博士德ELISA试剂盒一般操作流程
ELISA试剂及操作步骤
操作方法1、包被：用包被液CBS稀释包被抗原至菌含量为2×108cfu，酶标板中每孔加入50μl，湿盒内室温或4℃或37℃过夜包被。
2、洗涤：弃包被液（用力拍干），用洗涤液1×PBST洗板3次（每孔均要加满），每次3min~5min。
3、封闭：每孔加封闭液（1%BSA）250μl，（10ml 5%。
0.5g）37℃封闭2h。
4、洗涤：用洗涤液1×PBST洗板3次，每次3min~5min。
5、结合一抗：用1×PBST缓冲液1∶100稀释被检血清，每孔50μl，要设立阴性对照，37℃孵育1.5h。
6、洗涤：同上。
7、结合二抗：每孔加用1×PBST 500倍稀释的酶标二抗羊抗鸡IgG-HRP（稀释倍数根据产品不同有所不同，可按说明书进行）50μl，37℃孵育1.5h。
8、洗涤：同上。
9、显色：每孔加底物溶液（OPD）50μl (配10ml) ，置室温暗盒内显色10min。
10、待显色后，每孔加入50μl终止液（2mol/L H2SO4）终止反应。
使用酶标仪读取492nm的OD值，以确定血清抗体水平。
ELISA 检测所用主要试剂：包被缓冲液：0.05mol/L ，pH9.6碳酸盐缓冲液（CBS ）Na 2CO 3 l.59gNaHCO 3 2.93g加去离子水水至1000ml ，调pH 值到9.6。
15磅高压灭菌20min 后，室温贮藏。
磷酸盐缓冲溶液（1×PBS ）：0.01 mol/L 、pH7.4NaCl 8.0gKH 2PO4 0.2gKCl 0.2gNa 2HPO 4·12H 2O 2.9g溶于900ml 去离子水后，调节pH 至7.4，定容到1L 。
15磅高压灭菌20min 后，室温贮藏。
10×PBS ：0.2 mol/L 、pH7.4NaCl 8.0gKH 2PO 4 2.4gKCl 2.0gNa 2HPO 4·12H 2O 36.05g 或Na 2HPO 4 14.4g溶于900ml 去离子水后，调节pH 至7.4，定容到1L 。
ELISA检测试剂盒操作流程
ELISA检测试剂盒操作流程1.准备实验材料和试剂-检验样本：例如血清、尿液、细胞上清液等。
-ELISA试板：根据样本数量选择96孔或384孔的板。
- 试剂盒：包括标准品、washes缓冲液、检测抗体、底物等。
2.样本处理-对于血清等生物液体样本，可用离心将固体物质沉淀并分离下清液。
-样本需储存或运输途中应避免反复冻融。
3.实验板的板液处理-将实验板从包装中取出，将不需要的孔进行盖膜封闭。
- 根据试剂盒说明书，添加适量的板液（Coating Buffer）到每个孔中，使其充分覆盖孔内壁。
-封闭板液的孔，将实验板在2-8℃下放置静置一夜或在37℃下1-2小时孵育。
4.样本添加-倒掉盘液，用PBS或TBST洗板3次，去除残留物。
-将样本加到每个孔中，根据需要添加正样本、负样本和待测样本。
-注意每个样本的剂量和添加的体积，通过试剂盒说明书和实验设计标准控制。
5.抗体添加-清洗步骤同上，将洗板缓冲液加到孔中，重复3次。
-加入检测抗体，根据试剂盒说明书的建议将其添加到孔中。
-要确保抗体的浓度和添加的体积适宜。
6.洗涤-洗涤步骤同上，用洗涤缓冲液洗板，重复3次。
-每次洗涤时，将洗液完全加满孔，静置1分钟，然后倒出洗液。
-注意洗涤时间和洗涤次数的准确控制，以将非特异性结合物质彻底清除。
7.底物添加-清洗步骤同上，将洗液加到孔中，重复3次。
-加入底物，根据试剂盒说明书的建议将其添加到孔中。
-底物液体应完全覆盖孔底，防止反应过程中氧化。
8.反应停止-根据试剂盒说明书，将反应停止液加入到孔中，停止底物的反应。
-注意反应停止液的体积和浓度，以保证反应的准确停止。
9.色谱分析-用ELISA板读板仪读取各个孔的OD值。
-根据试剂盒说明书和实验设计的标准曲线确定样本中目标物质的含量。
-注意设置适当的控制组和标准曲线来保证测量结果的准确性。
总结：ELISA检测试剂盒的操作流程主要包括实验板处理、样本添加、抗体添加、洗涤、底物添加、反应停止和色谱分析。
博士德ELISA试剂盒一般操作流程
已稀释好的ABC和TMB显色液在加入酶标板孔前都应预先在37℃中平衡至少30分钟。
试剂或样品稀释时，切不可忘记混匀。
每次检测都应该做标准曲线。
用户须估计样品待测因子的含量，决定适当的稀释倍数。
1. 确定本次检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目，并增加1孔作为TMB空白显色孔。
总数=样品数+9；做双份检测时×2。
其余重包装好放如冰箱中。
2. 将1000pg/ml ，500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.3pg/ml，15.6pg/ml 的标准品各0.1ml依次加入一排7孔中，1孔只加样品稀释液的作为零孔。
对于人血清、血浆、体液、组织匀浆或细胞培养上清，直接加已用样品稀释液稀释的样品100μι。
3. 酶标板加上盖，37℃反应90分钟。
