第六章微生物
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第六章微生物的生长及其控制
第六章微生物的生长及其控制微生物不论其在自然条件下还是在人为条件下发生作用，都是通过“以数取胜”或“以量取胜”。
生长和繁殖就是保证微生物获得巨大数量的必要前提。
微生物生长是指由于细胞成分的增加导致微生物的个体大小、群体数量或两者的增长。
个体细胞生长：细胞内组分的增加，导致细胞总量（体积、质量、大小）扩个体繁殖：是微生物个体生长到一定阶段，由于细胞结构的复制与重建并通由于微生物个体微小，以个体为对象研究其生长和繁殖十分不便，常以群体数量的变化来研究微生物的生长。
在微生物学中，凡说“生长”一般均指群体生长，这与研究大型生物有所不同。
群体生长：指在一定时间和条件下，微生物细胞总量的增加。
既有量变也有质变。
三者之间的关系：个体生长→个体繁殖→群体生长群体生长＝个体生长＋个体繁殖第一节测定生长繁殖的方法测定生长的方法是以原生质含量的增加为基础，测定繁殖是建立在计算个体数目上。
一、测生长量直接方法：测菌体细胞（数）量、菌体体积、菌体质量等；间接方法：根据细胞内某种物质的含量或某种代谢活动强度间接测定。
（一）直接法1、测体积这是一种粗放的方法。
将待测培养液放在刻度离心管中作自然沉降或离心沉降，观察其体积。
污泥沉降比（SV）：为含有污泥的混合液在量筒中静置30 min后所形成的沉淀污泥的容积占原混合液容积的百分数，以%表示。
又叫30 min沉淀率。
该参数是评定活性污泥质量的重要指标之一。
正常范围为15-30%。
2、称重此法的原理是根据每个细胞有一定的重量而设计的。
它可以用于单细胞、多细胞以及丝状体微生物生长的测定。
包括称干重（DCW）和湿重。
将一定体积的样品通过离心或过滤将菌体分离出来，经洗涤，再离心后直接称重，求出湿重。
如果是丝状体微生物，过滤后用滤纸吸去菌丝之间的自由水，再称重求出湿重。
不论是细菌样品还是丝状菌样品，可以将它们放在已知重量的平皿或烧杯内，于105℃烘干至恒重，取出放入干燥器内冷却，再称量，求出微生物干重。
第六章 微生物的生长及其控制1
获得同步生长的方法： 获得同步生长的方法：
同步培养法
诱导法
筛选法
化化化化 物物化化
过过过 区区区区区区区区过 膜膜膜过
获得同步生长的方法主要有两类： 获得同步生长的方法主要有两类：
环境条件诱导法：变换温度、光线、培养基等。 环境条件诱导法：变换温度、光线、培养基等。造成与正常细 胞周期不同的周期变化。 胞周期不同的周期变化。 机械筛选法：选择性过滤、梯度离心。物理方法，随机选择， 机械筛选法：选择性过滤、梯度离心。物理方法，随机选择， 不影响细胞代谢。 不影响细胞代谢。
☆以细菌为例介绍无分支单细胞微生物群体生长规律，其结 以细菌为例介绍无分支单细胞微生物群体生长规律， 论也基本适用于酵母菌。 论也基本适用于酵母菌。 ☆生长曲线代表了细菌在新的环境中从开始生长、分裂直至 生长曲线代表了细菌在新的环境中从开始生长、 死亡的整个动态变化过程。 死亡的整个动态变化过程。 ☆每种细菌都有各自的典型生长曲线，但它们的生长过程却 每种细菌都有各自的典型生长曲线， 有着共同的规律性。一般可以将生长曲线划分为四个时期。 有着共同的规律性。一般可以将生长曲线划分为四个时期。
二、以数量变化对微生物生长情况进行测定 （一）直接法
将待测样品制成菌悬液，适当稀释， 将待测样品制成菌悬液，适当稀释，加入血球计数板方 格网的计数室内，在显微镜下直接计数； 格网的计数室内，在显微镜下直接计数；因为计数室的 体积一定， 体积一定，所以能够计算出每毫升待测样品中的细胞个 数； 特点：全菌计数，不区分死菌与活菌； 特点：全菌计数，不区分死菌与活菌； 适用于单细胞微生物：细菌、酵母菌； 适用于单细胞微生物：细菌、酵母菌； 要点：菌悬液浓度应在 个细胞/毫升左右 毫升左右； 要点：菌悬液浓度应在108个细胞 毫升左右；
第六章微生物生长
第六章
微生物的生长与环境条件
目的要求： 1、微生物生长量的测定方式。 2、细菌纯培养生长曲线各个时期的主要特点。 3、物理因子，化学药物对微生物生长的影响。 重 点：
细菌纯培养生长曲线。 难 点：
如何利用细菌纯培养生长曲线的对数生长期来 计算细菌的代时和代数。
第一节 微生物的个体与群体生长和繁殖
利用选择培养基法
适用于分离某些生理类型较特殊 的微生物
三. 微生物生长的测定方法
评价培养条件、营养物质
微
等对微生物生长的影响；
生
物
评价不同的抗菌物质对微生物
生
产生抑制(或杀死)作用的效果；
长
客观地反映微生物生长的规律。
（一） 细胞数量的测定
1. 细胞总数的测定
(1) 显微镜直接计数法： 计数板法（如：血球计数板法、细胞计数板） 改进：用染色剂可区别死活细胞，如酵母用美蓝， 细菌用吖叮橙（紫外光）
3. 连续培养优缺点
1) 优点：
高效：简化了操作; 自控：便于各种仪表进行自动控制; 产品质量稳定; 节约大量动力、人力、水和蒸汽。
3. 连续培养优缺点
2) 缺点：
菌种易于退化； 易于遭到杂菌污染； 营养物利用率低于单批培养。 连续发酵，一般只能维持数月~ 1年。
二第. 获一得节 纯测培定养生的长繁方殖法的方法
在中等浓度下，增加养料浓度只提高最大收获量。
在高等浓度下，增加养料浓度不能对菌体生长速度和 最大收获量起促进作用。
（二）二次生长
当培养液中同时存在两种均能被微生物所利用的主 要营养物质时，微生物将首先利用其中较易利用的营 养物质开始生长。当较易利用的营养物质被消耗完， 进入稳定期后，微生物经过短暂的适应，开始利用第 二种营养物质，再次开始新的对数生长，并进入新的 稳定期，表现为二阶式的双峰生长曲线，称为二次生 长曲线（diauxic growth curve）.
