聚合酶链式反应及其在基因诊断中的应用
简述PCR技术的主要原理及应用
简述PCR技术的主要原理及应用1. PCR技术的主要原理聚合酶链式反应（PCR）是一种重要的分子生物学技术，其主要通过在一系列循环中扩增特定DNA片段，最终获得大量目标DNA的倍增产物。
PCR技术广泛应用于基因测序、基因克隆、突变分析、分子诊断等领域。
PCR技术的主要原理包括以下三个步骤：1.1 反应体系的准备PCR反应体系主要由以下组分组成： - DNA模板：即待扩增的目标DNA段，可以是从任何来源提取的DNA片段。
- 引物：由两个单链DNA片段构成，分别与目标DNA序列的两个相邻区域互补，作为DNA复制的起始点。
- DNA聚合酶：用于引导DNA的复制，具有高温稳定性。
- 反应缓冲液：提供适宜的酶活性和其他反应条件。
1.2 热循环反应PCR反应通过一系列的循环反应，完成DNA的扩增。
每个循环包括以下三个步骤：1.热变性（Denaturation）：将PCR反应管中的DNA双链变性为单链，提供引物结合的机会。
2.引物结合（Annealing）：反应体系通过降温，使引物与目标DNA互补的区域结合。
3.DNA扩增（Extension）：通过DNA聚合酶在适宜温度下复制DNA模板。
1.3 扩增产物的倍增反复进行热循环反应会连续复制目标DNA段，导致DNA的指数级扩增。
经过多个循环之后，扩增产物的数量将呈指数式增长。
2. PCR技术的应用PCR技术在生物学研究和医学诊断中得到广泛应用，主要包括以下几个方面：2.1 基因测序PCR技术在基因测序中起到关键作用。
通过扩增需要测序的DNA片段，可以获得足够的模板量，用于测序仪的读取。
2.2 基因克隆PCR技术可用于基因克隆，通过引物的设计，扩增目标DNA片段后，将其插入到表达载体中，实现目标基因的表达。
2.3 突变分析PCR技术可以用于突变分析，通过引物的设计，扩增包含突变位点的DNA片段，然后通过测序或其他分析方法确定突变的存在与否。
2.4 分子诊断PCR技术在分子诊断中广泛应用。
QPCR原理及应用
QPCR原理及应用实时定量聚合酶链式反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种快速、灵敏及准确的基因表达分析技术，它结合了聚合酶链式反应（PCR）和荧光探针技术，可以对目标基因在样品中的数量进行定量分析。
qPCR的原理：1.制备DNA模板：通过DNA提取技术，从感兴趣的样品中纯化出目标DNA。
2.PCR反应：将目标DNA及特异性引物和酶（聚合酶）放入PCR反应体系中，进行多个温度循环，使DNA的两条链分开，随后引物与DNA链特异性结合。
3.DNA合成：引物与DNA链结合后，酶开始合成新的DNA链，双链变为双链。
4.指数增加：经过多个PCR循环，目标DNA序列指数级增加。
5.荧光检测：利用荧光物质（荧光标记的探针）与PCR产物结合，通过荧光信号检测PCR产物的数量。
6.数据分析：根据荧光信号的强度，可以定量计算出目标DNA的初始数量，并进行数据分析。
qPCR的应用：1.基因表达分析：qPCR可以快速、准确地测量特定基因在不同样本中的表达水平，从而了解基因的功能及调控机制。
2.点突变检测：通过使用特异性引物和荧光标记探针，qPCR可以检测特定突变位点的存在与否，有助于基因突变的诊断和疾病的预测。
3.病原体检测：qPCR可以快速鉴定和定量病原体的存在，对于疾病的早期诊断、疫情监测有重要意义。
4.基因组拷贝数分析：qPCR可以快速、准确地测量基因组DNA的拷贝数变化，为研究基因组结构和进化提供重要线索。
5.表观遗传学研究：qPCR可以定量测量DNA甲基化和组蛋白修饰等表观遗传学修饰的水平，有助于揭示表观遗传学的调控机制。
总结：qPCR作为一种高分辨率、灵敏度高的基因表达分析技术，在分子生物学和医学领域具有广泛的应用前景。
