聚合酶链反应原理及应用
QPCR原理及应用
QPCR原理及应用QPCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction）即定量聚合酶链式反应，是一种可以对DNA进行定量检测的分子生物学技术。
通过测定DNA模版的初始数量，能够准确地对靶DNA在样品中的量进行定量分析。
QPCR技术已经广泛应用于医学、农业、环境科学等众多领域，并且在疾病诊断、基因表达研究、生物安全监测等方面具有重要意义。
QPCR的原理：QPCR主要基于DNA聚合酶链式反应（PCR）的原理。
PCR技术通过DNA聚合酶，利用DNA引物和酶切的DNA模板来扩增特定DNA序列。
在PCR的每一个循环中，DNA模板会被酶切成两段，然后引物结合到目标DNA上并扩增。
然后，扩增的DNA产物作为下一个PCR循环的模板，以此循环反复扩增。
在QPCR中，扩增的DNA产物通过酶的同步检测来实时监测。
QPCR使用一种荧光探针，在引物结合区域的扩增过程中释放出荧光信号。
荧光信号的强度与扩增DNA的数量呈正比。
通过检测荧光信号的强度，可以确定DNA的初始数量。
QPCR的应用：1.疾病诊断：QPCR可以快速、准确地检测疾病相关基因的表达水平，从而帮助进行疾病的早期诊断和病情监测。
比如，QPCR可以检测癌症相关基因的表达水平，辅助肿瘤的早期诊断和治疗。
2.基因表达研究：QPCR能够定量检测基因的表达水平，从而帮助研究基因在细胞和组织中的功能调控机制。
比如，研究在药物处理、细胞因子刺激等条件下，特定基因的表达水平的变化。
3.遗传病筛查：QPCR可以对遗传病相关基因进行定量检测，从而帮助进行遗传病的筛查。
通过检测特定基因的突变和表达水平，可以早期发现遗传病，并进行相应的干预和治疗。
4.放射性污染监测：QPCR可以快速、敏感地检测放射性物质污染的程度和范围。
比如，监测环境中的放射性同位素污染，以保护公众健康。
5.植物基因改良：QPCR可以帮助筛选目标基因在转基因植物中的表达水平。
通过检测基因的表达水平，可以确定转基因植物是否具有目标特性，从而加速植物基因改良的进程。
pcr技术原理及步骤
pcr技术原理及步骤
PCR（聚合酶链式反应）是一种生物学技术，用于在体外大量复制特定的DNA片段。
它在分子生物学和遗传学的研究中得到了广泛应用。
PCR技术的原理是通过逐渐加热和降温的循环反应，使DNA序列在体外被精确地复制。
PCR的步骤主要包括：变性、退火和延伸。
1. 变性：首先将DNA模板加热至95°C，这样会使DNA双链解开，变为两条单链DNA。
2. 退火：将温度降至50-65°C，加入DNA引物（引物是特异性序列，与待扩增的DNA序列互补）。
在适当的温度下，引物会与单链DNA的两端结合形成引物-模板复合物。
3. 延伸：将温度升至72°C，加入热稳定的DNA聚合酶。
在此温度下，DNA聚合酶会沿着引物-模板复合物的DNA链合成新的DNA链。
这样，一个PCR循环完成后，原有的DNA分子被扩增成两个分子。
然后，将温度逐渐循环升高和降低，重复数十次甚至数百次，可以快速产生大量目标DNA。
PCR技术的应用非常广泛，例如在基因工程中用于克隆和表达目的基因、医学诊断中检测特定基因、法医学中的DNA鉴定等。
其原理和步骤的灵活性和高效性使其成为现代生物学的重要工具。
PCR技术原理、实验步骤和应用
一、实验目的1.掌握聚合酶链式反应的原理。
2. 掌握移液枪和PCR仪的基本操作技术。
二、实验原理PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。
这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA 片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。
它不仅是DNA分析最常用的技术，而且在DNA重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。
PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。
细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。
参与复制的有多种因素。
PCR 是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。
