u f i p o g o n１(J i n g h o n g);８,O．r u f i p o g o n２(J i n g h o n g);９,O．r u f i p o g o n(J i n g h o n g,g r e e n s t e m);１０,O．r u f iＧp o g o n(J i n g h o n g,p u r p l e s t e m);１１,O．m e y e r i a n a(L a n c a n g j i a n g);１２,O．m e y e r i a n a(C h i s h u i g u a n,Z h e n g k a n g);１３,O．m e y e r i a n a(L a nＧc a n g);１４,O．m e y e r i a n a(J i n g h o n g);１５,O．m e y e r i a n a(P u e r);１６,O．m e y e r i a n a(M e n g d i n g)．图１㊀云南野生稻P iＧt a基因的扩增结果F i g．１．A m p l i f i c a t i o n r e s u l t s o f P iＧt a g e n e i nY u n n a nw i l d r i c e．１㊁药用野生稻２㊁普通野生稻１(景洪)㊁普通野生稻２(景洪)㊁普通野生稻(景洪,绿秆)㊁普通野生稻(景洪,紫秆)和疣粒野生稻(澜沧江).２．２㊀抗稻瘟病基因P iＧt a序列比对分析对P iＧt a基因的２个外显子和一个内含子共４２７５b p的D N A序列进行测序比对分析,发现７个供试野生稻品种P iＧt a位点的核苷酸序列间均存在差异.P iＧt a位点的氨基酸情况及相似性分析结果表明(表４和图２),来自景洪的普通野生稻(紫秆) P iＧt a位点的核苷酸序列和氨基酸与原始P iＧt a序列完全相同,说明云南可能是抗稻瘟病基因P iＧt a 的起源地之一.其余６个野生稻中,P iＧt a位点的核苷酸序列相似性最高的是药用野生稻１和药用野生稻２,其相似性达７０％.来自澜沧江的疣粒野生稻与其他野生稻在P iＧt a位点的核苷酸序列差异最大.３㊀讨论P iＧt a基因是B r y a n等[９]通过作图的方法从日本栽培稻社糯(Y a s h i r oＧm o c h i)中克隆获得,该基因位于水稻第１２染色体着丝点附近,编码由９２８个氨基酸残基组成的富含亮氨酸重复序列的细胞质膜受体蛋白.对抗稻瘟病品种和感稻瘟病的P iＧt a基因序列分析表明,抗病水稻品种的P iＧt a基因与感病表４㊀野生稻品种中P iＧt a基因氨基酸序列变化T a b l e４．A m i n o a c i d v a r i a t i o na m o n g a c c e s s i o n s o fw i l d r e l a t i v e s o f r i c e．材料M a t e r i a l氨基酸位次A m i n o a c i d p o s i t i o n６７２８１１８１４８１５８１７６３６５４９８６６０８０８８１０９１８９１９P iＧt a[９]I A P G R H D H F P Q D A M 药用野生稻１O．o f f i c i n a l i s１S A L G S Q V H F L Q D S M 药用野生稻２O．o f f i c i n a l i s２S A P G S Q V H F P Q G S M 普通野生稻(景洪)S E P G R H D H F P Q D S M O．r u f i p o g o n(J i n g h o n g)普通野生稻(景洪)S E P G R H V H F P Q D S M O．r u f i p o g o n(J i n g h o n g)普通野生稻(景洪,绿秆)S A P S R H D H F P E D S M O．r u f i p o g o n(J i n g h o n g,g r e e n s t e m)普通野生稻(景洪,紫秆)I A P G R H D H F P Q D A M O．r u f i p o n g o n(J i n g h o n g,p u r p l e s t e m)疣粒野生稻(澜沧江)S E P G R H D Y L P Q D S I O．m e y e r i a n a(L a n c a n g j i a n g)８７６中国水稻科学(C h i nJR i c eS c i)㊀第２８卷第６期(２０１４年１１月)图２㊀P iＧt a位点在７个野生稻中的聚类分析F i g．２．C l u s t e r a n a l y s i s o f t h e P iＧt a a l l e l e a m o n g a c c e s s i o n s o fw i l d r e l a t i v e s o f r i c e．