微生物的生长与环境条件
目的要求： 1、微生物生长量的测定方式。 2、细菌纯培养生长曲线各个时期的主要特点。 3、物理因子，化学药物对微生物生长的影响。 重 点：
细菌纯培养生长曲线。 难 点：
如何利用细菌纯培养生长曲线的对数生长期来 计算细菌的代时和代数。
第一节 微生物的个体与群体生长和繁殖
利用选择培养基法
适用于分离某些生理类型较特殊 的微生物
三. 微生物生长的测定方法
评价培养条件、营养物质
微
等对微生物生长的影响；
生
物
评价不同的抗菌物质对微生物
生
产生抑制(或杀死)作用的效果；
长
客观地反映微生物生长的规律。
（一） 细胞数量的测定
1. 细胞总数的测定
(1) 显微镜直接计数法： 计数板法（如：血球计数板法、细胞计数板） 改进：用染色剂可区别死活细胞，如酵母用美蓝， 细菌用吖叮橙（紫外光）
3. 连续培养优缺点
1) 优点：
高效：简化了操作; 自控：便于各种仪表进行自动控制; 产品质量稳定; 节约大量动力、人力、水和蒸汽。
3. 连续培养优缺点
2) 缺点：
菌种易于退化； 易于遭到杂菌污染； 营养物利用率低于单批培养。 连续发酵，一般只能维持数月~ 1年。
二第. 获一得节 纯测培定养生的长繁方殖法的方法
在中等浓度下，增加养料浓度只提高最大收获量。
在高等浓度下，增加养料浓度不能对菌体生长速度和 最大收获量起促进作用。
（二）二次生长
当培养液中同时存在两种均能被微生物所利用的主 要营养物质时，微生物将首先利用其中较易利用的营 养物质开始生长。当较易利用的营养物质被消耗完， 进入稳定期后，微生物经过短暂的适应，开始利用第 二种营养物质，再次开始新的对数生长，并进入新的 稳定期，表现为二阶式的双峰生长曲线，称为二次生 长曲线（diauxic growth curve）.
第六章 微生物生长
恒化连续培养
随着细菌的生长，限制性因子的浓
度降低，致使细菌生长速率受限，但同 时通过自动控制系统来保持限制因子的 恒定流速，不断予以补充，就能使细菌 保持恒定的生长速率。 常见的限制性营养物质有作为氮源 的氨、氨基酸；作为碳源的葡萄糖、乳 酸及生长因子，无机盐等。
三、同步培养
微生物细胞极其微小，但它也有一个自小到大 的过程，即个体生长。要研究微生物的个体生 长，在技术上是极为困难的。 目前主要使用的方法是： 同步培养技术分析细胞各阶段的生物化学特性 变化。 电子显微镜观察细胞的超薄切片。
死亡原因？ 营养短缺；代谢毒物增 多；pH、Eh改变；溶氧 不足。
t
时间
稳定期与生产实践
指导思想：延长稳定期。 措施： 1.调节pH； 2.注意降温、通风； 3.中和排除有毒代谢产物； 4.稳定期是生产收获时期，注意把握好收获时机。
（4）衰亡期（老年）
死亡率＞出生率 ？ 细胞畸形 细胞死亡,出现自溶 有的微生物细胞产生或释放出一些产物。 如氨基酸、转化酶、抗生素等。现象。
单细胞微生物典型生长曲线
生 长 速 + 率 0 指 数 期
延滞期 指数期 稳定期 衰亡期
_
菌 数 目 的 对 数 值
延 滞 期
总菌数
稳定期
衰 亡 期
活菌数
0 时间t
微生物的数量很大，都是10的n次方，取对数作图时 方便，0-10代表1～1010
（1）延滞期－“万事开头难”
特征： 代谢活跃，个体体积、重量增加，
（2）指数期（青年）
快，平均代时（繁殖一代的时间）最短， 生长速率常数最大。 细胞的化学组成、形态、生理特性比较一致。
微生物学-第六章-微生物的代谢课件
G
6-磷酸-果糖
特征性酶 磷酸己糖酮解酶
4-磷酸-赤藓糖 + 乙酰磷酸
6-磷酸-果糖
5-磷酸-木酮糖 ，5-磷酸-核糖
戊糖酮解酶
乙酸
3--磷酸甘油醛+ 乙酰磷酸
乳酸
乙酸
1 G 乳酸 + 1.5乙酸 + 2.5 ATP
三、发酵（fermentantion）
1、定义
广义：利用微生物生产有用代谢一种生产方式。 狭义：厌氧条件下，以自身内部某些中间代谢
氧化氮还原酶
反硝化意义：
1）使土壤中的氮（硝酸盐NO3-）还原成氮气而消失，降低土壤的肥力；
2）反硝化作用在氮素循环中起重要作用。
硫酸盐呼吸（硫酸盐还原）
——厌氧时，SO42- 、SO32-、S2O32- 等为末端电 子受体的呼吸过程。
特点：
a、严格厌氧； b、大多为古细菌 c、极大多专性化能异氧型，少数混合型； d、最终产物为H2S；
用所需的硝酸盐还原酶A亚硝酸还原酶等 c 兼性厌氧 细菌：铜绿假单胞、地衣芽孢杆菌等。
硝酸盐作用
同化性硝酸盐作用：
NO3- NH3 - N R - NH2 异化性硝酸盐作用：
无氧条件下，利用NO3-为最终氢受体
NO3- NO2 NO N2O N2