重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
三、实验试剂与器材模板DNA、2.5mmol/L dNTPTaq DNA聚合酶（5U/μL）、SSR引物10 ×buffer、15mmol/L Mg2+、ddH2OPCR仪、移液枪、PCR板四、实验步骤1、配制20μL反应体系，在PCR板中依次加入下列溶液：模板DNA 2μL引物1 1μL引物2 1μLdNTP 1.5μLMgCl2 2μL10×buffer 2μLddH2O 10μLTaq酶0.5μL2、设置PCR反应程序。
聚合酶链式反应(PCR)
操作： 5份标本
Taq 酶 (5U/μl)： 0.2μl × 6 = 1.2μl 水： 共174μl，先用移液器 / 指弹混匀，后用离心机瞬时 混匀（管壁上液体沉至管底）。
2. 另取 5 支0.2ml Ep管，分别加入上述液体29μl。
3. 分别取标本模板各1μl，加入上述5支 Ep 管中，混 匀，分别加入2滴液体石蜡（防止加温过程中液体蒸 发影响反应体积），离心机瞬时离心，备用。
⑶ 延伸温度和时间：
一般位于Taq酶最适作用温度70 ～ 75 ℃之间。 引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引 物与模板的结合，可以缓慢升温到70 ～ 75 ℃。 延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定， < 1Kb，1分钟足够；> 1Kb需加长延伸时间，10Kb 片段延伸时间可达15分钟。
0.2×30 / 10 = 0.6μl 0.4×30×2 / 10 = 2.4μl 1μl 30-3-1.8-0.6-2.4-0.2-1=21μl
Taq 酶(5U/μl)：1 / 5 = 0.2μl 模板： 水：
总体积 30μl ×6 = 180μl 1. 取一 0.5 ml Ep 管，依次加入下列试剂： 10×buffer： 3μl ×6 = 18μl MgCl2: 1.8μl×6 = 10.8μl dNTPs: 引物 P： 0.6μl×6 = 3.6μl 2.4μl ×6 = 14.4μl 21μl × 6 = 126μl
扩增的特异性取决于引物与模板DNA的特异 结合，基本反应步骤分三步： 1. 变性 (Denaturation)： 加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两 条单链。94℃ 30″
2. 退火 (复性) (Annealling):
突然降温后模板DNA与引物按碱基配对原则 互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由 于引物的高浓度，结构简单的特点，主要的结合 发生在模板与引物之间。55 ℃ 30 ″
PCR定量方法概述
PCR定量方法概述PCR（聚合酶链式反应）是一种广泛应用于分子生物学研究中的技术，可通过扩增特定DNA片段数量来进行定量分析。
PCR定量方法的发展使得我们能够更加准确、快速地测量和定量目标DNA序列或基因表达水平。
本文将概述PCR定量方法的原理、步骤和应用。
一、PCR定量方法的原理PCR定量方法是基于PCR技术的扩增效率与起始模板浓度成正比的原理。
在PCR反应中，模板DNA以指数级倍增，而每个PCR周期后，扩增效率会逐渐降低。
通过确定PCR周期数和目标序列浓度之间的关系，可以利用定标曲线或计算方法来定量目标DNA的起始浓度。
二、PCR定量方法的步骤1. DNA提取：从样本（如细胞、组织或血液）中提取DNA，并纯化得到高质量的模板DNA。
2. 靶序列选择：根据需要定量的目标序列，设计引物和探针，保证其特异性和高效性。
3. PCR反应设置：根据目标序列的长度和特性，确定PCR反应体系中的引物和探针的浓度，优化反应条件（如温度和时间）。
4. 制备标准曲线：通过系列稀释的已知浓度的标准品，构建定标曲线，用于后续定量计算。
5. PCR扩增：将模板DNA与引物和探针加入PCR反应体系中，进行一系列PCR循环，扩增目标序列。
6. 实时监测：利用实时荧光PCR仪或其他检测方法，监测PCR反应过程中探针的荧光信号强度。
7. 数据分析：根据定标曲线和荧光信号强度，计算出目标DNA的起始浓度。
三、PCR定量方法的应用1. 基因表达分析：通过比较不同样品中目标基因的表达水平，研究基因在生理和病理过程中的变化。
2. 病原体检测：定量PCR可用于检测和定量病原体DNA，用于快速诊断与预后评估。