水稻品种的P iＧt a基因产物之间仅有一个氨基酸残基的差异,即９１８位点上抗病P iＧt a基因产物为丙氨酸,而感病p iＧt a等位基因该位点为丝氨酸[２,１８].本研究中,从１６个云南野生稻中检测出７个品种携带P iＧt a基因.通过序列比对,P iＧt a位点的核苷酸序列相似性最高的是药用野生稻１和药用野生稻２,其相似性达７０％,来自澜沧江的疣粒野生稻与其他野生稻间P iＧt a位点的核苷酸序列差异最大.但是仅有来自景洪的紫秆普通野生稻中分离克隆的P iＧt a基因９１８位点上为丙氨酸,并且该基因的核苷酸序列和氨基酸与原始型的抗稻瘟病基因P iＧt a 的D N A序列完全相同;聚类分析表明,含P iＧt a基因的云南野生稻遗传多样性丰富,可聚成６类,其中景洪的紫秆普通野生稻的P iＧt a基因与原始型的P iＧt a基因聚为一支,可能是由同一祖先进化而来,而景洪的紫秆普通野生稻有可能是最早含有P iＧt a 抗性基因的野生稻资源.由此推测,云南可能是抗稻瘟病基因P iＧt a的起源地之一.P iＧt a基因仅存在一种序列控制稻瘟病,决定P iＧt a基因识别特异性的关键是其蛋白序列９１８位点的丙氨酸/丝氨酸,丙氨酸可使P iＧt a基因识别A V RＧP i t a,进而使水稻获得抗性,如果该位点是丝氨酸则不具备该功能[９,１９].７个云南野生稻品种克隆到的P iＧt a基因,除景洪紫秆普通野生稻的９１８位点为丙氨酸,其余６个野生稻品种均为丝氨酸,因此这６个野生稻品种中的P iＧt a基因不具备使其获得抗性的功能.本课题组前期对这６个野生稻品种进行稻瘟病抗性鉴定分析,发现这６个野生稻对稻瘟病均表现出不同程度的抗性.因此,本研究可以确定这６个云南野生稻品种对稻瘟病的抗性不是P iＧt a基因所决定,但可以明确这６个云南野生稻品种含有P iＧt a抗性基因外的其他已知的抗性基因或是尚未发现分离的抗稻瘟病新基因.这有待进一步的研究.抗稻瘟病品种的选育是防治稻瘟病最经济㊁有效的途径.抗稻瘟病基因P iＧt a在我国很多稻区表现高水平的稻瘟病抗性,被广泛应用于我国的水稻育种和生产[２０Ｇ２３].本研究发现来源于云南景洪的紫秆普通野生稻持有抗稻瘟病P iＧt a基因,由于普通野生稻与栽培稻同属A A基因组型,不存在严重的生殖隔离[２４],因此可以利用杂交的手段将该野生稻中的抗稻瘟病基因P iＧt a导入栽培稻,也可以通过转基因方法直接将获得的P iＧt a基因导入不抗病的高产优质栽培稻品种中,以改良其稻瘟病抗性.另外６个云南野生稻品种的抗稻瘟病能力不是由P iＧt a基因赋予,可能含有P iＧt a抗性基因外的其他已知抗性基因或是尚未发现的抗稻瘟病新基因.参考文献:[１]㊀朱德峰,程式华,张玉屏,等．全球水稻生产现状与制约因素分析．中国农业科学,２０１０,４３(３):４７４Ｇ４７９．[２]㊀J i aYL,M c A d a m s SA,B r y a nG T,e t a l．D i r e c t i n t e r a c t i o n o f r e s i s t a n c e g e n ea n da v i r u l e n c e g e n e p r o d u c t sc o n f e r sr i c eb l a s t r e s i s t a nc e．E M B OJ,２０００,１９(１５):４００４Ｇ４０１４．[３]㊀V a l e n tB,C h u m l e y F G．M o l e c u l a r g e n e t i c so f t h er i c eb l a s tf u ng u s M a g n a p o r th e g ri s e a．A n n R e v P h y t o p a t h o l,１９９１,２９:４４３Ｇ４６７．[４]㊀S i l u eD,N o t t e g h e mJL,T h a r r e a uD．E v i d e n c eo f a g e n eＧf o rＧg e n e r e l a t i o n s h i p i n t h e O r y z a s a t i v aＧM a g n a p o r t h e g r i s e a p aＧt h o s y s t e m．P h y t o p a t h o l o g y,１９９２,８２:５７７Ｇ５８０．９７６赵国珍等:云南野生稻抗稻瘟病P iＧt a基因的检测及分析[５]㊀E z u k aA．F i e l d r e s i s t a n c e o f r i c e v a r i e t i e s t o r i c e b l a s t d i s e a s e．