硝酸盐还原酶
亚硝酸还原酶
氧化亚氮还原酶
a、a1、a2、a4、b、b1、c、c1、c4、c5、d、o等； 末端氧化酶：
cyt a1、a2、a3、d、o，H2O2酶、过氧化物酶；呼吸链组分多变 存在分支呼吸链：
细菌的电子传递链更短并P／O比更低，在电子传递链的几个位置进入链和 通过几个位置的末端氧化酶而离开链。 E.coli （缺氧） CoQ cyt.b556 cyt.o
第六章 微生物的生理特性1
微生物利用废水营养的情况
细菌往往优先利用易被吸收的有机物质。 如果这种物质的量已经满足要求，它就不再利 用其它的物质了。在工业废水的生物处理中， 常加入生活污水补充工业废水中某些营养物质 的不足。加多少酌情而定，否则反而会把细菌 养“娇”，不利于工业废水的处理。因为生活 污水中的有机物比工业废水中的有机物易被吸 收利用。
4、光能异养（photorganotroph)
属于这一营养类型的细菌很少，如红 螺菌中的一些细菌以这种方式生长。一般 来说，光能营养型细菌生长时大多需要 生长因子。 碳源——有机物作供氢体和碳源，要有CO2存在。 能源——光
红螺菌
光能 CH3 [CH2O] +2CH3COCH3+H2O CHOH CO2 ＋ 2 光合色素 CH3 红螺菌(Rhodospirillum sp．)属于光合细菌(Photosynthetic Bacteria，PSB)的一种，广泛分布于江河、湖泊、海洋等水域环境 中，尤其在有机物污染的积水处数量较多。
氧化还原电位又称氧化还原电势（redox potential），是度量 某氧化还原系统中的还原剂释放电子或氧化剂接受电子趋势 的一种指标，其单位是V（伏）或mV（毫伏）。
不同类型微生物生长对氧化还原电位的要求不同
好氧性微生物：+0.1伏以上时可正常生长,以+0.3～+0.4伏为宜； 厌氧性微生物：低于+0.1伏条件下生长； 兼性厌氧微生物：+0.1伏以上时进行好氧呼吸, +0.1伏以下时进行发酵。
α w=Pw/Pow 式中Pw代表溶液蒸汽压力, POw代表纯水蒸汽压力。
纯水α w为1.00,溶液中溶质越多, α w越小
微生物一般在α w为0.60～0.99的条件下生长, α w过低时, 微生物生长的迟缓期延长, 生长速率和总生长量减少。 微生物不同，其生长的最适α w不同。
第六章微生物代谢
TCA循环的重要特点
为糖类、脂类、蛋白质三大物质转化中心枢纽。 循环中的某些中间产物是一些重要物质生物合成的前体； 生物体提供能量的主要形式； 为人类利用生物发酵生产所需产品提供主要的代谢途径。如 柠檬酸发酵；Glu发酵等。
（二）递氢和受氢 经过上述4条途径脱氢后，通过呼吸链等方式 传递，最终可与氧、无机氧或有机物等氢受体相结
2、HMP途径
磷酸戊糖进一步代谢有两种结局：
①磷酸戊糖经转酮—转醛酶系催化，又生成磷酸己糖 和磷酸丙糖（3-磷酸甘油醛），磷酸丙糖借EMP途径 的一些酶，进一步转化为丙酮酸。称为不完全HMP途 径。
②由六个葡萄糖分子参加反应，经一系列反应，最后 回收五个葡萄糖分子，消耗了1分子葡萄糖（彻底氧化 成CO2 和水），称完全HMP途径。
CO2、H2O 还原型中间代谢 产物醇、酸 NO2、N2 次之 少
电子传递链
完整
不完整
无，底物水平磷 酸化
二、自养微生物产ATP和产还原力 按能量来源不同可分为:
化能自养型
光能自养型
（一）化能自养微生物 还原CO2所需要的ATP和[H]是通过氧化无机物而获得的
硝化细菌、铁细菌、硫细菌、氢细菌
自养微生物氧化磷酸化效率低
葡萄糖 磷酸二羟丙酮
②异型乳酸发酵
乙醇
ATP ADP NAD+ NADH
乙醛
乙酰CoA
NAD+ NADH
乙酰磷酸
葡萄糖
6-磷酸 葡萄糖
6-磷酸葡 5-磷酸 萄糖酸 -CO2 木酮糖 3-磷酸 -2H 甘油醛
2ADP 2ATP
乳酸
（3）Stickland反应
1934年Stickland发现Closterdium sporogenes（生孢梭菌）能 利用一些氨基酸同时作为碳源、氮源和能源， 以一种氨基酸作供氢体，以另一种氨基酸作为受氢体而实现 产能的独特发酵类型。 CH3 CHNH2 + 2 CH2NH2 COOH ADP+Pi
第6章-微生物的代谢
新陈代谢 = 分解代谢 + 合成代谢 分解代谢：指复杂的有机物分子通过分解代谢酶系 的催化，产生简单分子、腺苷三磷酸（ATP）形式 的能量和还原力的作用。
合成代谢：指在合成代谢酶系的催化下，由简单小 分子、ATP形式的能量和还原力一起合成复杂的大 分子的过程。