4. 反应后用自动洗板机吸去酶标板内的液体；或甩去酶标板内液体，再对着吸水纸拍几下。
不洗。
5. 将准备好的生物素抗人IL-2抗体工作液按每孔0.1ml依次加入。
（TMB空白显色孔除外）。
37℃反应60分钟。
6. 0.01M TBS或0.01M PBS洗涤3次，每次浸泡1分钟左右。
7. 将准备好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入（TMB空白显色孔除外）。
37℃反应30分钟。
8. 0.01M TBS或0.01M PBS洗涤5次，每次浸泡1-2分钟左右。
9. 按每孔90μι依次加入已在37℃平衡30分钟的TMB显色液，37℃避光反应8-12分钟（注意：显色时间供参考，因用户实验室条件差异，最佳显色时间会有所不同。
此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔差别不明显）。
10. 按每孔0.1ml依次加入TMB终止液，此时蓝色立转黄色。
11. 用酶标仪在450nm测定O.D.值。
显色的程度通过ELISA酶标检测仪测定光密度（OD：optical density）记录。
通过细胞因子的标准蛋白做已知浓度系列稀释，测出OD值后绘制出标准曲线，根据标准曲线可推算出标本中细胞因子的含量，一般使用计算机软件可以很快得到结果（博士德网站有下载）有两种设定空白对照的方案：（1）将TMB空白显色孔设为对照。
Elisa试剂盒操作方法
ELISA试剂盒操作方法Elisa试验广泛应用在免疫学检验的各领域中，那么Elisa试验有没有简单便捷的操作方法呢？ELISA试剂盒操作方法具体如下：ELISA试剂盒操作方法一:用于检测未知抗原的双抗体夹心法:1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。
在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。
次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。
（简称洗涤，下同）。
2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。
然后洗涤。
（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。
3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。
37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。
也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
ELISA试剂盒操作方法二：用于检测未知抗体的间接法：1.用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。
次日洗涤3次。
2.加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。
（同时做空白、阴性及阳性孔对照）3.于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。
4.于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟5.于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml6.可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。
ELISA操作流程及技术要点
编号 pg/mL
S7 2000
S6 1000
S5 500
S4 250
S3 125
S2 62.5
S1 31.25
S0 0
1. 2
洗液工作液
浓洗涤液按1:25倍用去离子水进行稀释。例如用量筒量取 240mL去离子水，倒入烧杯或其他洁净容器中，再量取10mL 浓洗涤液，均匀加入，搅拌混匀，在临用前配妥。浓洗涤 液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。
2
重要提示
1、实验开始前，请提前配置好所有试剂。试剂或样 本稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。 2、用户在初次使用试剂盒时，应将各种试剂管离心 数分钟，以便管盖和管壁上的液体集中到管底。 3、在配制标准品、检测溶液工作液时，请以相应的 稀释液配制，不能混淆。 4、因实际装量多于标示装量，配制工作试剂请用精 准的计量工具（移液枪或量筒等）量取，切勿不经量 取直接使用。 5、标准品、生物素标记抗体工作液、辣根过氧化物 酶标记亲和素工作液稀释前根据预先计算好的每次实 验所需的总量配制 ，实际配制时应多配制 0.1-0.4mL 。 请勿重复使用已稀释过的标准品、生物素标记抗体工 作液、或辣根过氧化物酶标记亲和素工作液。 6、标准品的稀释请勿于板中进行，标准品应于临用 前 15 分钟内配制。为保证实验有效性，建议每次实验 使用新的标准品。若保存得当，溶解后的标准品 S7 可 在 2-8 ℃保存， 7 天内使用有效。