它可以快速、准确地定量测量目标DNA的数量，因此在疾病诊断、病因研究、基因功能分析等方面具有重要作用。
随着技术的不断发展和创新，qPCR将会在更多领域得到应用，为科学研究和临床诊断提供更多有价值的信息。
QPCR原理及应用
QPCR原理及应用QPCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction）即定量聚合酶链式反应，是一种可以对DNA进行定量检测的分子生物学技术。
通过测定DNA模版的初始数量，能够准确地对靶DNA在样品中的量进行定量分析。
QPCR技术已经广泛应用于医学、农业、环境科学等众多领域，并且在疾病诊断、基因表达研究、生物安全监测等方面具有重要意义。
QPCR的原理：QPCR主要基于DNA聚合酶链式反应（PCR）的原理。
PCR技术通过DNA聚合酶，利用DNA引物和酶切的DNA模板来扩增特定DNA序列。
在PCR的每一个循环中，DNA模板会被酶切成两段，然后引物结合到目标DNA上并扩增。
然后，扩增的DNA产物作为下一个PCR循环的模板，以此循环反复扩增。
在QPCR中，扩增的DNA产物通过酶的同步检测来实时监测。
QPCR使用一种荧光探针，在引物结合区域的扩增过程中释放出荧光信号。
荧光信号的强度与扩增DNA的数量呈正比。
通过检测荧光信号的强度，可以确定DNA的初始数量。
QPCR的应用：1.疾病诊断：QPCR可以快速、准确地检测疾病相关基因的表达水平，从而帮助进行疾病的早期诊断和病情监测。
比如，QPCR可以检测癌症相关基因的表达水平，辅助肿瘤的早期诊断和治疗。
2.基因表达研究：QPCR能够定量检测基因的表达水平，从而帮助研究基因在细胞和组织中的功能调控机制。
比如，研究在药物处理、细胞因子刺激等条件下，特定基因的表达水平的变化。
3.遗传病筛查：QPCR可以对遗传病相关基因进行定量检测，从而帮助进行遗传病的筛查。
通过检测特定基因的突变和表达水平，可以早期发现遗传病，并进行相应的干预和治疗。
4.放射性污染监测：QPCR可以快速、敏感地检测放射性物质污染的程度和范围。
比如，监测环境中的放射性同位素污染，以保护公众健康。
5.植物基因改良：QPCR可以帮助筛选目标基因在转基因植物中的表达水平。
通过检测基因的表达水平，可以确定转基因植物是否具有目标特性，从而加速植物基因改良的进程。
PCR的基本原理及临床应用
PCR的基本原理及临床应用PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是一种能够在体外快速产生大量特定DNA片段的技术。
它在遗传学研究、医学诊断、犯罪指认等领域起到了重要的作用。
本文将探讨PCR的基本原理以及其在临床应用中的意义。
PCR的基本原理是通过采用酶的体外扩增技术，使得DNA的某一特定片段在体外得到迅速、精确的扩增。
PCR主要涉及三个步骤：变性、引物结合和扩增。
首先，将待扩增的DNA加热到94-96°C，使其变性为单链的DNA。
接着，通过降温至50-65°C，引物与目标DNA片段特异性结合。
最后，在72°C下，加入聚合酶，使DNA链得以延伸合成。
PCR作为一种灵敏度高、特异性强的技术，广泛应用于临床诊断领域。
临床应用中，PCR能够对各种疾病进行快速、准确的检测，因此在疾病预防、治疗和监测中发挥着关键作用。
下面将分别探讨PCR在各个领域的应用。
在遗传学研究中，PCR被广泛应用于基因定位、基因组测序以及DNA指纹等方面。
通过PCR技术，可以快速扩增出基因特定区域的DNA片段，进而进行基因型鉴定和突变检测。
此外，PCR还可用于研究人类种群遗传变异、基因表达差异以及基因修饰等方面，为遗传学研究提供了有力的手段。
在医学诊断中，PCR的应用范围更加广泛。
例如，PCR可用于检测感染疾病的病原微生物，如病毒、细菌、霉菌等。