合成代谢按产物在机体中作用不同分： 初级代谢： 提供能量、前体、结构物质等生命活动所 必须的代谢物的代谢类型；产物：氨基酸、核苷酸等。 次级代谢： 在一定生长阶段出现非生命活动所必需的代 谢类型；产物：抗生素、色素、激素、生物碱等。
•反应步骤简单，产能效率低.
• 此途径可与EMP途径、HMP途径和TCA循环相连接， 可互相协调以满足微生物对能量、还原力和不同中间 代谢物的需要。好氧时与TCA循环相连，厌氧时进行 乙醇发酵.
相关的发酵生产：细菌酒精发酵
葡萄糖三条降解途径在不同微生物中的分布
菌名 酿酒酵母 产朊假丝酵母 灰色链霉菌 产黄青霉 大肠杆菌 铜绿假单胞菌 嗜糖假单胞菌 枯草杆菌 氧化葡萄糖杆菌 真养产碱菌 运动发酵单胞菌 藤黄八叠球菌
氧被消耗而造成局部的厌氧环境
硝酸盐还原细菌进行厌氧呼吸
土壤中植物能利用的氮 （硝酸盐NO3-）还原成 氮气而消失，从而降低 了土壤的肥力。
松土，排除过多的水分， 保证土壤中有良好的通 气条件。
反硝化作用在氮素循环中的重要作用
硝酸盐是一种容易溶解于水的物质， 通常通过水从土壤流入水域中。如果 没有反硝化作用，硝酸盐将在水中积 累，会导致水质变坏与地球上氮素循 环的中断。
2、 HMP途径 (戊糖磷酸途径)
（Hexose Monophophate Pathway）
葡萄糖经转化成6磷酸葡萄糖酸后， 在6-磷酸葡萄糖酸 脱氢酶的催化下， 裂解成5-磷酸戊糖 和CO2。
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3.间歇灭菌法: 又称分段灭菌法或丁达尔灭菌法。适用于不耐热培养基 的灭菌。方法是: 将待灭菌的培养基放在 80 ～100℃下蒸煮 15～60 min , 以杀灭其中所有的微生物营养体, 然后放至室温或 37℃下保温过 夜, 诱使其中残存的芽孢发芽, 第二天再以同法蒸煮和保温过夜, 如此连 续重复 3 天即可在较低的灭菌温度下同样达到彻底灭菌的良好效果。 4常规加压蒸气灭菌法: 一般称作“高压蒸气灭菌法”, 但因其压力范围 甚低， 故改用“加压”两字更合适。这是一种利用高温进行湿热灭菌的 方法, 优点是操作简便、效果可靠, 故被广泛使用。
外界不良条件如 NaCl 溶液浓度、温度和抗生素等理、化因素反应敏 感。 影响延滞期长短的因素很多, 除菌种外, 主要有 3 种:
1.接种龄 指接种物或种子的生长年龄, 即它生长到生长曲线上哪一阶段 时用来作种子的。这是指某一群体的生理年龄。实验证明, 如果以对数 期接种龄的种子接种, 则子代培养物的延滞期就短; 反之, 如以延滞期或 衰亡期的种子接种则子代培养物的延滞期就长; 如果以稳定期的种子接 种, 则延滞期居中。
指数期的微生物因其具有整个群体的生理特性较一致、细胞各成分平衡 增长和生长速率恒定等优点, 故是用作代谢、生理等研究的良好材料, 是 增殖噬菌体的最适宿主, 也是发酵工业中用作种子的最佳材料 稳定期 稳定期又称恒定期或最高生长期。 其特点是生长速率常数 R 等于零, 即处于新繁殖的细胞数与衰亡的细 胞数相等, 或正生长与负生长相等的动态平衡之中。这时的菌体产量达 到了最高点, 而且菌体产量与营养物质的消耗间呈现出有规律的比例关 系, 进入稳定期时, 细胞内开始积聚糖原、异染颗粒和脂肪等内含物; 芽孢杆 菌一般在这时开始形成芽孢; 有的微生物在这时开始以初生代谢物作前 体, 通过复杂的次生代谢途径合成抗生素等对人类有用的各种次生代谢 物。所以, 次生代谢物又称稳定期产物。由此还可对生长期进行另一种 分类, 即以指数期为主的菌体生长期和以稳定期为主的代谢产物合成 期。
采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁 殖能力的措施, 称为灭菌, 灭菌实质上还可分杀菌( bacteriocidation) 和溶菌( bacteriolysis) 两种, 前 者指菌体虽死, 但形体尚存; 后者指菌体被杀死后, 其细胞因发生自 溶、裂解等而消失的现象 消毒：是采用较温和的理化因素, 仅杀死物体表面或内部一部分对人体 或动、植物有害的病原菌,而对被消毒的对象基本无害的措施 1. 干热灭菌法(dry heat sterilization)
以几何级数增长的时期。
指数期的特点是: ①生长速率常数R最大, 因而细胞每分裂一次所需的时 间--代时，或原生质增加一倍所需的倍增时间最短; ②细胞进行平衡生 长, 故菌体各部分的成分十分均匀; ③酶系活跃, 代谢旺盛。 影响指数期微生物代时长短的因素很多, 主要是:
①菌种: 不同 菌种其代时差别极大, ②营养成分: 同一种微生物, 在营养丰富的培养基上生长时, 其代时较短, 反之则长
