液相及液质分析方法学的开发及验证

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* 可能需要，具体与特定试验的性质有关。
如何进行方法验证
• 分析实验阶段
– 按照规定的实验计划或步骤
• 通常需要3 到 5天
– 在不同操作条件下，进不同浓度的试样 – 原料及制剂皆需分析
• 数据分析阶段
– 对分析结果进行统计学计算
• 色谱结果是相对的 • 用统计学分析的方法，可以客观地评估最终结果的真 实变化
pH 2.0
0.04 0.03 AU 0.02 0.01 0.00 0.00
去甲阿米替林
pH 7.0
阿密曲替林
1.00
2.00
3.00
4.00 Minutes
5.00
6.00
7.00
8.00
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固定相
低有机溶剂或纯 水溶液流动相
C18 硅胶
浸润的孔
未浸润的孔
注意：保留时间与填料表面积与配体有关。然而，如果硅胶表面未湿润， 那么有效的色谱表面积会减少95%，因此，降低被分析物的保留 时间即等于“丧失浸润”，记住：几乎所有的表面积都在孔内！ 几乎所有的表面积都在孔内！ 几乎所有的表面积都在孔内
定量限
浓度1 浓度1 原料药 浓度2 浓度2 原料药 浓度3 浓度3 原料药 浓度4 浓度4 原料药 浓度5 浓度5 原料药
检测限
六次空白样品 的基线噪音
精密度 1-3天
六次重复, 六次重复, 100% 原料药
定量限 精密度
定量限 原料药
12
方法验证的复杂性
• 每一方法验证的过程由80到100次分析组成 • 每次分析中，仅一种组分（一个色谱峰）即 可产生7个相关结果（峰面积，保留时间，分 离度等……） • 每一组分最终得到总共约700 个数字 • 所有这些数字需要进行数学处理：
– 适用于广泛的色谱应用 – 适用于开发新方法 – 适用于现有方法的改进
2
分析方法学的开发及验证
• 质量源于设计（Quality by Design，QbD）准则 • 实验设计方法学 （Design of Experiment，DoE） • 方法验证（Method Validation）：确保方法在样品 分析的一定范围内中准确、重现、可靠、耐用性。
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方法验证-系统适用性
• 系统适用性试验的内容
– 在分析未知样品之前或期间，检查系统以保证系 统之性能达到规定的要求 – 塔板数，拖尾因子，分离度 – 确定重现性（%RSD）
• 系统适用性“样品”
– 主组份与预期副产物之混合物 – 系统适用性试验是色谱方法的一部分
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方法验证-系统适用性
• 容量因子
Naphthalene
铝杂质含量 ~375 ppm Acenaphthene Tf USP = 6.5 Amitriptyli ne
5
15
25 Minutes
35
45
24
固定相
O-Si O-Si OH O-Si O-Si OH O-Si OH O-Si O-Si O-Si OH O-Si O-Si
• 系统性筛选策略
– 先按流动相pH、有机相和固定相的直接组合进行系统性筛选测试 • 评估结果，选择最有效的条件组合 – 再进行方法优化 • 梯度/温度
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影响分离度的因素选择性最为重要
Rs =
N 4
α −1 k α k +1
Maximized in UPLC Separations by: Range of column chemistries Multiple particle substrates Wide usable pH range High retentivity Wide range in selectivity
% Improvement
16
20 – 40% 15 – 20% > 400%
开发过程
能够在一个工作日内完成方法开发! 能够在一个工作日内完成方法开发 • 对pH、有机相和色谱柱的组合条件进行 系统性筛查 • 高分辨亚二微米色谱柱技术确保高分辨 分离在更快的同时分离能力不打折扣 • 可自动选择色谱柱和流动相 • 四元溶剂或二元混合使方法开发更方便
– k' > 2
• 拖尾因子
– T≤2
• 精密度/进样重复性 • RSD ≤ 1%, n ≥ 5 • 分离度
– Rs ≥ 2 (主峰与最近洗脱 的色谱峰之间)
• 理论塔板数
– 通常 N > 2000
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方法验证- USP<1225>
• 类型1
– 主组份或活性成份定量分析方法
• 类型2
– 杂质或降解化合物测定方法
实验室获得方法及运用过程
方法验证
- 用一个性质明确的物质来挑战建立的分析方法
方法确认
5
用一个确定方法来挑战现实的分析环境 专属性，准确度，精密度， 专属性，准确度，精密度，LOD，LOQ ， 一般不需要进行线性，范围， 一般不需要进行线性，范围，耐用性实验
方法验证的内容
