液相及液质分析方法学的开发及验证

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固定相
丧失浸润现象： 100%水溶液中保留完全丧失
流动相：0.1% 醋酸水溶液
阿莫西林
起始：填料完全浸润 － “Wetted”
停止流速后： 填料完全脱离浸润状态 －“De-Wetted” 0
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2 4 Vo：被分析物没有保留
6 Minutes
8
10
流动相
• 甲醇
– – – – 质子化溶剂 [氢键供给者] 洗脱能力较乙腈弱 粘度较乙腈高 低紫外波长下有吸收
+ HN(CH3 )
2
电性(大部解离)
Base
Base
对碱性化合 物的保留及 严重拖尾
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两实验使用相同的传统C8硅胶柱
固定相
低pH可能导致分离度降低或根本不能分离！
0.04
AU
0.02 0.00 0.00
pH 2.0
2.00 4.00 6.00 Minutes 8.00 10.00
0.04 0.03
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液相色谱的方法开发
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液相色谱的方法开发
• 根据分析物的化学性质选配色谱条件
– 基于既往经验及思考进行合理猜测 – 通常辅以资料参考 – 询问同事
• “步进式”测试开发
– 基于前一测试结果设计下一步的测试条件，逐步进行
• 系统性筛选策略
– 先按流动相pH、有机相和固定相的直接组合进行系统性筛选测试 • 评估结果，选择最有效的条件组合 – 再进行方法优化 • 梯度/温度
• 乙腈
– – – – 非质子化溶剂 [氢键接受者] 洗脱能力较甲醇强 粘度较甲醇低 低紫外波长下透光性好
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流动相
2
1 3 4 10 11 5 6 7 5,7 6 3 4
1. Gentisic acid (A) 2. Caffeine (WB) 3. Ritodrine (B) 4. Hydroguinidine (B) 5. 1-Pyrenesulfonic acid (A) 6. Imipramine (B) 7. Amitriptyline (B) 8. Flavone (N) 9. 4-Dimethylamino-benzophenone (WB) 10. Diclofenac (WA) 11. Dioseb (A) 12. Octanophenone (N)
• 数据分析阶段
– 对分析结果进行统计学计算
• 色谱结果是相对的 • 用统计学分析的方法，可以客观地评估最终结果的真 实变化
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方法验证步骤
耐用性
实验参数 1 Min & Max 实验参数 2 Min & Max 实验参数 3 Min & Max 实验参数 4 Min & Max
线性 Day 1-3
定量限 精密度
定量限 原料药
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方法验证的复杂性
• 每一方法验证的过程由80到100次分析组成 • 每次分析中，仅一种组分（一个色谱峰）即 可产生7个相关结果（峰面积，保留时间，分 离度等……） • 每一组分最终得到总共约700 个数字 • 所有这些数字需要进行数学处理：
– 手工处理（计算器，Excel Macro’s 等） – 专用的方法验证程序
P D
Fl I A O
Test Probes: I: Imipramine [B] A: Amitriptyline [B] Fl: Flavone [N] O: Octanophenone [N]
碱性及中性化合物
Fluoro-Phenyl pH 3, MeOH
I A Fl O D
Fe
P
Fl
I O
Phenyl-Hexyl pH 10, MeOH
鉴别试验
+ + + -
+ + + -
* + +
* + * *
+ -
定量限
线性 范围
10
+ +
+
+ +
*
*
* *
-
* 可能需要，具体与特定试验的性质有关。
如何进行方法验证
• 分析实验阶段
– 按照规定的实验计划或步骤
• 通常需要3 到 5天
– 在不同操作条件下，进不同浓度的试样 – 原料及制剂皆需分析
Silica pH Range Hybrid Particle pH Range
碱性
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Neue et. al. American Laboratory 1999 (22) 36-39.