通过扩增病原微生物的特定基因片段，可以迅速、准确地确定感染的种类和病原量，从而指导临床治疗方案的选择。
另外，PCR还可用于早期癌症的检测，通过分析癌细胞所特有的突变基因的存在与否，提高早期癌症的检出率，对癌症的早期治疗起到重要的作用。
此外，PCR在犯罪学领域也发挥着重要的作用。
通过扩增被检物体内特定的DNA片段，可以进行DNA指纹比对，用以法医学上的犯罪指认和疑案侦破。
PCR技术具有高度特异性和敏感性，即便是仅有微量的DNA样本，也能通过PCR技术得到足够的扩增产物，用以鉴定人员的身份，确保司法公正。
pcr技术在分子生物学中的应用
pcr技术在分子生物学中的应用PCR技术在分子生物学中的应用引言：PCR（聚合酶链式反应）是一种在分子生物学中广泛应用的技术，它可以快速、准确地扩增DNA片段。
PCR技术因其高效、灵敏和可靠的特点，被广泛应用于基因检测、疾病诊断、基因工程、法医学等领域。
本文将深入探讨PCR技术在分子生物学中的应用。
一、基因检测PCR技术在基因检测中有着重要的应用。
通过PCR扩增特定基因片段，可以检测个体是否携带某种基因突变或遗传病。
例如，PCR技术可以用于检测乳腺癌相关基因BRCA1和BRCA2的突变，帮助判断个体是否具有遗传乳腺癌的风险。
此外，PCR技术还可以用于检测病原体的基因，例如新冠病毒的核酸检测就是基于PCR原理。
二、疾病诊断PCR技术在疾病诊断中具有重要的应用价值。
通过PCR扩增患者体液中特定病原体的DNA或RNA片段，可以快速准确地检测出病原体的存在，从而帮助医生进行疾病的诊断。
例如，PCR技术可以用于检测艾滋病病毒的存在，帮助医生判断患者是否感染了艾滋病。
此外，PCR技术还可以用于检测细菌感染，例如通过检测脑脊液中的细菌DNA片段来诊断脑膜炎。
三、基因工程PCR技术在基因工程领域有着广泛的应用。
通过PCR扩增目标基因片段，可以快速获得大量的目标DNA。
这样就可以进行基因克隆、基因插入等操作。
例如，PCR技术可以用于构建重组质粒，将目标基因插入到质粒中，从而实现基因的表达和研究。
此外，PCR技术还可以用于基因突变的引入，通过引入特定突变的PCR产物，可以实现特定基因的突变。
四、法医学PCR技术在法医学中有着重要的应用。
通过PCR扩增样本中特定基因片段的DNA，可以对犯罪现场的DNA进行检测和鉴定。
例如，在刑事案件中，通过PCR技术可以检测凶手遗留在现场的DNA，从而确定凶手的身份。
此外，PCR技术还可以用于亲子鉴定，通过比对父母和子女的DNA片段，确定亲子关系。
总结：PCR技术作为一种高效、灵敏和可靠的分子生物学技术，被广泛应用于基因检测、疾病诊断、基因工程、法医学等领域。
新型PCR技术在疾病检测中的应用
新型PCR技术在疾病检测中的应用PCR，全称聚合酶链式反应，是一种基因分析技术。
它可以通过扩增基因片段，从而检测出一定的遗传物质，如病毒、细菌、真菌等微生物的核酸，以及人体内的DNA、RNA等。
PCR技术在世界范围内得到了广泛的应用。
特别是在疾病诊断和治疗方面，PCR技术被认为是一种高效、准确的检测方法。
但是由于道德、伦理以及人体隐私等问题，PCR技术在医学领域中也有着一定的限制。
而新型PCR技术则是一种能够解决这些问题的前沿技术，它将极大地推动PCR在医学领域的应用和发展。
一、新型PCR技术的定义和特点新型PCR技术是指目前正在研究和开发的一种基于传统PCR 技术的新型DNA扩增技术。
与传统PCR技术相比，新型PCR技术具有以下特点：1. 可针对复杂样本进行检测：由于传统PCR技术存在很多的局限性，如对复杂样本检测的限制、对难以扩增的基因片段的限制以及对污染物的敏感性等，因此在一定程度上影响了PCR技术的应用效果。
而新型PCR技术则克服了这些缺陷，能够更精确、快速地对复杂样本进行检测。