ICH、USP<1225>、ChP II Appendix XIX A
Maximized in UPLC Separations by: Ultra-low dispersion system Small [< 2 m] particles Higher pressure capability Well-designed columns
Impact on Resolution Double N Double k Double α
端基封口基团
合成步骤： 合成步骤： 1. 合成硅胶基质 2. 键合配体（键合相） 3. 端基封口
残留硅羟基
硅胶基质
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固定相
CSH C18
I A P Fe Fl D O
Acetonitrile,
0.1% formic acid (pH 3)
Test Probes: I: Imipramine [B] A: Amitriptyline [B] Fl: Flavone [N] O: Octanophenone [N] P: 1-pyrenesulfonic acid [A] Fe: fenoprofen [A] D: diclofenac [A]
与键合相的疏水性作用
当流动相pH值小 于3时, 硅醇基趋 于中性(未解离)
+ HN(CH3 )
2
电性(大部解离)
Base Base 对碱性化合 物的保留及 严重拖尾
25
两实验使用相同的传统C8硅胶柱 两实验使用相同的传统 硅胶柱
固定相
低pH可能导致分离度降低或根本不能分离！
0.04 AU 0.02 0.00 0.00 2.00 4.00 6.00 Minutes 8.00 10.00
3
实验室获得方法及运用过程
方法开发 方法验证 方法确认 方法转移
4
分析条件的筛选（色谱柱,流动相,pH等 分析条件的筛选（色谱柱,流动相,pH等） ,pH 及优化（梯度、柱温、流速等） 及优化（梯度、柱温、流速等） 准确度，精密度，专属性，检测限， 准确度，精密度，专属性，检测限， 定量限，线性，范围， 定量限，线性，范围，耐用性 法定检验方法在使用环境中适用性评 人员、仪器、样品、试剂） 估（人员、仪器、样品、试剂） 非法定检验方法在实验室之间传递的 文件化过程
10 11 5 6 7 5,7 6 8 9 10 11 8 9 10,11 2 1 6 5 7 8,9 12 12
RP18Low pH (pH 3) 100% ACN
1:1 ACN:MeOH
100% MeOH
12
34
Jenkins, Diehl
30
流动相pH值
• 影响带有可离子化官能团的分析物 –胺 – 羧基 –酚 • 有些化合物含有一个以上的可离子化官能团 • 改变流动相pH将使选择性发生极大改变
– 手工处理（计算器，Excel Macro’s 等） – 专用的方法验证程序
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液相色谱的方法开发
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液相色谱的方法开发
• 根据分析物的化学性质选配色谱条件
– 基于既往经验及思考进行合理猜测 – 通常辅以资料参考 – 询问同事
• “步进式”测试开发
– 基于前一测试结果设计下一步的测试条件，逐步进行
准确度（Accuracy） 准确度（Accuracy） 精密度（Precision） 重复性，重现性， 精密度（Precision）-重复性，重现性，中检精密度 专属性（Specificity） 专属性（Specificity） 检测限（LOD） 检测限（LOD） 定量限（LOQ） 定量限（LOQ） 线性（Linearity） 线性（Linearity） 范围（Range） 范围（Range） 耐用性（Robustness） 耐用性（Robustness）
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流动相pH值
40 35 Retention Factor (k) 30 25 20 15 10 5 0 0 2 4 6 pH 8 10 12
6 Minutes
8
10
流动相
• 甲醇
– – – – 质子化溶剂 [氢键供给者] 洗脱能力较乙腈弱 粘度较乙腈高 低紫外波长下有吸收
• 乙腈
– – – – 非质子化溶剂 [氢键接受者] 洗脱能力较甲醇强 粘度较甲醇低 低紫外波长下透光性好
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流动相
2 1 3 4 2 1 3 4
1. Gentisic acid (A) 2. Caffeine (WB) 3. Ritodrine (B) 4. Hydroguinidine (B) 5. 1-Pyrenesulfonic acid (A) 6. Imipramine (B) 7. Amitriptyline (B) 8. Flavone (N) 9. 4-Dimethylamino-benzophenone (WB) 10. Diclofenac (WA) 11. Dioseb (A) 12. Octanophenone (N)