第六章 纯培养(pure culture)——微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经 过培养繁殖而得到的后代,称纯培养. 纯培养的方法：见PPT第七章里的第七张 稀释倒平板法 首先将待分离的样品进行连续稀释,目的是得到高度稀释的效果,使一支 试管中分配不到一个微生物.如果经过稀释后的大多数试管中没有微生 物生长,那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是由一个微生物 个体繁殖而来的纯培养物. 这种方法适合于细胞较大的微生物. 平板划线分离法 分区划线（适用于浓度较大的样品） 连续划线（适用于浓度较小的样品） 选择培养基分离法 倾注平板法 平板涂布分离法 简单易行，但易造成机械损伤 单细胞（单孢子）分离法 要在显微镜下进行 倾注平板法 比较常用的方法,但对热敏感菌及严格耗氧菌不太适合.
典型的生长曲线：课本153 典型生长曲线粗分为延滞期、指数期、稳定期和衰亡期等 4 个时期 延滞期：延滞期又称停滞期、调整期或适应期。指少量单细胞微生物接 种到新鲜培养液中后,在开始培养的一段时间内, 因代谢系统适应新环境 的需要, 细胞数目没有增加的一段时期。
该期的特点为: ①生长速率常数为零; ②细胞形态变大或增长, 许多杆菌可长成丝状③ 细胞内的 RNA 尤其是 rRNA 含量增高, 原生质呈嗜碱性; ④合成代谢 十分活跃, 核糖体、酶类和 ATP 的合成加速, 易产生各种诱导酶; ⑤对
第七章
什么叫杂交育种及其理论基础与区别 诱变育种的整个过程 诱变育种是指利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞 群, 在促进其突变率显著提高的基础上, 采用简便、快速和高效的筛选 方法, 从中挑选出少数符合目的的突变株, 以供科学实验或生产实践使 用。
表型( phenotype ) 指某一生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总 和, 是其遗传型在合适环境条件下通过代谢和发育而得到的具体体现。 所以, 它与遗传型不同, 是一种现实性。 饰变(modification) 指外表的修饰性改变, 即一种不涉及遗传物质结构改 变而只发生在转录、转译水平上的表型变化。特点是整个群体中的几乎 每一个体都发生同样变化; 性状变化的幅度小; 因其遗传物质未变, 故饰 变是不遗传的。 模式生物特性： 物种与代谢类型的多样性; 个体的体制极其简单; 营养体一般都是单倍 体; 易于在成分简单的组合培养基上大量生长繁殖; 繁殖速度快; 易于 积累不同的中间代谢物或终产物; 菌落形态的可见性与多样性; 环境条 件对微生物群体中各个体作用的直接性和均一性; 易于形成营养缺陷型 突变株; 各种微生物一般都有其相应的病毒; 以及存在多种处于进化过 程中、富有特色的原始有性生殖方式等 质粒：凡游离于原核生物核基因组以外, 具有独立复制能力的小型共 价闭合环状的dsDNA分子, 即cccDNA ①与筛选营养缺陷型突变株有关的3 类培养基: 基本培养基: 仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需要的最低成分的 组合培养基, 称基本培养基。 完全培养基: 凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培 养基, 称完全培养基。 补充培养基 : 凡只能满足相应的营养缺陷型突变株生长需要的组合或半
PH调节：
过酸时: 加 NaOH、Na2 CO3 等碱液中和
“治标”
过碱时: 加 H2 SO4 、HCl 等酸液中和
过酸时 加适当氮源:
加尿
素、NaNO3 、NH4 OH 或蛋白质等
提高通气量
Байду номын сангаас
“治本”
柠檬酸或油脂等 灭菌( sterilization)：
过碱时 加适当碳源: 加糖、乳酸、醋酸、 降低通气量
出现延滞期的原因, 是由于接种到新鲜培养液的种子细胞中, 一时还缺 乏分解或催化有关底物的酶或辅酶, 或是缺乏充足的中间代谢物。为产 生诱导酶或合成有关的中间代谢物, 就需要有一段用于适应的时间, 此 即延滞期。
指数期：指数期又称对数期( logarithmic phase ) , 指在生长曲线中, 紧接 着延滞期的一段细胞数
衰亡期( decline phase 或 death phase)