4 、温育：为防止样本蒸发或污染，温育过程中酶标板必须 覆上板贴，实验过程中酶标板应避免处于干燥的状态。温育 过程中应随时观察温箱温度是否恒定于37℃，及时调整。温 育过程中，温箱不易开启太多次，以免影响温度平衡。 5 、洗涤：洗涤过程非常重要，不充分的洗涤易造成假阳性。 (1)手工洗板方法：吸去（不可触及孔壁和孔底）或甩掉 酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下 用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液按 200μL/孔注入孔内， 浸泡2分钟。根据操作步骤中所述，重复此过程数次。 (2)自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用 到正式实验过程中。 6 、显色：为保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应 尽快加入终止液。可在加入底物溶液后每隔一段时间观察一 下显色情况以控制反应时间（比如每隔10分钟）。当肉眼可 见标准品前3-4孔有明显梯度蓝色，后3-4孔显色不明显时， 即可加入终止液终止反应，此时蓝色立刻变为黄色。终止液 的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。 7 、底物溶液应为浅蓝色或无色，如果颜色严重变深则必须 弃用。底物溶液易受污染，请避光妥善保存。
ELISA方法详细过程及步骤
ELISA方法详细过程及步骤ELISA（酶联免疫吸附实验）是一种常用于测定生物样本中特定分子的定量方法。
它结合了免疫化学和酶学原理。
下面是对ELISA方法的详细过程及步骤的完整版说明：1.准备工作：首先，准备实验室材料，包括ELISA板、试剂、标样、洗涤液、试管、酶标板读取器等。
确保所有物品都是干净且无污染的。
2.涂覆抗原或抗体：将要测定的抗原或抗体在ELISA板的孔中涂覆。
可以将抗原或抗体溶液加入每个孔中，然后在37°C的恒温箱中孵育2到4个小时，以便其吸附在板上。
3.孔的封闭：将孔洗涤掉未吸附的物质，并用阻断液封闭孔，以防止非特异性结合。
4.样本和标准品的加入：将待测样本和不同浓度的标准品加入对应的孔中。
将ELISA板返回恒温箱，孵育一段时间，使样本和标准品中的抗原或抗体与固相相结合。
5.洗涤：将洗涤液加入孔中，用洗涤机或手动洗涤涡流器洗涤孔，以去除未结合的物质。
6.加入检测抗体：加入检测抗体，该抗体具有与待测物质结合的亲和性。
将ELISA板返回恒温箱进行孵育，使检测抗体与待测物质结合。
7.洗涤：重复第5步中的洗涤步骤，以去除未结合的检测抗体。
8.加入次级抗体：加入与检测抗体结合的二抗，通常是与酶结合的抗体。
这个二抗具有抗体结合和酶活性。
9.洗涤：重复第5步中的洗涤步骤，以去除未结合的次级抗体。
10.反应底物：加入染色底物，它通常是可以与酶发生反应并产生可见信号的底物。
11.反应停止：通过加入停止液，中止底物的反应并停止信号的产生。
12.读板：使用酶标板读取器，在特定波长下测量每个孔的吸光度。
这个吸光度与待测样本中目标物质的含量成正比。
13.数据分析：根据标准曲线，计算出待测样本中目标物质的浓度。
总结：ELISA方法是一种常用的免疫学定量方法，它可以用于测定生物样本中特定分子的含量。
在ELISA方法中，首先将待测物质（抗原或抗体）固定在ELISA板上，然后加入待测样本和标准品，进行孵育和洗涤的步骤，以去除未结合物质。
Elisa方法
ELISA试剂盒protocol
一.试剂准备：
使用前,将所以时间放置室温15min，可以缓慢的摇晃加速沉淀溶解，稀释的工作液，需要立即使用；
二.标准品准备：用Reagent Diluent稀释
三.实验方法
1．用PBS稀释Capture Antibody 至工作浓度，马上用100ul/孔稀释的抗体铺平板,密封平板至室温抚育过夜;
2．吸干平板,每孔用400ul Wash buffer清洗,反复洗三次,最后一次洗版,倒置平板,放置于吸水纸上,充分吸干剩余的Wash buffer;
3．每孔中加入300ul Reagent Diluent 封闭板子至少1h;
4．重复步骤2,此时板子可以用于检测样品;
5．加100ul样品,标准品/孔,封板,室温抚育2h;
6．重复步骤2的洗板子过程;
7．加100ul detection Antibody(预先稀释),封闭,室温抚育20min(避光)；
8．重复步骤2的洗板子过程;
9．加100ul Streptavidin‐HRP 工作液，封闭，室温抚育20min(避光)；
10．重复步骤2的洗板子过程;
11．加100ul Substrate solution,室温抚育20min(避光)
12. 加50ul stop solution,彻底混合；
