聚合酶链式反应
生化试验教材实验九：聚合酶链式反应
避免使用过期的试剂和仪器，以免影 响实验结果和造成安全隐患。
对于高温、高压、易燃、易爆、有毒 有害等危险品，应严格按照规定进行 管理和操作。
实验操作规范
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在实验前应仔细阅读实 验步骤和注意事项，确 保对实验过程有充分的四种脱氧核苷酸， 即dATP、dCTP、dGTP和dTTP。
Taq DNA聚合酶
一种热稳定性的DNA聚合酶，负责 催化DNA的合成。
实验设备准备
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03
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PCR仪
提供PCR反应所需的温度循环 ，包括变性、退火、延伸等步 骤的温度设置和时间控制。
离心机
用于分离和纯化DNA、RNA 等生物分子。
结果验证与结论
结果验证
通过重复实验、使用不同引物或对 PCR产物进行测序等方法，验证结果 的可靠性和准确性。
得出结论
根据实验结果，可以得出关于基因表 达、变异或物种鉴定的结论。同时， 应注意结果的适用范围和局限性，以 及与文献报道的比较。
05 注意事项与安全
实验安全注意事项
实验前应穿戴实验服和防护眼镜，确 保个人防护措施到位。
移液器
精确移取和混合各种试剂。
显微镜
观察细胞和组织样本，以及 PCR扩增产物的大小和形态。
实验试剂准备
01
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Buffer
一种化学试剂，用于维持 溶液的酸碱度和离子浓度， 以稳定酶的活性和促进酶 促反应的进行。
MgCl2
提供PCR反应所需的镁离 子，镁离子是Taq DNA聚 合酶的激活剂。
去离子水
环境和人体造成危害。
聚合酶链式反应PCR基本原理
• ④两引物间不应存在互补序列，尤其是防止3′ 端旳互补重叠。
• ⑤引物与非特异扩增序列旳同源性<70%。
• ⑥引物旳3′端碱基一定要与模板互补配对；而 5′则可相对不严，甚至还可做某些修饰。
• 2、PCR旳模板
• 欲扩增旳核酸片段是PCR旳模板。
• 能够是DNA，也能够是RNA。当用RNA作模板时， 首先要进行逆转录生成cDNA，然后再进行正 常旳PCR循环。
3、耐热旳DNA聚合酶
• 在PCR反应中，DNA聚合酶是最关键旳原因 之一。TaqDNA聚合酶是目前PCR中应用最广 泛旳耐热DNA聚合酶。
• TaqDNA聚合酶旳功能是：以DNA为模板，以 四种dNTP为原料，以引物3′端为出发点， 按5′→3′旳方向，以碱基配对方式合成 新旳DNA链。
寡核苷酸。
• 引物决定PCR扩增产物旳特异性和长度。 • PCR引物旳设计与PCR反应旳成败关系亲密。 • PCR反应中旳引物有两条，即5′端引物和3′
端引物，分别与相应旳模板链互补。
• 引物设计遵照下列原则：
• ①引物长度一般为15～30个核苷酸。
• ②引物中碱基旳分布尽量随机，尽量防止多聚 嘌呤或多聚嘧啶。
二、PCR旳基本原理
• PCR技术实际上是DNA旳体外扩增技术。 • 其原理类似于DNA在体内旳复制过程。 • 反应条件――模板DNA、寡核苷酸引物、DNA
聚合酶、四种dNTP原料和合适旳缓冲液体系， 在一定旳温度下，经过反复旳过程，就能够 完毕DNA旳体外合成。
• 这些过程都是经过控制温度来实现旳，即经 过 变 化 温 度 引 起 变 性 （ denature ） 、 退 火 （ annealing ） 和 延 伸 （ extension ） ， 使 DNA得以复制。
聚合酶链式反应
聚合酶链式反应聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种常用的分子生物学技术，可以在体外扩增目标DNA序列，从而使其数量迅速增加，为DNA研究提供了强有力的工具。
PCR技术起源于20世纪80年代初，由美国科学家凯瑟琳·穆利斯和基思·斯特拉尔纳发明，并因其突出的重要性和广泛的应用而获得了1993年的诺贝尔化学奖。
本文将围绕PCR技术的原理、步骤以及应用进行详细阐述。
一、PCR技术原理PCR技术基于DNA的复制原理，通过体外合成适配体和引物，利用DNA聚合酶酶活性反复扩增目标序列。
其基本原理可以概括为三个关键步骤：变性、引物的结合和扩增。
1. 变性PCR反应体系首先会将目标DNA进行变性，即高温将双链DNA分离为两个单链DNA。
在95℃的高温条件下，DNA的双链会解开，形成两条单链模板。
2. 引物的结合降温至目标DNA模板的退火温度，引物（即引导DNA合成的小片段）会与目标序列的两个单链DNA的3'末端结合。
引物结合的位置即起始扩增的位置。
3. 扩增在适宜的温度下，引物结合后的DNA模板会被热稳定的DNA聚合酶酶活性进行扩增。
DNA聚合酶沿着模板链合成新的DNA链，从而扩增出与模板序列相对应的新DNA。
经过多轮扩增，目标DNA序列数量呈指数倍增，从而被显著放大。
二、PCR技术步骤PCR技术通常包括以下三个基本步骤：前处理、循环反应和后处理。
1. 前处理在进行PCR反应之前，需要对样本进行前处理。
常见的前处理步骤包括DNA提取、纯化和定量。
样本纯化可以去除携带有抑制剂的杂质，提高反应效果。
DNA定量可以帮助确定反应的适当体积和初始DNA浓度。
2. 循环反应循环反应是PCR技术的核心步骤，它包括一系列高温变性和退火扩增的循环。
每一个循环都包括三个温度阶段：变性、退火和延伸。
反应体系会经历多个循环，每一轮循环都会使目标DNA数量倍增。
3. 后处理PCR反应结束后，通过凝胶电泳等方法对扩增产物进行分析和验证。
聚合酶链式反应
行扩增。
实时监测
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在PCR过程中，可以通过实时荧光检测或凝胶电泳等方法监测