3. 肿瘤检测：通过定量PCR检测肿瘤标志物，提供肿瘤早期诊断和治疗效果监测。
4. 遗传病筛查：利用PCR定量方法可以检测和定量与遗传病相关的突变或多态性位点。
5. GMO检测：定量PCR可用于识别和量化转基因生物的成分和含量。
6. 受精能力评估：通过检测精子和卵子中特定基因的数量，评估生殖健康和受精能力。
聚合酶链反应技术在临床诊断中的应用
聚合酶链反应技术在临床诊断中的应用简介聚合酶链反应技术（polymerase chain reaction，PCR）是一种用于复制DNA序列的技术，可以在短时间内扩增少量的DNA样品，被广泛应用于临床诊断、基因工程等领域。
PCR技术的原理基于DNA的复制能力，采用DNA聚合酶酶解、引物扩增、芯片分析等技术，可以快速诊断出各种疾病。
本篇文章将介绍PCR技术在临床诊断中的应用，以及其优缺点。
PCR技术在临床诊断中的应用PCR技术可以用于快速检测许多疾病的标记物，如肿瘤标记物、传染病标记物等。
在临床上，PCR技术被广泛应用于快速准确诊断疾病、分子诊断和治疗流程中。
1. 传染病检测PCR技术在传染病检测中可以提高检测速度、灵敏度和特异性。
通过PCR技术检测病菌DNA或RNA，可以在病人感染后的短时间内，准确检测出病原体，如肺结核、流感、病毒性肝炎等传染病。
与传统的检测方法相比，PCR技术的检测结果更加可靠，能够避免虚假阳性或阴性的影响，提高了诊断准确性。
2.遗传病检测PCR技术在遗传病检测中可以通过扩增特定基因区段的方法，检测患者是否携带有致病基因突变，包括：遗传性失听症、囊性纤维化、肌萎缩性脊髓侧索硬化症等多种遗传病。
PCR技术使得医生可以在患者出现症状前就进行诊断，为早期预防和治疗提供了更加可靠的科学依据。
3. 肿瘤检测PCR技术在肿瘤检测中可以检测出特定肿瘤相关基因和基因突变，如白血病、乳腺癌、早期子宫内膜癌和黑色素瘤等。
与传统的检测方式相比，PCR技术可以在较短时间内完成诊断，并对肿瘤的类型和治疗方案进行评估，有利于肿瘤治疗的个体化。
PCR技术的优缺点1. 优点（1）快速：PCR技术只需要数小时就可以得到具有高灵敏性和特异性的评估结果。
（2）灵敏：PCR技术可以扩增极小量的DNA，并能够检测数量几乎无限制的目标基因组。
（3）特异性：PCR技术利用引物定向扩增目标DNA，可以避免与非目标的DNA序列结合而误诊的风险。
聚合酶链反应及其应用课件
DNA聚合酶的保真性能（主要因素） DNA链的物理损伤 PCR反应体系的洁净度
•聚合酶链反应及其应用
•7
DNA聚合酶对PCR精确性的重要影响
DNA聚合酶的保真性主要取决于其3’→5’的核酸外切酶活性，它 负责对错误掺入的碱基进行校正。相关研究结果表明，DNA聚合酶的 出错率在每轮延伸每核苷酸1.6 X 10–6 - 2.1 X 10–4范围内。DNA聚合 酶的碱基掺入错误可能发生在其延伸阶段的五种活性：
模板浓度的变化很大程度上取决于待扩增的碱基序列，但一般
而言，模板DNA长度小，PCR扩增产物的量就大，因此对于大分子 量的模板DNA（尤其是真核生物基因组DNA），在扩增之前最好先 用超声波处理或限制性酶消化。
•聚合酶链反应及其应用
•21
4 PCR的引物设计及合成
PCR引物的设计原则 引物的在线设计工具及免费软件简介 PCR引物的使用
Taq DNA酶在使用时应注意：
避免稀释保存Taq DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶在室温下也具有延伸引物的活性
•聚合酶链反应及其应用
•9
用于PCR的DNA聚合酶简介
KlenTaq DNA聚合酶（Thermus aquaticus）
KlenTaq DNA聚合酶是一种N端缺失了的Taq DNA聚合酶，因而 没有5’的核酸外切酶活性；
•聚合酶链反应及其应用
•19
粗样品中的PCR抑制剂
粪便 胆盐、胆红素（抑制浓度50mg / mL） 血液 亚铁血红素、聚乙醇磺酸钠、heparin（抗凝剂） 植物 硫酸右旋糖苷 土壤 腐殖物质、含铁化合物 食品 未鉴定的抑制剂 痰液 未鉴定的抑制剂
•聚合酶链反应及其应用
•20
PCR模板的使用
pcr应用于遗传病的原理
PCR应用于遗传病的原理1. 什么是PCR？PCR（聚合酶链式反应，Polymerase Chain Reaction）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增DNA片段，从而能快速、高效地产生大量目标DNA序列。