2. 检测速度更快：传统PCR技术中，扩增过程需要经历多个温度阶段，需要耗费相对较长的时间。
而新型PCR技术则能够在更短的时间内完成扩增过程，极大地提高了检测效率。
3. 更加精准：新型PCR技术采用新型扩增酶，其扩增效率和精准度均得到了极大的提升。
同时，新型PCR技术的检测结果更加准确可靠，能够有效减少虚假阳性和虚假阴性的发生。
二、新型PCR技术在疾病检测中的应用1. 新型PCR技术在病毒检测中的应用新型PCR技术可以应用于多种病毒的检测，如流感病毒、艾滋病病毒、丙型肝炎病毒等。
与传统PCR技术相比，新型PCR技术不仅能够更快、更精准地检测出病毒，而且对复杂样本的检测也具有明显的优势。
2. 新型PCR技术在癌症诊断中的应用新型PCR技术可以在早期发现某些癌症的存在，如乳腺癌、肺癌等，可以通过检测DNA样本来确定是否存在肿瘤转移或复发的情况。
分子生物学技术在基因诊断中的应用
分子生物学技术在基因诊断中的应用基因诊断是一项非常重要的医学检测技术，它通过对个体的基因组进行分析来确定遗传疾病的存在与否。
分子生物学技术作为基因诊断的重要工具，为医学界提供了更准确、高效和可靠的诊断手段。
本文将介绍分子生物学技术在基因诊断中的应用，并探讨其优势和挑战。
一、聚合酶链式反应(PCR)技术的应用聚合酶链式反应(PCR)是一种重要的分子生物学技术，它通过扩增目标DNA序列来大幅增加其数量。
在基因诊断中，PCR技术可以用来检测突变基因、寻找致病基因以及判断基因型。
例如，在遗传性疾病的诊断中，PCR可以扩增含有突变基因的DNA片段，并通过电泳分析确定突变的存在。
二、基因测序技术的应用基因测序技术是通过解读DNA序列来确定基因组中特定基因的序列信息。
在基因诊断中，基因测序技术可以用于寻找突变基因、检测基因表达变异以及预测个体的遗传风险。
例如，通过测序特定基因区域的DNA序列，可以确定遗传性疾病相关基因中的突变，并进一步评估患者患病的风险。
三、DNA芯片技术的应用DNA芯片技术是一种高通量的基因分析方法，可以同时检测数以千计的基因表达水平。
在基因诊断中，DNA芯片技术可以用来筛查患者的基因表达谱，从而确定与疾病相关的基因变化。
例如，在肿瘤诊断中，通过对肿瘤组织中基因表达谱的比较，可以确定与肿瘤相关的致病基因，为肿瘤治疗选择提供指导。
四、DNA甲基化分析技术的应用DNA甲基化分析技术是研究DNA甲基化修饰的一种方法，DNA 甲基化在基因表达和基因组稳定性中起着重要的调控作用。
在基因诊断中，DNA甲基化分析技术可以用来检测致病基因的甲基化状态，从而揭示基因调控异常与疾病之间的关系。
例如，在某些遗传性疾病的诊断中，通过检测特定基因的甲基化程度，可以确定该基因的表达异常是否与疾病相关。
总结起来，分子生物学技术在基因诊断中发挥着重要作用。
PCR技术可以快速扩增目标DNA序列，实现敏感的突变检测；基因测序技术可以准确解读DNA序列信息，发现疾病相关的基因变异；DNA芯片技术可以高通量地分析基因表达谱，揭示基因与疾病之间的联系；DNA甲基化分析技术可以研究基因的表观遗传调控，深入了解遗传疾病的发生机制。
pcr的临床意义及应用
pcr的临床意义及应用
PCR（聚合酶链式反应）是一种重要的分子生物学技术，其在医学
领域中有着广泛应用。
本文将从PCR的临床意义和应用两个方面展开
探讨。
首先，PCR在临床上有着极为重要的意义。
通过PCR技术，医生
们可以快速、准确地检测出一系列疾病。
例如，在感染性疾病的诊断中，PCR可以检测出病原体（如病毒、细菌等）的存在，有利于早期
发现和治疗。
此外，PCR还可以用于遗传病的基因检测，帮助人们了
解自己的基因情况，预防患病。
因此，PCR在临床诊断中具有不可替
代的地位。
其次，PCR技术在临床应用上也非常广泛。
在疾病预防和控制方面，PCR可以用于流行病学调查、疫情监测等工作。