在衰亡期中, 微生物的个体死亡速度超过新生速度, 整个群体呈现负生长 状态。这时, 细胞形态发生多形化, 例如会发生膨大或不规则的退化形 态; 有的微生物因蛋白水解酶活力的增强而发生自溶( autolysis) ; 有的微 生物在这期会进一步合成或释放对人类有益的抗生素等次生代谢物; 而 在芽孢杆菌中, 往往在此期释放芽孢; 等等。 产生衰亡期的原因主要是外界环境对继续生长越来越不利, 从而引起细 胞内的分解代谢明显超过合成代谢, 继而导致大量菌体死亡。
稳定期到来的原因是: ①营养物尤其是生长限制因子的耗尽; ②营养物的 比例失调
稳定期的生长规律对生产实践有着重要的指导意义, 例如, 对以生产菌体 或与菌体生长相平行的代谢产物(SCP、乳酸等)为目的的某些发酵生产 来说, 稳定期是产物的最佳收获期;对维生素、碱基、氨基酸等物质进行 生物测定(bioassay) 来说, 稳定期是最佳测定时期; 此外,通过对稳定期到 来原因的研究, 还促进了连续培养原理的提出和工艺、技术的创建
湿热灭菌法是指用 100℃以上的加压蒸气进行灭菌。在同样温度和相同 作用时间下, 湿热灭菌法比干热灭菌法更有效, 原因是湿热蒸气不但透射 力强, 而且还能破坏维持蛋白质空间结构和稳定性的氢键, 从而加速这一 重要生命大分子物质的变性。 在湿热温度下, 多数细菌和真菌的营养细胞在 60℃左右处理 5 ～10 min 后即被杀死,酵母菌细胞和真菌的孢子稍耐热些, 要在 80℃下才被杀死, 细菌的芽孢最耐热, 一般要在120℃下处理 15 min 才被杀死。 ①巴氏消毒法: 因最早由法国微生物学家巴斯德用于果酒消毒, 故名。 这是一种专用于牛奶、啤酒、果酒或酱油等不宜进行高温灭菌的液态 风味食品或调料的低温消毒方法。此法可杀灭物料中的无芽孢病原菌 , 又不影响其原有风味。巴氏消毒法是一种低温湿热消毒法, 处理温度变 化很大, 一般在 60～85℃处理 30 min 至 15 s。具体方法可分两类: 第一 类是经典的低温维持法, 例如用于牛奶消毒只要在 63℃下维持 30 min 即可; 第二 类是较现代的高温瞬时法, 用此法作牛奶消毒时只要在 72℃ 下保持 15 s。 ②煮沸消毒法: 采用在 100℃下煮沸数分钟的方法, 一般用于饮用水的消 毒。
2.接种量 接种量的大小明显影响延滞期的长短。一般说来, 接种量大, 则延滞期 短, 反之则长因此, 在发酵工业上, 为缩短延滞期以缩短生产 周期, 通常都采 用较大的接种量( 种子∶发酵培养基 = 1∶10 , V/ V ) 。
3.培养基成分 接种到营养丰富的天然培养基中的微生物, 要比接种到营 养单调的 组合培养基中的延滞期短。所以, 一般要求发酵培养基的成分 与种子培养基的成分尽量 接近, 且应适当丰富些。
其原理是: 将待灭菌的物件放置在盛有适量水的专用加压灭菌锅内, 盖 上锅盖, 并打开排气阀, 通过加热煮沸, 让蒸气驱尽锅内原有的空气, 然 后关闭锅盖上的阀门, 再继续加热, 使锅内蒸气压逐渐上升, 随之温度也 相应上升至 100℃以上。为达到良好的灭菌效果, 一般温度应达到 121℃, 时间维持 15～20 min。有时为防止培养基内葡萄糖等成分的破 坏, 也可采用在较低温度下维持 35 min 的方法。加压蒸气灭菌法适合 于一切微生物学实验室、医疗保健机构或发酵工厂中对培养基及多种器
外界不良条件如 NaCl 溶液浓度、温度和抗生素等理、化因素反应敏 感。 影响延滞期长短的因素很多, 除菌种外, 主要有 3 种:
1.接种龄 指接种物或种子的生长年龄, 即它生长到生长曲线上哪一阶段 时用来作种子的。这是指某一群体的生理年龄。实验证明, 如果以对数 期接种龄的种子接种, 则子代培养物的延滞期就短; 反之, 如以延滞期或 衰亡期的种子接种则子代培养物的延滞期就长; 如果以稳定期的种子接 种, 则延滞期居中。
指数期的微生物因其具有整个群体的生理特性较一致、细胞各成分平衡 增长和生长速率恒定等优点, 故是用作代谢、生理等研究的良好材料, 是 增殖噬菌体的最适宿主, 也是发酵工业中用作种子的最佳材料 稳定期 稳定期又称恒定期或最高生长期。 其特点是生长速率常数 R 等于零, 即处于新繁殖的细胞数与衰亡的细 胞数相等, 或正生长与负生长相等的动态平衡之中。这时的菌体产量达 到了最高点, 而且菌体产量与营养物质的消耗间呈现出有规律的比例关 系, 进入稳定期时, 细胞内开始积聚糖原、异染颗粒和脂肪等内含物; 芽孢杆 菌一般在这时开始形成芽孢; 有的微生物在这时开始以初生代谢物作前 体, 通过复杂的次生代谢途径合成抗生素等对人类有用的各种次生代谢 物。所以, 次生代谢物又称稳定期产物。由此还可对生长期进行另一种 分类, 即以指数期为主的菌体生长期和以稳定期为主的代谢产物合成 期。