2. PCR在遗传病研究中的应用PCR在遗传病研究中的应用相当广泛。
它可以用于诊断遗传病的检测、疾病的遗传风险评估、基因突变的筛查、克隆特定基因等。
3. PCR的原理PCR主要由以下三个步骤组成：变性、退火和延伸。
3.1 变性（Denaturation）PCR反应开始时，将待扩增的DNA样品加热至94-96°C的高温。
高温会使DNA的双链解开，变为两条单链。
3.2 退火（Annealing）在变性步骤之后，PCR反应体系会降温至50-65°C，使引物（primer）能够与待扩增DNA的两个末端部分互相结合。
引物是短的DNA片段，它们的序列与待扩增DNA的两端互补。
引物的结合会导致新的DNA链合成起点的形成。
3.3 延伸（Extension）在退火步骤之后，PCR反应体系会加入DNA聚合酶、四个脱氧核苷酸（dNTPs）和盐溶液。
此时，DNA聚合酶会沿着引物延伸，合成与待扩增DNA互补的新DNA链。
这一步骤的温度约为72°C。
经过这三个步骤的循环反复进行，就可以扩增出大量的目标DNA序列。
3.4 PCR扩增的关键因素PCR扩增的关键因素包括模板DNA浓度、引物浓度、延伸时间、退火温度等。
合理选择这些因素可以保证PCR反应的准确性和高效性。
4. PCR扩增与遗传病诊断PCR扩增技术在遗传病的诊断中起着重要作用。
以下是PCR在遗传病诊断中的应用：•突变筛查：PCR可以检测特定突变位点的存在与否，从而判断个体是否携带突变基因。
•基因拷贝数变异：PCR可以检测基因拷贝数变异，判断某些基因的拷贝数量是否正常。
例如，在某些遗传性疾病（如遗传性失聪）中，可以通过PCR检测特定基因的拷贝数变异。
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1
2
3
4
时间（min）
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
5
PCR的基本原理
PPCCRR反过应程条件95℃
PCR的特点
1 2 模板D3NA
高温变性 低温退火 适温延伸
94
温
度 72
（℃）
55
22
DNA 2
形 成
条变
子链延伸
单性
DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
一、概念
（一）PCR: polymerase chain reaction
聚合酶链反应
PCR技术是一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术，亦称为 无细胞分子克隆技术。它是以待扩增的双链DNA为模板，在一对人工合成的 寡核苷酸引物的介导下，以四种dNTP为底物，通过耐高温DNA聚合酶的酶 促作用，经过变性、退火、延伸的循环快速特异地扩增出特定的DNA片断。
引物—— 5’ATCCGGAC
Mg2+
耐热DNA聚合 酶
酶活化因子
dGTP dTTP dATP dCTP
底物
二 PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
DNA 5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 解旋解链 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
标准的PCR反应体系
4种dNTP
各200umol/L
引物
各100pmol
模板DNA
0.1～2ug
Taq DNA－pol 2.5u
Mg2+
1.5mmol/L
温 度 （℃）
94 72
55
22
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
DNA 2
形
成
条 单 链
变 性
DNA单链
子链延伸 DNA加倍
与引物复性
DNA双螺旋
1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行 PCR，扩增的DNA片段均一，真实性好，特异性 高。但是该酶不耐热，每次循环仍需加入新酶。
（二）Erlich发现耐高温的DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
100
酶 80
活 性
60
40
(%)
20
40 50 60 70 80 90 100
PPCCRR反过应程条件7925℃
PCR的特点