同时，在肿瘤的诊断
和治疗中，PCR也扮演着重要的角色。
通过检测肿瘤细胞的特定基因
突变，可以帮助医生选择最佳的治疗方案，提高治疗效果。
此外，
PCR还可以用于药物敏感性检测、免疫学研究等多个领域，为医学研
究和临床实践提供强大支持。
综上所述，PCR的临床意义和应用远不止以上所述，随着科学技术
的不断进步，PCR技术在医学领域的应用前景将会更加广阔。
PCR的
发展使得疾病的诊断和治疗变得更加精准和高效，极大地提高了人们
的生活质量，为医学事业的发展贡献力量。
PCR技术的不断完善和创新，将为医学领域带来更多惊喜和突破，值得期待。
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聚合酶链式反应及其在基因诊断中的应用聚合酶链式反应于1983年由美国Cetus公司的发明，并和定点突变的发明者一起荣获1993年度诺贝尔化学奖，为生命科学领域的研究开创了崭新时代。
一、PCR反应原理和反应过程DNA的体外复制包括3个步骤：变性（denaturation）:94 ?C ~95 ?C退火（annealing）:40 ?C ~70 ?C延伸（extension）:72 ?C3个步骤作为PCR的一个循环，每当完成一个循环，一个分子的模板被复制为二个，产物量以指数形式增长。
二、PCR的反应体系和反应条件（一）PCR反应体系参与PCR反应的主要成份:模板、引物、dNTP、Taq DNA聚合酶和缓冲液等。
1 模板包括基因组DNA、RNA、质粒DNA、线粒体DNA等。
RNA作为模板时，须先将RNA 逆转录为cDNA，再以 cDNA作为扩增的模板。
模板量：1000ng、500ng、100ng、50ng?2、引物（Primers）引物决定PCR扩增产物的特异性和长度，是化学合成的寡核苷酸片段。
引物的合成可以采用化学方法。
引物设计时必须遵循一些原则。
设计引物的原则：1）二条引物分别位于被扩增片段的两端，与模板正负链序列互补2）长度为18 ~ 25个核苷酸3）二条引物之间避免形成引物二聚体4）引物的碱基组成应平衡5）引物退火温度计算：Tm=2（A+T）+（C+G）6）引物的5`端可被修饰（引入酶切位点、引入突变位点、生物素等标记）3、脱氧核苷三磷酸（dNTP）是dATP、dCTP、dGTP和dTTP4种脱氧核苷三磷酸的混合物。
反应体系中各种核苷酸的浓度必须一致，浓度过高虽能加快反应速度，但非特异性扩增也随之增加dNTP浓度：20 ~ 200umol/L,浓度升高增加非特异性扩增。
4、DNA聚合酶从一种生活在热泉（80℃~90℃）中的水栖噬热菌（Thermus aquaticus, Taq）中提取，有很高的耐热稳定性。
Taq 酶的作用:模板指导下，以dNTP为原料，在引物3’-OH末端加上脱氧单核苷酸，形成3’, 5’ -磷酸二酯键，使DNA链沿5’→3’方向延伸，催化DNA合成。
最适酶量：（酶量过多，导致非特异性扩增）Taq DNA聚合酶复制的保真性，Taq DNA聚合酶无3’→5’外切酶活性，因而无校正功能，在复制新链的过程中会发生碱基错配。
Taq DNA聚合酶在每次循环中产生的移码突变率为1/30000，碱基替换率为1/8000，故扩增的片段越长，错配的机率越高。
耐热的 DNA多聚酶有Pwo DNA polymerase、Tth DNA polymerase、Pfu DNA polymerase具有较高的热稳定性，较高的保真性，降低碱基错配率2 ~ 10倍。
5、镁离子浓度镁离子浓度是一个至为关键的因素，对于反应系统本身、稳定核苷酸和提高Taq 酶的活性有直接影响。
虽然Taq 酶的活性只与游离的Mg2+浓度有关，但PCR反应体系中dNTP、引物、模板DNA及鳌合剂的存在均可与Mg2+结合而降低游离Mg2+的浓度从而影响酶的活性。
