LAB新生儿溶血病检测操作规程D
新生儿溶血病血清学检查标准操作规程
新生儿溶血病血清学检查标准操作规程(一)检验目的检测孕妇产前与其丈夫ABO及Rh血型相容性、孕妇IgG 抗体效价、产后新生儿体内不相容抗体存在情况、新生儿与产妇之间血型相容性，为新生儿溶血病的预防、诊断及治疗提供可靠的实验室依据。
(二)检验原理新生儿溶血病是由母婴血型不合，母亲体内与新生儿红细胞抗原不配合的IgG性质的血型抗体进入新生儿体内，破坏新生儿或胎儿红细胞而引起，可发生在胎儿期和新生儿早期，溶血严重者可出现死胎而流产，存活者则有不同程度的新生儿黄疸。
新生儿溶血病产前诊断方法主要包括检测胎儿父母的ABO及Rh血型、孕妇不规则抗体筛查、外周血抗A ／抗B或Rh抗体效价来判断新生儿溶血病发生的可能性及严重程度；新生儿溶血病产后诊断主要包括母子ABO及RhD 血型鉴定试验、新生儿标本三项试验，为临床诊断及进一步采取治疗手段提供可靠的依据。
(三)适用范围适用于新生儿溶血病产前、产后血型血清学试验。
(四)设备性能参数参见血清学专用离心机、达亚美ID离心机、达亚美ID 孵育器、强生Ortho BioVue离心机及各全自动血型／配血系统使用说明书。
(五)器材与试剂1.器材血清学专用离心机、达亚美ID离心机、达亚美ID 孵育器、强生Or-tho BioVue离心机、塑料软试管、塑料硬质试管(75mmXl2mm)、试管架、一次性塑料滴管、记号笔、移液枪、一次性移液枪头。
2.试剂DiaMed ABO／RhD血型卡、OrthoBioVueABO ／RhD血型卡、抗A、抗B血清、Rh分，型血清、生理盐水、抗球蛋白试剂(市售单克隆)、抗体筛查试剂红细胞、抗体鉴定试剂红细胞、致敏的阳性对照细胞(自制)。
(六)标本要求1.夫妇标本EDTA-K2或EDTA-K3抗凝全血≥3ml(手工操作时也可以使用不抗凝标本)，经B600-A型离心机在 1 760g条件下，离心5分钟，离心后无溶血及明显乳糜。
2.患儿标本EDTA-K2或EDTA-K3抗凝全血≥3ml(手工操作时也可以使用不抗凝标本)，经B600-A型离心机在 1 760g条件下，离心5分钟，离心后无明显乳糜。
新生儿溶血病产前产后检测操作步骤
产前血型血清学检查标本要求：夫妻双方抗凝血2ml（尽量要求父亲抗凝血2ml，非必要），母亲促凝血3-5ml（血清）。
第一步：取两个试管分别标记 A 和BA管 700 μL生理盐水 B管（从A管取200 μL混合液+100 μL母亲血清混匀再加入200 μL血浆IgM稀释液）混匀 B管封口绑紧37℃温育1小时。
第二步:紧接着做父母ABO血型、RH型和母亲的不规则抗体。
第三步：取六个试管，分别标记123456，每管里面加200 μL盐水（父亲AB型需要同时做IgG抗A效价和IgG抗B,各做1次）。
第四步：等B管温育时间到了，从B管吸200微升到1管，混匀后从1管吸200 μL到2管........从5管吸200 μL到6管，依次添加稀释（倍比稀释）。
第五步：取不规则卡标记好 6 5 4 3 2 16 5 4 3 2 11.所有孔先分别加入50 μL父亲（与父亲同型）的0.8%红细胞悬液。
2.然后每孔再依次加入相对应管号里面的稀释液50 μL（防止交叉污染，从浓度最低往最高依次加）。
第六步：1.放到37℃温箱温育15分钟。
2.离心5分钟，取出判读结果。
注：判读结果往前推一位（例如6号孔是阳性，就报5号管是阳性）。
母亲RhD阴性血型，不用加入血浆IgM稀释液，不用37℃温育1小时。
直接第二步同上。
产后血型血清学鉴定标本要求：新生儿抗凝血2-3ml第一步：1.收到标本之后离心2分钟，取两个空试管，标记红细胞1和血浆2。
红细胞1 血浆22.将离心好的血样中血浆全部吸入空试管2中，剩余的红细胞吸入另一空试管1中。