R e vP l a n tP r o tR e s,１９７２,５:１Ｇ２１．[６]㊀B o n m a n JM,M a c k i l l DJ．D u r a b l e r e s i s t a n c e t o r i c e b l a s t d i sＧe a s e．O r y z a,１９８８,２５:１０３Ｇ１１０．[７]㊀W a n g GL,M a c k i l lDJ,B o n m a n M,e t a l．R F L Pm a p p i n g o fg e n e s c o n f e r r i n g c o m p l e t ea n d p a r t i a l r e s i s t a n c et ob l a s t i nad u r a b l y re s i s t a n tr i c ec u l t i v a r．G e n e t i c s,１９９４,１３６:１４２１Ｇ１４３４．[８]㊀杨勤忠,林菲,冯淑杰,等．水稻稻瘟病抗性基因的分子定位及克隆研究进展．中国农业科学,２００９,４２(５):１６０１Ｇ１６１５．[９]㊀B r y a nG T,W u K S,F a r r a l lL,e ta l．As i n g l ea m i n oa c i dd i f fe r e n c e d i s t i n g u i s h e s r e s i s t a n t a n ds u s c e p t i b l ea l l e l e sof t h er i c e b l a s t r e s i s t a n c e g e n e P iＧt a．P l a n tC e l l,２０００,１２:２０３３Ｇ２０４５．㊀[１０]Z h o uB,D o l a n M,S a k a iH,e t a l．T h e g e n o m i c d y n a m i c s a n de v o l u t i o n a r y m e c h a n i s mof t h e P i２/９l o c u s i n r i c e．M o lP l a n tM i c r o b I n t e r a,２００７,２０:６３Ｇ７１．[１１]K h a n g C H,P a r kSY,L e eY H,e t a l．G e n o m eo r g a n i z a t i o na n de v o l u t i o no f t h e A V RＧP i t a a v i r u l e n c e g e n ef a m i l y i nt h eM a g n a p o r t h e g r i s e a s p e c i e s c o m p l e x．M o lP l a n tM i c r o b eI nＧt e r a,２００８,２１(５):６５８Ｇ６７０．[１２]王雪艳．水稻抗稻瘟病基因P iＧt a多态性研究和P t r(t)基因的精细定位[学位论文]．杭州:浙江大学,２００９．[１３]C o s t a n z oS,J i a Y L．A l t e r n a t i v e l y s p l i c e dt r a n s c r i p t so f P iＧt ab l a s t r e s i s t a nc e g e n e i n O r y z as a t i v a．P l a n tS c i,２００９,１７７:４６８Ｇ４７８．[１４]D aY,J i aYL,C o r r e l l J,e t a l．D i v e r s i f i c a t i o n a n d e v o l u t i o n o f t h ea v i r u l e n c e g e n e A V RＧP i t a１i nf i e l di s o l a t e so f M a g n aＧp o r t h e o r y z a e．F u n g a lG e n e t i c s&B i o l,２０１０,４７:９７４Ｇ９８０．[１５]J i aY L．A r t i f i c i a l i n t r o g r e s s i o no fa l a r g ec h r o m o s o m ef r a gＧm e n t a r o u n d t h er i c eb l a s t r e s i s t a n c e g e n e P iＧt a i nb a c k c r o s s p r o g e n y a n d s e v e r a l e l i t e r i c e c u l t i v a r s．