固定相、溶剂和流动相pH的影响因素
Fl
C18 pH 3, ACN
I
A P Fe
D
O
C18 pH 10, ACN
Fe
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方法验证- USP<1225>
• 类型1
– 主组份或活性成份定量分析方法
• 类型2
– 杂质或降解化合物测定方法
• 类型3
– 性能特点之确定分析方法
• 如溶出度实验
• 类型4
– 鉴别试验
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方法验证- USP<1225>
类型2 验证的内容
准确度 精密度 专属性 检测限
类型4
类型1
定量
限度试验
类型3
• 改变流动相pH将使选择性发生极大改变
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流动相pH值
40 35 Retention Factor (k) 30 25 20 15
酸性和碱性化合物在其未电离状态下时反相保留最大 中性化合物的保留不受pH影响
酸性
酸性保留增强 [HA]
中性化合物
碱性保留增强 [B]
10
5 0 0 2 4 6 pH 8 10 12
浓度1: 60% 原料及制剂 浓度2:80% 原料及制剂 浓度3:100% 原料及制剂
定量限
浓度1 原料药
浓度2 原料药 浓度3 原料药 浓度4 原料药 浓度5 原料药
检测限
六次空白样品 的基线噪音
浓度4: 120% 原料及制剂
浓度5: 140% 原料及制剂
精密度 1-3天
六次重复, 100% 原料药
• 系统适用性“样品”
– 主组份与预期副产物之混合物 – 系统适用性试验是色谱方法的一部分
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方法验证-系统适用性
• 容量因子
– k' > 2
• 拖尾因子
– T2
• 精密度/进样重复性 • RSD 1%, n 5 • 分离度
– Rs 2 (主峰与最近洗脱 的色谱峰之间)
• 理论塔板数
– 通常 N > 2000
双重保留机理:
与键合相的疏水性作用
1). 与键合相的的疏水性作用; 2). 与残余硅醇基间的离子交换作用
O-Si O-Si 离子交换作用 OO-Si O-Si + O- (CH ) HN 32 O-Si OO-Si O-Si O-Si O当流动相为 pH6O--Si 8时, 硅醇基带负 O-Si
当流动相pH值小 于3时, 硅醇基趋 于中性(未解离)
– 适用于广泛的色谱应用 – 适用于开发新方法 – 适用于现有方法的改进
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分析方法学的开发及验证
• 质量源于设计（Quality by Design，QbD）准则 • 实验设计方法学 （Design of Experiment，DoE） • 方法验证（Method Validation）：确保方法在样品 分析的一定范围内中准确、重现、可靠、耐用性。
Fe
A
P
D
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固定相、溶剂和流动相pH的影响因素
C18 pH 3, ACN
Impact on Resolution Double N Double k Double α
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影响分离度的因素
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UPLC技术加速方法开发过程
能够在一个工作日内完成方法开发! • 对pH、有机相和色谱柱的组合条件进行 系统性筛查 • 高分辨亚二微米色谱柱技术确保高分辨 分离在更快的同时分离能力不打折扣
% Improvement 20 – 40% 15 – 20% > 400%
Maximized in UPLC Separations by:
Ultra-low dispersion system Small [< 2 µ m] particles Higher pressure capability Well-designed columns
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实验室获得方法及运用过程
方法验证
- 用一个性质明确的物质来挑战建立的分析方法
方法确认
用一个确定方法来挑战现实的分析环境 专属性，准确度，精密度，LOD，LOQ
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一般不需要进行线性，范围，耐用性实验
方法验证的内容
ICH、USP<1225>、ChP II Appendix XIX A
准确度（Accuracy）
去甲阿米替林
AU
0.02 0.01 0.00 0.00 1.00 2.00 3.00
pH 7.0
阿密曲替林
4.00 Minutes
5.00
6.00
7.00
8.00
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固定相
低有机溶剂或纯 水溶液流动相
C18 硅胶
浸润的孔
未浸润的孔
注意：保留时间与填料表面积与配体有关。然而，如果硅胶表面未湿润， 那么有效的色谱表面积会减少 95% ，因此，降低被分析物的保留 时间即等于“丧失浸润”，记住：几乎所有的表面积都在孔内！
Naphthalene
铝杂质含量 ~375 ppm Acenaphthene
Tf USP = 6.5