当dNTP浓度为200umol/L时，MgCl2的浓度为L较宜。
6、其它反应因素pH：调节至酶反应所需的最适pH（ pH =左右）盐：合适的盐浓度有利于稳定杂交体，有利于引物与模板杂交基质：BSA、gelatin 、Tween20、DTT等（牛血清白蛋白或明胶等基质可以保护Taq 酶的活性）（二）PCR的反应条件反应温度（变性、退火、延伸）反应时间（变性、退火、延伸）循环次数（PCR效率及产物量）1、温度变性温度：94 ~ 97 ℃退火温度：低于引物Tm 5 ℃左右。
温度过高会降低扩增效率；温度过低：增加非特异性扩增。
延伸温度：72度，此时Taq酶具有较高的酶促活性。
2、时间第一次变性应给予足够时间（5 ~ 7分钟）。
每一个步骤所需时间取决于扩增片段的长度，一般为30秒~ 1分钟，时间过长易导致非特异性扩增3、循环次数重复次数一般设为25～35个循环扩增反应的平台效应：理论上，PCR反应产物呈指数性增长，但这种增长形式在扩增25-25个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台，此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长。
平台出现得迟早与模板的初始量有关，模板初始量越多，平台出现得越早。
平台效应产生的因素：引物二聚体的产生、反应产物、各组分的消耗和变性、引物和已扩增的DNA片段间的竞争等。
三、PCR技术的质量控制（一）实验室的规范化设置实验室的规范化设置：试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应区、产物分析区PCR技术的质量保证：基因扩增检验的全过程的质量保证室内质量控制和室间质量评价防污染体系：正确设置实验室、严格规范实验操作、完整有效的去污染措施、反应体系中以dUTP取代dTTP，再加入尿嘧啶糖苷酶（UNG）即可破坏以往的扩增产物、人员培训、试剂质量（二）PCR技术的质量保证分析前因素：标本采集、运送、稳定化处理、贮存分析中因素：核酸提取、逆转录、扩增反应、设置对照系统（包括阴性对照、阳性对照、内对照等）分析后因素：报告形式、反馈的信息等三、常见问题与解决策略1、扩增失败的原因（1）试剂错加或漏加实验中发现阳性对照扩增失败，可用原试剂重复一次，以确定试剂是否错加或漏加。
（2）试剂失效若以上方法仍不出阳性结果，可新启封一套试剂，有阳性标本，可用此标本与阳性模板同时再检一次加以确认。
试剂中，阳性模板失效较常见，仅阳性模板失效，更换模板或用阳性标本代替即可。
当怀疑试剂有质量问题时，用保存的阳性标本作为阳性对照检测一次，即可得到明确结论。
（阳性标本保存时间不宜过长，一般不要超过3周，并经常更换。
）（3）扩增仪温度偏差扩增仪温度的偏差是PCR失败最常见因素。
退火、延伸，上下偏差2℃通常不影响实验结果。
但变性高于96℃或低于92℃，对某些检测带来不良结果，甚至导致实验失败。
2、拖尾现象（1）裂解所用沉淀物过多标本裂解后未经充分离心，上清较混浊。
组织标本虽经规范化处理，会有拖尾产生，标本是否新鲜相关。
（2）裂解液、反应液变质标本中DNA含量过高或杂质过多。
降低加样量拖尾可明显改善（3）Taq酶加量过大或扩增循环数太多3、非特异条带（1）试剂因素（引物特异性不佳， Taq酶质量问题）（2）个别标本引起，无法避免（3）酶量过大，循环次数太多（4）裂解时沉淀物太多4、引物二聚体（1）试剂因素PCR试剂均会或多或少产生一些引物二聚体。
二聚体形成的原因：引物之间的互补和瞬时错配。
引物二聚体过强，则会降低PCR效率，导致检测敏感性下降。
（2）操作不当当一个反应体系建立后，在室温放置时间过长，会引起扩增后的二聚体加重。
因此，PCR操作时，一旦管内所有试剂均加好后，应立即上机扩增。
一旦由于某种原因不能扩增，则将反应管置4℃暂存。