第1轮结束 第2轮开始
PCR的基本原理 Taq
PPCCRR反过应程条件957502℃
PCR的特点
Taq
Taq
Taq
PCR的基本原理
PPCCRR反过应程条件72℃
PCR的特点
第2轮结束
模板DNA
第1轮扩增 第2轮扩增
但由于测序和引物合成的困难，以 及70年代基因工程技术的发明使克 隆 基 因 成 为 可 能 ， 所 以 ， Khorana 的设想被人们遗忘了……
1985 年 ， 美 国 PE-Cetus 公 司 的 Kary B. Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）
基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该
3’
解旋解链 3’ TAGCGCTATCGCATCGACGCT 聚ADT合NAA酶GCGTAGCTGCGAGGATCG
3’
子链延长 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
5’
1971年，Khorana提出：经过DNA 变性，与合适引物杂交，用DNA聚 合酶延伸引物，并不断重复该过程 便可克隆tRNA基因。
酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进
行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动 化热循环仪 1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖
三、PCR原理
（一）Mullis的设想
94℃变性
50-65℃退火
适度延伸
94℃
55℃
37℃
Mullis最初使用的DNA聚合酶是E. coli DNA聚合 酶1的Klenow片段，起主要缺点是：不耐高温， 加热时会变性失活，每次循环都要重新加入；引 物链延伸反应在37 ℃下进行，容易发生模板和引 物之间的碱基错配，产物特异性较差，合成的 DNA片段不均一。
第四章 聚合酶链反应 原理及应用
聚合酶链反应(PCR)是 80年代中期发展起来的 体外核酸扩增技术。它 具有特异、敏感、产率 高、快速、简便、重复 性好、易自动化等突出 优点；能在一个试管内 将所要研究的目的基因 或某一DNA片段于数小 时内扩增至十万乃至百 万倍,使肉眼能直接观 察和判断；可从一根毛 发、一滴血、甚至一个 细胞中扩增出足量的 DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天 几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物 医学领域中的一项革命性创举和里程碑。
简单的讲， PCR技术即通过引物延伸核酸的某个区域而进行的重复双向 DNA合成。
（二）PCR反应条件
模板 （template） 上、下游引物（primer） 4种dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 酶 （Taq DNA polymerase）
PCR扩增体系
模板—— 3’TTAGGCCTGGATAAGCGCCTGGA 5’
3’
合成引物
3’ 解旋酶解链酶
5’
子链延长
DNA 5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
3’
解旋解链
GGAUCG 引5‘物酶
RNA引物
合成引物
RNA引
5‘AU物CGCG
子链延长 引T物A酶GCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
5’
DNA 5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
PCR的基本原理
DNA引物
PPCCRR反过应程条件955℃
PCR的特点
引物1
引物2
PCR的基本原理
PPCCRR反过应程条件5702℃
PCR的特点
Taq酶 引物1
DNA引物
引物2 Taq酶
PCR的基本原理
温度(℃)
Taq DNA聚合酶的特点：
耐热性：在70 ℃下反应2h后起残留活性大 于原来的90%；
在热变性时不会被钝化，不必再每次扩增 反应后再加新酶；
大大提高了扩增片段的特异性和扩增效率， 增加了扩增长度。
94℃
55℃
72℃
PCR循环
（三）PCR的基本原理
• PCR反应条件 • PCR的过程