H e r e d i t y,２００９,１０３:３３３Ｇ３３９．[１６]J i aY L,M a r t i nR．I d e n t i f i c a t i o no f an e wl o c u s,P t r(t)r eＧq u i r e d f o r r i c eb l a s t r e s i s t a n c e g e n e P i s,P t r(t)r e q u i r e df o r r i c eb l a s tr e s i s t a n c e g e n e P iＧt aＧm e d i a t e dr e s i s t a n c e．MP M I,２００８,２１:３９６Ｇ４０３．[１７]S t e w a r tC,V i aL．A r a p i d C T A B D N Ai s o l a t i o nt e c h n i q u e u s e f u lf o r R A P Di n g e r p r i n t i n g a n d o t h e rP C R a p p l i c a t i o n s．B i o t e c h n i q u e s,１９９３,１４(５):７４８Ｇ７５０．[１８]J i aY L,W a n g Z H,S i n g hP．D e v e l o p m e n to fd o m i n a n t r i c eb l a s t P iＧt a r e s i s t a nc e g e n em a r k e r s．C r o p S c i,２００２,４２(６):２１４５Ｇ２１４９．[１９]J i aY,W a n g Z,F j e l l s t r o m RG,e t a l．R i c e P iＧt a g e n e c o n f e r s r e s i s t a n c e t o t h em a j o r p a t h o t y p e so f r i c eb l a s t f u n g u s i nt h e U S．P h y t o p a t h o l o g y,２００４,９４:２９６Ｇ３０１．[２０]时克,雷财林,程治军,等．稻瘟病抗性基因P i t a和P i b在我国水稻主栽品种中的分布．植物遗传资源学报,２００９,１０(１):２１Ｇ２６．[２１]戴小军,杨远柱,周亮,等．抗稻瘟病水稻资源抗性基因P iＧt a㊁P i b㊁P i９以及P i k m的分布研究．生命科学研究,２０１２,１６(４):３４０Ｇ３４４．[２２]王甜,许明辉．云南地方稻种抗稻瘟病基因P i t a和P i b的研究进展．云南大学学报:自然科学版,２０１０,３２(S u p p l２):２４６Ｇ２５１．[２３]梁斌,肖放华,黄费元,等．云南野生稻对稻瘟病的抗性评价．中国水稻科学,１９９９,１３(３):１８３Ｇ１８５．[２４]张武汉,何强,舒服,等．非A A型野生稻资源在水稻育种中的利用．杂交水稻,２００６,２１(５):１Ｇ７．０８６中国水稻科学(C h i nJR i c eS c i)㊀第２８卷第６期(２０１４年１１月)。
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carboxylase
-
BE429292.1
-
(Triticum turgidum)
-
FF534517.1
-
(Manihot esculenta)
-
EH277383.1
-
(Spartina
alterniflora)
二、水稻新基因
• 定义：能定位到栽培稻基因组序列的同源，但无任何已知水稻表达序列的同源。 与rice MPSS搜索比较几乎没有找到匹配片段。
99
CU861795 475
99
CU406355 837
100
CU406396 520
Chr location 05 09
12
02
Identity(%) Antisense protein
99
CA764081 DNA-directed RNA polymerase 3
79
CT858901 -
97
AK107125 AP2 domain, putative
1888 W1943 cDNAs BLAST against cultivated rice genomic sequences and cDNAs
1888 W1943 cDNAs SSR comparison with indica and japonica cDNAs
一、未匹配粳稻基因组之基因
CU8616CT841937 1552
08
98
AK106713 -
注：该17个基因均没有找到任何蛋白同源匹配。右侧的7个基因与已知的 水稻表达序列成反义RNA对。
三、W1943特有剪切方式基因
