量反应平行线法在溶栓胶囊蚓激酶效价测定方法学研究中的应用_董培智

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二部附录 X I V 中生物检定统计法的 量反应平行线 测定法计算效价及实验误差 。 标准曲线法是以对照 品点样量 ( U ) 对数为横坐标 , 溶圈面积对数为纵坐 标求回归方程 。 在标准曲线上计算不同稀释度下供 试品的效价单位 。 3 结果 3. 1 耐用性试验 3. 1. 1 不同琼脂糖对试验结果的影响 按照效价 测定 方法测 定 20080101, 20060301 批溶 栓胶囊 效 价 , 分别 用 2 个批 号 的琼 脂 糖铺 板 , 结 果批 号 为 848674以及批号为 848678 的琼脂糖测定 2 批样品 -1 效价分别为 665, 702, 676, 684 U ·m g , 所测 2 批 制剂效价差异较小 , 说明不同批号的琼脂糖对本法 测定干扰较小 。 3. 1. 2 不同纤维蛋白原对实验结果的影响 分别 用 2 个批号的纤维蛋白原 , 按照本文检测的方法检 测 20070902 批溶栓胶囊效价 , 用 2 种方法统计计算 供试品效价 , 即原标准的直接测定溶圈直径法和标 准曲线法 , 结果见表 1。
品添加至阴性对照溶液 , 制备空白回收样品 。 按正 文效价测定方法测定 , 结果在阴性对照样品处未出 现溶圈 , 而空白回收样品处溶圈与样品一致 。 证明 在本法条件下 , 阴性对照无干扰 。 3. 3 线性范围 取蚓激酶对照品加生理盐水 , 制成每 1 μ L 含蚓 激酶为 10, 2. 5, 0. 625 U的对照品溶液 。 分别精密 吸取上述 10 U · μ L 对照品溶液 40, 20, 10 μ L 和 上述 2. 5, 0. 625 U ·μ L 对照品溶液 20, 20 μ L 点 样 , 测定溶圈面积 。 以点样量 ( U ) 为横坐标 , 溶圈面 积为纵坐标 求得回 归方程 。 点样 量在 12. 5 ～ 400 U , 回归方程 Y=103. 0 +0. 941X , R =0. 969。 点样 量在 50 ～ 400 U , 回归方程 Y= 128. 7+ 0. 853X , R= 0. 990。 以点样量 ( U ) 的对数为横坐标 , 溶圈面积的 对数为纵坐 标求得 回归方 程 Y= 1. 368 +0. 491X , R= 0. 981 。 从线性范围和线性两方面考虑 , 本方法 · 1411·
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操作简便 , 容易推广 , 文献 [ 6] 用组织纤维蛋白溶酶 原激活剂 ( T P A ) 作为对照品 , 无法统一和比较不同 蚓激酶制品的效价 。 本研究对琼脂糖 纤维蛋白平 板法做了改进 , 并引入对照品和量反应平行线法计 算效价 , 对 影响 因素 进行 控制 , 按 照 《中 国药 典 》 2005 年版
第 35 卷第 11期 2010 年 6月
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量反应平行线法在溶栓胶囊蚓激酶效价 测定方法学研究中的应用
董培智 , 朴晋华
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, 党爱华 , 王婷婷 , 张蕻 , 张志伟
直接测定法 平均值 237 198 218 S D /m m
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表 1 不同纤维蛋白原对溶栓胶囊效价的测定
N o . 200232 200736 合计
R S D /% 9. 20 1. 70 8. 3
29. 5 17 30. 6
62. 9 13 59. 7
从效价数据来看 , 按照原标准中方法测定的溶 圈直径的变异较大 , 2 批纤维蛋白原测定效价结果 的 R S D 分别为 12. 4%, 8 . 6%, 而用标准曲线法计算 效价结果的 R S D 分别为 9. 2%, 1. 7 %。 不考虑纤维 蛋白原批次 , 前者 R S D 14%, 后者 R S D 8. 3%。 从 变异系数的角度考虑 , 标准曲线法计算效价较直接 测定法好 。 2 批纤维蛋白原测定结果比较 , 200232 批纤维 蛋白原 用 2 种 方法 测 定 结果 R S D分 别 为 12%, 9. 2%; 200736 批 纤维 蛋 白 原 2 种方 法 测 定结 果 R S D 分别为 8. 6%, 1. 7%。 批号 200736 的纤维蛋 白原测定结果变异较小 。 3. 2 专属性 取去除处方中原料地龙冻干粉外的组方 , 按正 文中制法制成阴性对照样品 , 按供试液制备方法制 备成阴性对照溶液 , 同法将与样品含量一致的对照
标准曲线法 R S D /% 12. 40 8. 60 14. 1 平均值 684 764 724
1 S D /U ·m g