扩增产物。
后续处理阶段
产物分析
数据整理与报告
PCR结束后，对扩增产物进行分析，如凝胶 电泳、测序等，以确定扩增的特异性。
整理实验数据，编写实验报告，包括PCR产 物的大小、特异性、重复性等信息。
质量控制
防止污染措施
确保实验过程符合质量控制标准，如引物 特异性、模板纯度等。
1990年代
第三代PCR仪出现，采用半导体材料 进行温度控制，提高了反应速度和灵 敏度。
05
04
1985年
第二代PCR仪问世，实现了温度自动 控制，提高了扩增效率和特异性。
在科学研究中的应用
基础研究
PCR技术可用于基因克隆、基 因突变分析、DNA测序等基础
研究领域。
医学诊断
PCR技术广泛应用于遗传病、 传染病、肿瘤等疾病的诊断和 监测。
THANKS
感谢观看
转基因作物检测
利用PCR技术，可以对转基因作物进行检测，确保食品安全和生态 安全。
动物疫病检测
通过PCR技术，可以对动物疫病进行快速、准确的检测，预防和控 制动物疫病的传播。
动物品种鉴定
利用PCR技术，可以对动物品种进行鉴定，保护动物资源和生态平衡。
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PCR技术的未来展望
新技术的开发与改进
下一代PCR技术
个性化医疗
根据基因检测结果，可以为患者 提供个性化的治疗方案，提高治 疗效果和生存率。
生物进化研究
物种鉴定和分类
利用PCR技术，可以对生物物种进行鉴定和 分类，研究物种的进化关系和系统发育。
生物多样性研究
第五章聚合酶链式反应
第五章聚合酶链反应及其相关技术PCR技术从Mullis最初建立到现在共约20多年时间，因为此技术具有高特异性、高敏感性和简便快捷等特点而备受人们广泛应用，许多新型的PCR技术或由PCR衍生的新技术正不断出现，使PCR技术由最初的单一技术体系逐步发展成为一系列的技术综合。
PCR技术在体外快速特异地复制目的DNA序列，理论上能将极其微量的（pg DNA）目的基因在较短的时间内（通常1-3h）扩增达到纳克、微克甚至毫克级水平，使产物极易被检测。
因此PCR技术目前已经成为人们获取目标基因的最常用的方法之一，Mullis因其杰出的贡献，于1993年获得了诺贝尔化学奖。
聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR) 是体外酶促扩增DNA或RNA序列的一种方法，它是一种不需要借助于分子克隆而可以在体外快速繁殖、扩增DNA的技术,它与分子克隆（molecular cloning）、DNA测序（DNA sequencing）一起构成了分子生物学的三大主流技术。
在这三项技术中，PCR技术自1983年由美国Cetus公司Kary.Mullis提出并于两年后建立以来，得到了快速的发展，成为最常用的分子生物学技术之一。
这项技术使人们能够在数小时内通过试管中的酶促反应将特定的DNA片断扩增数百万倍，给生命科学领域的研究手段带来了革命性的变化。
由于PCR技术的实用性和极强的生命力，PCR技术成为生物科学研究的一种重要方法，极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。
目前，一系列的PCR方法被设计开发出来，并广泛应用于基因扩增与分离、医疗诊断、基因突变与检测、分子进化研究、环境检测、法医鉴定等诸多领域。
5.1 PCR技术原理聚合酶链式反应（PCR）是利用DNA片段旁侧两个短的单链引物，在体外快速扩增特异DNA片段的技术。
它应用热稳定的聚合酶，通过双链DNA模板的热变性、引物退火和引物延伸的重复循环，DNA片段以指数方式增加了百万倍。
聚合酶链式反应
定义（英文全称：Polymerase Chain Reaction），性的分析方法发展到定量测定；从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。
到目前为止，PCR技术已有十几种之多，例如，将PCR与反转录酶结合，成为反转录PCR，将PCR与抗体等相结合就成为免疫PCR等。
编辑本段技术原理复制成同样的两分子挎贝。
在 简便、快速 PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。
扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。
对标本的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。
可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。
编辑本段反应五要素 4种dNTP混合物各200umol/L 引物各10～100pmol 模板DNA0.1～2ug TaqDNA聚合酶2.5u Mg2+1.5mmol/L 加双或三蒸水至100ul PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+)编辑本段PCR反应条件的选择 70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子 70℃ 60核苷酸/S/酶分子 55℃ 24核苷酸/S/酶分子 高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。
PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。
PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。
3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。
延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。
