双向凝胶电泳技术原理与应用

双向凝胶电泳技术原理与应用

Principle and application of two-dimensional gel

electrophoresis

姓名：XX

班级：检验本科1113班

学号：XXX

【摘要】人类基因组计划与美国塞莱拉遗传信息公司于2001年在美国《科学》杂志和英国《自然》杂志联合宣布，他们绘制出了准确、清晰、完整的人类基因组图谱，至此，人类基因组计划已基本完成，随着后基因组时代的到来，蛋白质组学得到了空前的发展，蛋白质组研究旨在揭示基因表达的真正执行生命活动的全部蛋白质的表达规律和生物功能。包括蛋白质组、蛋白质组学、功能蛋白质组学和结构基因组学等新的概念的提出，蛋白质组学已成为当今生物领域中极其活跃的学科。其中双向电泳（two-dimensional electrophoresis，2.DE）是蛋白质组研究的三大关键核心技术之一

【abstract】Human gene group plans and United States sailaila genetic information company Yu 2001 in United States Science under magazine and United Kingdom natural under magazine joint announced, they draws out has accurate, and clear, and complete of human gene Group map, at this point, human gene group plans has basic completed, as Hou gene group era of comes, protein group learn get has unprecedented of development, protein group research aimed at reveals gene express of real implementation life activities of all protein of express law and biological function. Includes proteome, proteomics, structural proteomics and functional genomics of new concepts, such as proposed, proteomics has become extremely active in the field of biological sciences. Two-dimensional gel electrophoresis (two-dimensional electrophoresis,2.DE) is one of the three key core technologies of proteome research

【关键词】双向电泳；蛋白质组学；后基因组时代

【 key words 】two-dimensional electrophoresis，2.DE proteomics Post-genomics era

【前言】由于蛋白质的等电点和分子量是两个彼此不相关的重要性质，而2.DE 同时利用了蛋白质间的这两个性质上的差异分离蛋白质，因此2.DE的分离能力非常强大，它甚至能将细胞中的5000种蛋白分离开，2.DE在分离蛋白混合样品、比较差异方面有不可替代的作用，结合质谱鉴定技术可查明大型蛋白复合物各组组分，与其他生物技术如分子生物学、分子遗传工程、免疫学、微量蛋白质的自动氨基酸序列分析相结合，可以快速准确地发现和鉴定新的蛋白质。

【荧光定量PCR的基本原理】【1-3】

双向电泳由于具有高分辨率和高灵敏度已成为分析复杂蛋白混合物的基本工具［1］。自1975年O'Farrel等［2］建立这种技术后，已有许多改进，使得这一技术日趋完善。2-DE是利用蛋白质的带点性和分子量大小的差异，通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质的技术。第一向电泳是依据蛋白质的等电点不同，通过等电聚焦电泳（isoelec-tricfocusing，IEF）将不同净电荷的蛋白质在PH

梯度介质中外加电场作用形成分离的蛋白质区带。然后将凝胶包埋在SDS-PAGE 凝胶板上端，根据蛋白质分子量的不同，在垂直或水平方向进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），即第二向电泳;在IEF中，蛋白质因等电点不同而被分离;在SDS.PAGE中，不同分子量的蛋白质相互间被分离开，再用考马斯亮兰或银染进行检测［3］，经Pdquest等软件对结果进行比对、解析。

【双向电泳技术应用过程中的关键步骤】

1、样品制备（蛋白提取）

（1）细胞培养、处理和收集;

（2）将细胞在IEF裂解缓冲液中溶解;

蛋白质的溶解常采用含有8mol/L 尿素、4%[3-(3-胆胺丙基) –丙磺酸]（SHAPS）、50~100mmol/L DTT 和40mmol/L Tris的样品缓冲液。样品溶解得不好会减少分离到的蛋白质数量，同时会造成等电聚焦时某些蛋白质的沉淀，从而减少转移到第二向电泳的蛋白质数量。

（3）将样品离心以去除不溶的细胞碎片和DNA，提取上清，-80℃保存。

2、蛋白质定量和上样

（1）第一向电泳——等电聚焦;

目前广泛采用的是固相pH梯度（immobiline pH gradient，IPG）水平等电聚焦。常用固相PH梯度-道尔顿双向电泳法（isoelectric

point-dalton,ISO-DALT）。IPG胶的制备主要是利用不同PK固定化电解质的组合可配制不同PH范围的凝胶。

（2）IPG的平衡;

由于第一向电泳的缓冲液系统与第二向电泳的缓冲液系统完全不同，因此，胶条由第一转移到第二之前，必须进行平衡。平衡过程分两步：第一步平衡液的成分主要是Tris缓冲液、SDS、DTT、尿素和甘油。平衡的主要作用是使第一向胶体上的蛋白质变性。平衡液中的尿素和甘油可以增加溶液的粘度，减少由固相化的两性电解质造成的电内渗。SDS用于变性蛋白质，使蛋白质带上负电。DTT是为了在蛋白质与SDS充分结合的同时，二硫键液得到还原；这对第二向SDS-PAGE来讲是十分重要的。第二步平衡液是用碘乙酰胺代替DTT。IPG胶条的