采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁 殖能力的措施, 称为灭菌, 灭菌实质上还可分杀菌( bacteriocidation) 和溶菌( bacteriolysis) 两种, 前 者指菌体虽死, 但形体尚存; 后者指菌体被杀死后, 其细胞因发生自 溶、裂解等而消失的现象 消毒：是采用较温和的理化因素, 仅杀死物体表面或内部一部分对人体 或动、植物有害的病原菌,而对被消毒的对象基本无害的措施 1. 干热灭菌法(dry heat sterilization)
以几何级数增长的时期。
指数期的特点是: ①生长速率常数R最大, 因而细胞每分裂一次所需的时 间--代时，或原生质增加一倍所需的倍增时间最短; ②细胞进行平衡生 长, 故菌体各部分的成分十分均匀; ③酶系活跃, 代谢旺盛。 影响指数期微生物代时长短的因素很多, 主要是:
①菌种: 不同 菌种其代时差别极大, ②营养成分: 同一种微生物, 在营养丰富的培养基上生长时, 其代时较短, 反之则长
第六章 纯培养(pure culture)——微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经 过培养繁殖而得到的后代,称纯培养. 纯培养的方法：见PPT第七章里的第七张 稀释倒平板法 首先将待分离的样品进行连续稀释,目的是得到高度稀释的效果,使一支 试管中分配不到一个微生物.如果经过稀释后的大多数试管中没有微生 物生长,那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是由一个微生物 个体繁殖而来的纯培养物. 这种方法适合于细胞较大的微生物. 平板划线分离法 分区划线（适用于浓度较大的样品） 连续划线（适用于浓度较小的样品） 选择培养基分离法 倾注平板法 平板涂布分离法 简单易行，但易造成机械损伤 单细胞（单孢子）分离法 要在显微镜下进行 倾注平板法 比较常用的方法,但对热敏感菌及严格耗氧菌不太适合.
典型的生长曲线：课本153 典型生长曲线粗分为延滞期、指数期、稳定期和衰亡期等 4 个时期 延滞期：延滞期又称停滞期、调整期或适应期。指少量单细胞微生物接 种到新鲜培养液中后,在开始培养的一段时间内, 因代谢系统适应新环境 的需要, 细胞数目没有增加的一段时期。
该期的特点为: ①生长速率常数为零; ②细胞形态变大或增长, 许多杆菌可长成丝状③ 细胞内的 RNA 尤其是 rRNA 含量增高, 原生质呈嗜碱性; ④合成代谢 十分活跃, 核糖体、酶类和 ATP 的合成加速, 易产生各种诱导酶; ⑤对
第七章
什么叫杂交育种及其理论基础与区别 诱变育种的整个过程 诱变育种是指利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞 群, 在促进其突变率显著提高的基础上, 采用简便、快速和高效的筛选 方法, 从中挑选出少数符合目的的突变株, 以供科学实验或生产实践使 用。
表型( phenotype ) 指某一生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总 和, 是其遗传型在合适环境条件下通过代谢和发育而得到的具体体现。 所以, 它与遗传型不同, 是一种现实性。 饰变(modification) 指外表的修饰性改变, 即一种不涉及遗传物质结构改 变而只发生在转录、转译水平上的表型变化。特点是整个群体中的几乎 每一个体都发生同样变化; 性状变化的幅度小; 因其遗传物质未变, 故饰 变是不遗传的。 模式生物特性： 物种与代谢类型的多样性; 个体的体制极其简单; 营养体一般都是单倍 体; 易于在成分简单的组合培养基上大量生长繁殖; 繁殖速度快; 易于 积累不同的中间代谢物或终产物; 菌落形态的可见性与多样性; 环境条 件对微生物群体中各个体作用的直接性和均一性; 易于形成营养缺陷型 突变株; 各种微生物一般都有其相应的病毒; 以及存在多种处于进化过 程中、富有特色的原始有性生殖方式等 质粒：凡游离于原核生物核基因组以外, 具有独立复制能力的小型共 价闭合环状的dsDNA分子, 即cccDNA ①与筛选营养缺陷型突变株有关的3 类培养基: 基本培养基: 仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需要的最低成分的 组合培养基, 称基本培养基。 完全培养基: 凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培 养基, 称完全培养基。 补充培养基 : 凡只能满足相应的营养缺陷型突变株生长需要的组合或半