13. 用450nm测OD，540nm，570nm可以做校准波长；。
ELISA操作流程
ELISA操作流程前处理1．匀浆样本：取一定量（约100—150g）的样本进行匀浆，匀浆样本以无颗粒状为为佳.样本匀浆好以后再利用称样勺搅拌样本,以充分混合不同个体的样本,达到均质的效果。
2．称量样本：利用0.01g当量的电子天平称量相应的样本重量，误差尽量控制在±0.02g,以提高结果的准确度。
样本直接称取到50ml离心管中。
称量的样本应尽量称取匀浆效果比较好的样品.3．加入提取液：在相应的样本中加入对应的提取溶剂，溶剂的体积在条件允许范围内尽量精确。
4．提取或萃取：加入相应的提取溶剂以后,拧紧离心管盖，利用涡旋仪充分振荡样品,以样本与提取液充分混合为准。
具体时间可参考说明书所提供的方法时间要求。
5．离心：把处理好的样品对称放置在离心机中，盖上离心机盖门，直到听到离心机盖门关闭声音，按“离心”键进行离心,离心时间一般设为5min，离心速度一般设为4500rpm/min。
如果样品离心效果不佳则可以加大离心力或延长离心时间再次离心。
6．移取液体:利用加样枪移取对应的的溶剂液体至另一个容器中；如果需要吹干浓缩的样品,则移取到干净干燥的玻璃管中；如果是取下层进行分析的样品则移取全部上层液体，利用下层进行分析。
移取液体的时候请注意避免移取到不相关的液体层，以免造成污染。
7．浓缩吹干：先利用甲醇把氮吹仪的针头进行润洗，具体方法是先打开空气压缩机的开头，先通以少量气流，把装有甲醇的容量浸泡针头前端，浸泡时间约1-2s即可。
润洗针头后，把装有样品的玻璃管放在下面水浴锅的相对应的固定夹子上，再打开气流阀门，以能感觉到气流声音为准,再缓慢把针头伸到液面上方，以吹动液面为限，在浓缩吹干过程中应不断调整针头的高度，以节省吹干时间。
吹干的样品以没有液体流动的判定依据，亦可在吹干后再吹大约2—3min左右。
严禁在没有吹干的情况下就取下样品进行下一步操作.8．复溶：加入对应的复溶工作液后,再加入相应的除杂溶剂，利用涡旋仪振荡溶解，此步骤时间不宜过长，大约10s左右即可。
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博士德ELISA试剂盒一般操作流程
点击次数：744 作者：博士德发表于：2009-03-26 16:03转载请注明来自丁香园
已稀释好的ABC和TMB显色液在加入酶标板孔前都应预先在37℃中平衡至少30分钟。
试剂或样品稀释时，切不可忘记混匀。
每次检测都应该做标准曲线。
用户须估计样品待测因子的含量，决定适当的稀释倍数。
1. 确定本次检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目，并增加1孔作为TMB空白显色孔。
总数=样品数+9；做双份检测时×2。
其余重包装好放如冰箱中。
2. 将1000pg/ml ，500pg/ml，250pg/ml，125pg/ml，62.5pg/ml，31.3pg/ml，15.6pg/ml的标准品各0.1 ml依次加入一排7孔中，1孔只加样品稀释液的作为零孔。
对于人血清、血浆、体液、组织匀浆或细胞培养上清，直接加已用样品稀释液稀释的样品100μι。
3. 酶标板加上盖，37℃反应90分钟。
4. 反应后用自动洗板机吸去酶标板内的液体；或甩去酶标板内液体，再对着吸水纸拍几下。
不洗。
5. 将准备好的生物素抗人IL-2抗体工作液按每孔0.1ml依次加入。
（TMB空白显色孔除外）。
37℃反应60分钟。
6. 0.01M TBS或0.01M PBS洗涤3次，每次浸泡1分钟左右。
7. 将准备好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入（TMB空白显色孔除外）。
37℃反应30分钟。
8. 0.01M TBS或0.01M PBS洗涤5次，每次浸泡1-2分钟左右。
9. 按每孔90μι依次加入已在37℃平衡30分钟的TMB显色液，37℃避光反应8-12分钟（注意：显色时间供参考，因用户实验室条件差异，最佳显色时间会有所不同。
此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔差别不明显）。
10. 按每孔0.1ml依次加入TMB终止液，此时蓝色立转黄色。
11. 用酶标仪在450nm测定O.D.值。
显色的程度通过ELISA酶标检测仪测定光密度（OD：optical dens ity）记录。
通过细胞因子的标准蛋白做已知浓度系列稀释，测出OD值后绘制出标准曲线，根据标准曲线可推算出标本中细胞因子的含量，一般使用计算机软件可以很快得到结果（博士德网站有下载）
有两种设定空白对照的方案：
（1）将TMB空白显色孔设为对照。
所有的标准品和样品的吸光值减去零孔的吸光值后，在坐标纸上画出曲线，以吸光值作为纵坐标，以浓度作为横坐标。
（2）将零孔设为对照。
得到的数据可以直接在坐标纸上画出曲线。
12. 根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。
应记住由于样品稀释了N倍，其实际浓度应该×N。