对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
编辑本段酶及其浓度2.0mmol/L为宜。
Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
聚合酶链式反应
反应的控制
变性温度和时间 95℃，30s 退火温度和时间低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃ 延伸温度和时间 72℃，1min/kb（10kb内） Tm值=4(G+C) +2(A+T) 循环次数 ：一般为25 ～ 30次。循环数决定PCR扩增的产量。模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有 效的扩增量。但循环数并不是可以无限增加的。一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性 逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。
引物退火
退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后 在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响。
Hale Waihona Puke 物延伸引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略延伸时 间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。
PCR原理
PCR原理
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚 合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性 解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合 酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂 贵，制约了PCR技术的应用和发展。
耐热DNA聚合酶-Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不 需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临 床。
聚合酶链式反应
聚合酶链式反应简介聚合酶链式反应（PCR）是一种重要的分子生物学技术，被广泛应用于基因分析、基因工程、医学诊断等领域。
PCR 能够快速、高效地扩增特定DNA片段，使得原本数量有限的DNA样本得以增加，从而便于进行后续实验。
PCR的核心原理是利用DNA聚合酶酶活性，通过不断重复三个步骤（变性、退火、延伸），在适宜的反应条件下，将目标DNA序列扩增至数百万份的数量。
依靠PCR技术，无需使用传统的细菌培养方法，仅需少量DNA样本和简单的实验设备，即可实现高效扩增目标DNA。
PCR反应步骤反应体系构建PCR反应所需的关键成分包括目标DNA模板、DNA聚合酶、引物（primer）、核苷酸和反应缓冲液。
引物是一对短的DNA片段，其序列与目标DNA序列上的起始和终止部分的互补序列匹配。
反应缓冲液是维持PCR反应过程中所需酶活性的化学平衡和适宜pH的缓冲物质。
变性PCR反应开始时，反应体系中的DNA样本被放置在高温环境中（通常为94-98摄氏度），使其双链DNA解离为两条单链DNA。
这个步骤可以通过加热反应体系来实现，高温会断裂氢键，使DNA的双链解开。
退火在反应体系降温至适宜的温度范围时（通常为50-65摄氏度），引物与目标DNA序列上的互补区域结合形成稳定的双链结构。
引物的选择非常重要，其应与目标DNA序列完全匹配，以确保选择性扩增。
延伸DNA聚合酶将新的核苷酸从反应缓冲液中获得，并在目标DNA的3’末端上依次加入。
这个过程被称为延伸，其速率与延伸温度和所用聚合酶的酶活性相关。
通常延伸温度为60-72摄氏度。
经过以上三个步骤的循环反复进行，每一轮都会使目标DNA序列数量翻倍。
因此，PCR可以在短时间内扩增出大量的目标DNA片段。
PCR应用PCR技术在生物学研究、医学诊断、疾病预防和基因工程等领域有着广泛的应用。
基因分析PCR被广泛用于分析基因的结构和功能。
通过PCR，可以快速扩增出感兴趣的DNA片段，然后进行测序分析、限制性酶切或其他分子生物学实验，以研究目标基因的结构和功能。
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矿产资源开发利用方案编写内容要求及审查大纲
矿产资源开发利用方案编写内容要求及《矿产资源开发利用方案》审查大纲一、概述
㈠矿区位置、隶属关系和企业性质。
如为改扩建矿山, 应说明矿山现状、
特点及存在的主要问题。
㈡编制依据
(1简述项目前期工作进展情况及与有关方面对项目的意向性协议情况。
(2 列出开发利用方案编制所依据的主要基础性资料的名称。
如经储量管理部门认定的矿区地质勘探报告、选矿试验报告、加工利用试验报告、工程地质初评资料、矿区水文资料和供水资料等。
对改、扩建矿山应有生产实际资料, 如矿山总平面现状图、矿床开拓系统图、采场现状图和主要采选设备清单等。
二、矿产品需求现状和预测
㈠该矿产在国内需求情况和市场供应情况
1、矿产品现状及加工利用趋向。
2、国内近、远期的需求量及主要销向预测。
㈡产品价格分析
1、国内矿产品价格现状。
2、矿产品价格稳定性及变化趋势。
三、矿产资源概况
㈠矿区总体概况
1、矿区总体规划情况。
2、矿区矿产资源概况。
3、该设计与矿区总体开发的关系。
㈡该设计项目的资源概况
1、矿床地质及构造特征。
2、矿床开采技术条件及水文地质条件。