5、假阳性污染不一定导致所有标本均出阳性结果，有些标本中存在一定的抑制剂，虽受轻微污染但不足以出阳性结果。
但会引起阴性对照出现阳性结果。
由污染引起的阳性条带一般较弱，标本出现的条带强度基本一致或差异不明显。
6、非特异引起某一病原体通常不出现非特异带，但个别标本偶有一条与阳性对照不一致的带且强度也较好，则多半为阳性，是由野生突变株引起。
有时可看到某一标本可出现2-3条带，若与阳性对照位置在同一水平上的带最强，其余带则较弱，则仍可判阳性结果，否则应判阴性。
二温法扩增可有效降低非特异扩增。
对有非特异条带的标本，必要时可用94℃变性30秒、64℃延伸60秒，35次循环的条件，再检一次，往往可以得到满意结果。
7、假阴性（1）试剂失效当阳性对照出阴性结果，并用以往保存的阳性标本也不出阳性结果时，排除了仪器因素，便可认定试剂中反应液或Taq酶失效。
（2）裂解液失效裂解液室温放置过久或多次反复冻融，导致裂解液效果明显下降，引起阳性率下降和假阴性的常见原因。
由于反应体系正常，仅裂解液失效，因此，阳性对照不受影响。
（3）试剂贮存过久试剂贮存过久（接近或超过有效期，其间已反复冻融数次），导致检测敏感性下降，而出现假阴性。
（4）标本处理不当（见标本处理）（5）变性温度偏低不同病原体DNA由于所含G、C碱基对的百分比不同，Tm也不一样。
有些DNA所含G、C碱基对丰富，当变性温度低于92℃时，双链DNA不能完全解链，扩增往往失败，产生假阴性结果。
以PCR为基础的相关技术以PCR为基础的相关技术逆转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR)定量PCR (quantitative PCR )多重PCR (multiplex PCR)免疫PCR差异显示PCR (differential display PCR, DD-PCR)PCR诱导定点突变原位PCR (in situ PCR)一、逆转录PCR（RT-PCR）以细胞内总RNA或mRNA为材料进行体外扩增的技术。
主要用于克隆 cDNA、合成cDNA探针，检测RNA病毒、分析基因表达等逆转录生成cDNA方式：以随机进行的PCR扩增所需的下游引物作为逆转录反应的引物以oligo(dT)作为引物， mRNA3`末端polyA尾与之互补以人工合成的随机序列六核苷酸混合物作为引物，进行扩增二、定量PCR对DNA或RNA样本的靶序列进行定量分析。
主要用于基因表达的分析、病原体核酸的检测等。
在定量PCR反应体系中，除了常规PCR反应所需的材料和试剂外，还必须引入内参照系统。
内参照系统一般选用与待测序列结构无关的基因常用的内参照基因是 -肌球蛋白基因荧光定量PCR（fluorescence quantitative PCR,FQ-PCR），又称实时PCR，是目前较精确的进行定量检测PCR的方法。
FQ-PCR通过荧光信号对PCR过程中产物量进荧光信号的检测方法：DNA结合染料技术、水解探针技术（TaqMan probe）技术、杂交探针技术三、多重PCR在同一反应体系中加入多对引物，同时扩增一份DNA样本中多个不同序列的靶片段。
四、差异显示PCR（differential display PCR,DD-PCR）一种以逆转录PCR为基础的研究基因表达差异的技术。
DD-PCR主要用于肿瘤和多种疾病的分子遗传学研究，是目前筛选基因表达差异最有效的方法。
五、免疫PCR将PCR产物用ELISA方法加以检测的技术。
在对目的基因扩增时，dNTP中同时混有用生物素标记的Bio-16-dUTP，使扩增产物带有生物素标记。
若该产物能与突变点特异的寡核苷酸探针（3’端地高辛11-DIG-ddUTP标记）杂交，则该产物便带有地高辛标记信号，可利用与抗地高辛抗体共价结合的酶标检测系统进行显色反应，从而判断突变的存在。