PH调节：
过酸时: 加 NaOH、Na2 CO3 等碱液中和
“治标”
过碱时: 加 H2 SO4 、HCl 等酸液中和
过酸时 加适当氮源:
加尿
素、NaNO3 、NH4 OH 或蛋白质等
提高通气量
Байду номын сангаас
“治本”
柠檬酸或油脂等 灭菌( sterilization)：
过碱时 加适当碳源: 加糖、乳酸、醋酸、 降低通气量
出现延滞期的原因, 是由于接种到新鲜培养液的种子细胞中, 一时还缺 乏分解或催化有关底物的酶或辅酶, 或是缺乏充足的中间代谢物。为产 生诱导酶或合成有关的中间代谢物, 就需要有一段用于适应的时间, 此 即延滞期。
指数期：指数期又称对数期( logarithmic phase ) , 指在生长曲线中, 紧接 着延滞期的一段细胞数
衰亡期( decline phase 或 death phase)
在衰亡期中, 微生物的个体死亡速度超过新生速度, 整个群体呈现负生长 状态。这时, 细胞形态发生多形化, 例如会发生膨大或不规则的退化形 态; 有的微生物因蛋白水解酶活力的增强而发生自溶( autolysis) ; 有的微 生物在这期会进一步合成或释放对人类有益的抗生素等次生代谢物; 而 在芽孢杆菌中, 往往在此期释放芽孢; 等等。 产生衰亡期的原因主要是外界环境对继续生长越来越不利, 从而引起细 胞内的分解代谢明显超过合成代谢, 继而导致大量菌体死亡。
稳定期到来的原因是: ①营养物尤其是生长限制因子的耗尽; ②营养物的 比例失调
稳定期的生长规律对生产实践有着重要的指导意义, 例如, 对以生产菌体 或与菌体生长相平行的代谢产物(SCP、乳酸等)为目的的某些发酵生产 来说, 稳定期是产物的最佳收获期;对维生素、碱基、氨基酸等物质进行 生物测定(bioassay) 来说, 稳定期是最佳测定时期; 此外,通过对稳定期到 来原因的研究, 还促进了连续培养原理的提出和工艺、技术的创建
湿热灭菌法是指用 100℃以上的加压蒸气进行灭菌。在同样温度和相同 作用时间下, 湿热灭菌法比干热灭菌法更有效, 原因是湿热蒸气不但透射 力强, 而且还能破坏维持蛋白质空间结构和稳定性的氢键, 从而加速这一 重要生命大分子物质的变性。 在湿热温度下, 多数细菌和真菌的营养细胞在 60℃左右处理 5 ～10 min 后即被杀死,酵母菌细胞和真菌的孢子稍耐热些, 要在 80℃下才被杀死, 细菌的芽孢最耐热, 一般要在120℃下处理 15 min 才被杀死。 ①巴氏消毒法: 因最早由法国微生物学家巴斯德用于果酒消毒, 故名。 这是一种专用于牛奶、啤酒、果酒或酱油等不宜进行高温灭菌的液态 风味食品或调料的低温消毒方法。此法可杀灭物料中的无芽孢病原菌 , 又不影响其原有风味。巴氏消毒法是一种低温湿热消毒法, 处理温度变 化很大, 一般在 60～85℃处理 30 min 至 15 s。具体方法可分两类: 第一 类是经典的低温维持法, 例如用于牛奶消毒只要在 63℃下维持 30 min 即可; 第二 类是较现代的高温瞬时法, 用此法作牛奶消毒时只要在 72℃ 下保持 15 s。 ②煮沸消毒法: 采用在 100℃下煮沸数分钟的方法, 一般用于饮用水的消 毒。
2.接种量 接种量的大小明显影响延滞期的长短。一般说来, 接种量大, 则延滞期 短, 反之则长因此, 在发酵工业上, 为缩短延滞期以缩短生产 周期, 通常都采 用较大的接种量( 种子∶发酵培养基 = 1∶10 , V/ V ) 。
3.培养基成分 接种到营养丰富的天然培养基中的微生物, 要比接种到营 养单调的 组合培养基中的延滞期短。所以, 一般要求发酵培养基的成分 与种子培养基的成分尽量 接近, 且应适当丰富些。
其原理是: 将待灭菌的物件放置在盛有适量水的专用加压灭菌锅内, 盖 上锅盖, 并打开排气阀, 通过加热煮沸, 让蒸气驱尽锅内原有的空气, 然 后关闭锅盖上的阀门, 再继续加热, 使锅内蒸气压逐渐上升, 随之温度也 相应上升至 100℃以上。为达到良好的灭菌效果, 一般温度应达到 121℃, 时间维持 15～20 min。有时为防止培养基内葡萄糖等成分的破 坏, 也可采用在较低温度下维持 35 min 的方法。加压蒸气灭菌法适合 于一切微生物学实验室、医疗保健机构或发酵工厂中对培养基及多种器