凝血酶溶液 0. 6m L , 立即混匀 , 快速倒入 2 个直径 7. 5c m 培养皿中 , 室温水平放置 30 m i n , 打孔 。 2. 4 培养测定 精密量取不同浓度的蚓激酶对照品溶液及供试 品溶液各 10 μ L , 分别点在同一平皿中 , 加盖 , 置 37 ℃恒温箱中 18 h 。 取出后用卡 尺测量溶圈垂直直 径 , 计算溶圈面积的对数和蚓激酶单位数的对数 。 2. 5 数据处理分析 量反应平行线测定法照 《中国药典 》 2005 年版
溶栓 胶囊 为 鲜 地龙 经 适 宜加 工 方 法制 成 的 肠溶胶囊 , 其主要 功能为清 热定惊 , 活血通 络 , 用 于中风 半身 不 遂 、肢 体 麻木 , 高血 压 症 。 原 药 品 标准收载 于 新药 转正 标 准第 19 册 , 其效 价 用 纤维蛋白 平板测定 , 结 果以溶 圈直径 表示 。 缺 点 是纤维蛋 白平板呈半固 体状态 , 测量溶 圈直径 较 困难 ; 溶圈易受试剂批次和不同实验条件的影 响; 而且用直径表 示效价 无法与 其他含 蚓激酶 产 品的效价 比较 。 蚓激酶是从新鲜地龙中提取的水解蛋白酶 , 具 有直接和间接溶解纤维蛋白的作用 。 目前 , 其效价 或活性测定有多种方法 : 对甲苯磺酰 L 精 氨酸甲酯 ( T A M E ) 法
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点样量在 50 ～ 400 U , 适合用单对数模型计算 , 点样 量在 50 ～ 400 U 线性关系较好 , R = 0. 990。 3. 4 供试品处理方法研究 3. 4. 1 不同溶剂提取考察 原标准用生理盐水加 明胶溶液提取蚓激酶 , 笔者将 0. 9%氯化钠溶液和 生理盐水加明胶溶液提取供试品的实验结果进行比 较 , 时间固定为 1 h , 按照测定方法 , 结果生理盐水加 -1 明胶溶液提取液测定效价为 780 U ·m g , 0. 9% 氯 化钠溶液提取液测定效价为 773 U ·m g 。 生理盐水加明胶溶液和 0. 9%氯化钠溶液提取 蚓激酶测定差别较小 , 从节约试剂和方法简便的角 度考虑 , 选择 0. 9 %氯化钠溶液为溶剂来提取供试 品中的蚓激酶 。 3. 4. 2 提取时间考察 原标准对提取时间没有规 定 , 试验采用不同超声提取时间来对蚓激酶的提取 效果进行考察 。 方法同测定方法 , 结果 0. 5h 提取 液测定效价为 730 U ·m g, 1h 提取液测定效价为 869 U ·m g 。 超声提取 1 h 测定的蚓激酶效价较提取 0. 5h 高 。 建议本法采用超声提取 1 h 的条件来提取供试
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有关方法学验证要求 , 对效价测定方法
进行方法学验证 , 根据验证结果修订了溶栓胶囊的 效价测定方法 。 1 材料 溶栓胶囊 ( 山 西中 远威 药 业有 限 公司 , 共 13 批 , 批 号 分 别 为 20020303, 20060101 , 20061201, 20060301, 20070801, 20070902 , 20070602, 20071001, 20071002, 20080101 , 20080102, 20080202, 20080201) , 牛凝血酶 ( 批号 200424 ) 、牛 纤维蛋白原 ( 批号 200736, 200232) 和蚓激酶对照品 ( 中国药品生物制品检定所 , 批号 200502 ) 。 进口牛 纤维蛋白原 ( 北京江晨生物公司分装 , 批号 F 8630) , 琼脂 糖 粉 ( 上 海楷洋生 物技术 有限公司 , 批号 848674, 848678) 。 恒温培养箱 ( 上海恒科科研仪器有限公司 ) ; 游 标卡尺 ( 桂林广陆数字测控股份有限公司 ) 。 2 方法 2. 1 对照品溶液的制备 取蚓激酶对照品 , 用 0. 9 %氯化钠溶液制成含 不同蚓激酶单位的溶液 。
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( 1. 山西省药品检验所 , 山西 太原 030001;2. 山西中远威药业有限公司 , 山西 太谷 030800;3. 山西大学 化学化工学院 , 山西 太原 030006)
[ 摘要 ] 目的 : 建立蚓激酶的效价测定方法 , 并引入生物 检定统计 法控制 实验误 差 。 方法 : 用标准 曲线法 和生物 检定的 量反应平行线法统计计 算效价 , 从方法耐用性 、专属性 、线性范围 、供试品处理方法 、精密度 、重复性 、溶液 稳定性 、回收率 、统计 计算方法等方面对溶栓胶囊中蚓 激酶效价测定的琼脂糖纤维蛋白平板法进行 了方法学研 究 。 结果 : 不同琼脂 糖 、不 同纤维蛋 白原对本法测定影响较 小 , 阴性对 照无 干扰 ; 本 法线 性范 围为 12. 5 ～ 400 U , 精密 度 R S D 3. 2%, 重 复性 R S D 8. 3%, 回 收率 97. 0%, R S D 16. 6%; 供试品溶液 在 4 ℃下 72 h 内稳定 ; 用 本法可以将测定误差由 60% ～ 70% 降低到 2% 左右 。 结论 : 琼脂糖 纤维蛋白平板法可以快 速 、简便 、准确地测定蚓激酶的活性 , 用生物检定的量反应平行 线法可以控制测定的误差 。 [ 关键词 ] 蚓激酶 ; 效价 ; 琼脂糖纤维蛋白平板法 ; 生物检定 ; 量反应平行 线法
虽条件易控制 , 操作简便迅速 , 但需