• 定义：与栽培稻japonica基因组序列完全一致(100% identity)，同时与栽培稻表达序列同 源但剪切方式独有(独特的AS剪切方式)。
-
CU406778
CU406596 Contig001277 AK242711
-
CU861677
CT842008 Contig008507 CT856206
--
CT841912
93-11 contigs
Contig003011 Contig000750 -
ESTs or mRNA hits CT859459 AK099287 CT856885
• 解释：水稻新基因。或者在栽培稻中表达量过低难于克隆，或者野生稻特有。
name
Len(bp)
CU406910 656 CU406138 568 CU406022 543 CU405757 477
Chr location 10 02
12
04
Identity(%) name
Len(bp)
99
CU405785 727
野生稻O. rufipogon W1943 1888 条全长cDNA序列的数据分析
NCGR 2008-09-03
背景
• 野生稻O. rufipogon（AA genome）是与栽培 稻关系最近的祖先水稻品种1,2。
• 具有许多优于栽培稻的农艺性状，比如耐旱、耐 盐等等3,4；
• 公共数据库中有大量栽培稻的基因组序列信息5,6， 同时也有大量的cDNA资源7,8；
99
AK103485 -
CU406921 414
02
100
CU406535 389
02
100
CU406832 530
10
92
CU406871 458
01
84
CU861804 383
06
99
CU861721 554
01
100
CT841800 941
11
99
AK121962 patatin, putative
name
93-11 contigs
CT842002 CT842007 CU405940
Contig005912 Contig008507 Contig001402
ESTs or mRNA hits AK241925 CT856206 AK103326
protein
-
name
CU406895 CU861744 CU405657
• 极少野生稻的序列和克隆资源，比较成规模的是 Oryza minuta (BBCC genome) 5,211条叶片 ests9。
现状与目的
• NCGR野生稻资源：克隆并精确测序了1,888个 unique的O. rufipogon W1943 cDNA克隆。
• 期望通过W1943 cDNA序列与籼、粳稻cDNA序 列的比较： 汇总一些水稻新基因、潜在野生稻特有的基因、 W1943特有剪切方式基因、组织特异性高表达的 基因和与microRNA相关的基因； 提供一些线索，供有兴趣者作进一步研究之用。
CU406172 Contig014596 CT842006 Contig000383
AK242967 AK111647
CU861753 Contig000750 AK099287
CU406308 Contig000444 CT841996 Contig002576 CU406568 Contig003848
• 解释：或只是尚未克隆到该AS表达方式；或为野生稻所独具。
name CT841942 CU406810 CT841893 CT841874 CU405853 CU405923 CU406279 CU406025 CT841561 CU406579 CU406935 CU406600 CU405570 CU406091 CU406134
• 定义：未能定位到O. sativa japonica Nipponbare genome sequences，但与籼稻93-11基因组序 列有同源或与水稻ests序列有同源或与其它禾本科ests序列有同源。 且去除与细菌有同源的基因
• 解释：或者落于粳稻基因组测序gap中，或者籼稻特有的基因，或者野生稻特有基因。
protein
ring-box protein -
-
CA766528
-
-
CT836656
60S ribosomal
protein L7A
-
CA756235
60S ribosomal
protein L17
-
NM_001063334
-
-
AC145809
-
-
CN130755.1
ribulose-
(Sorghum bicolor) bisphosphate
AK070131 CT834800 AK064050
-
CT841712
GTP-binding protein
ring-box protein
-
-
Bowman Birk trypsin inhibitor
CU405768
CU405675
CU406202 CU406924 CU405898
CU406582 Contig000444 AK107776