3.向试管1中加3000μL生理盐水，进行洗涤，洗涤红细胞三次后，取压积红20μL+2480μL盐水加入新的试管中配制成0.8%红细胞。
（剩余的压积红留着做放散液）。
第二步;直抗试验、血型试验取0.8%红细胞50μL分别加入血型卡和不规则抗体卡中（只加一个孔）做好标记，直接离心五分钟看结果。
第三步：游离试验、放散试验1.取试管1中压积红1000μL+盐水1000μL（1:1适量配比）。
新生儿溶血病检测标准操作规程
新生儿溶血病检测标准操作规程1.检验原理：本试验为将排阻层析和抗人球蛋白试验（COonIbS试验）相结合，即在微柱凝胶介质中，红细胞抗原与相应的不完全抗体在抗人球蛋白的作用下发生凝集反应，形成红细胞免疫复合物，在一定离心力下，该复合物不能通过凝胶间隙而浮于胶表面或悬于胶中；如无相应的不完全抗体结合，则不能形成红细胞免疫复合物，在一定离心力下，分散的红细胞可以通过凝胶间隙沉于微柱腔底部。
2.主要组成部分：本品系在聚丙烯塑料透明卡片上的六支微柱型管中填充葡聚糖凝胶和抗人球蛋白（多抗），制成抗人球蛋白检测卡，凝胶微管分为反应腔和凝胶分离柱两部分。
3.样本要求：3.1红细胞样本：采集被检对象静脉血，用EDTA抗凝，配制成红细胞悬液（直接抗人球蛋白试验配制成红细胞生理盐水悬液，间接抗人球蛋白试验配制成红细胞低离子溶液悬液（只适用于交叉配血和不规则抗体筛检）），红细胞最终浓度0.5%-0.8%o3.2血清样本：采集被检对象静脉血，放入含有兔脑粉或者其他促凝剂的试管中，10分钟后离心，取上清；或者静脉血采入无抗凝剂试管中，4℃放置12小时，或者37℃放置2小时后离心，20OrPmlO分钟，取上清该上清不得有絮状物或沉淀。
血清标本必须充分去蛋白，否则标本中析出的或红细胞悬液中残余的纤维蛋白可阻碍红细胞沉降，使非凝集细胞离心后在胶表面形成一条红线，呈假阳性反应。
4.检验方法4.1.准备工作1）微柱凝胶检测卡的准备：观察外观，如有干胶、杂质、气泡不可使用，之后将卡平衡至室温（18—25℃）,再用专用离心机离心5分钟。
2）标本采集：用EDTA抗凝管采集被检对象脐带血或静脉血，制备成红细胞标本和血浆标本。
3）红细胞悬液的制备：将被检者红细胞标本至少洗涤4次，取被检者压积红细胞10微升，加入1毫升红细胞稀释液或生理盐水，外观应为均匀淡红色,无絮状物和血块。
4）血浆标本的处理:将被检者血浆标本进行离心,采用3000r∕min离心3min或3500r∕min离心2min（不得有絮状物或沉淀）。
新生儿溶血病检测卡标准操作程序(SOP)
新生儿溶血病检测卡标准操作程序（SOP）一、准备工作（一）微柱凝胶试剂卡的准备：观察外观，如有干胶、杂质、气泡不可使用，之后将卡放置室温（18－25℃）平衡，再用专用离心机离心5分钟。
(二)试剂的制备：6%牛血清白蛋白（盐水稀释）（三）标本采集：采集被检对象静脉血，将该同一人血液分别制备成红细胞标本和血清标本。
（四）红细胞标本的制备：用红细胞稀释液配制红细胞悬液，红细胞最终浓度为0.8%－1％。
（五）血清标本的制备：将被检者静脉血采入含兔脑粉或其它促凝剂的试管中，10分钟后离心，取上清；或者将被检者静脉血采入无抗凝剂试管中，4℃放置12小时，或37℃放置2小时后离心，2000rpm，10分钟，取上清。
该上清不得有絮状物或沉淀。
（六）放散试验：1、充分洗涤红细胞至少三次，取同体积洗涤后的压积血和6%牛血清白蛋白混匀，置于56℃孵育10分钟，期间不断摇动，离心1000rpm，2－3分钟，取上清。
即放散液。
2、充分洗涤红细胞至少三次，用博讯公司生产的酸性放散试剂盒做室温放散。
参见酸性放散试剂盒使用说明书。
二、实验步骤1、取新生儿的红细胞0.8%－1％悬液50ul分别加入卡1中的1－6孔中。
2、使用专用离心机离心5分钟，900rpm 2分钟，1500 rpm 3分钟。
3、取出，判读结果。
4、第二卡1－3孔分别加入50ul新生儿血清，4－6孔分别加入50ul新生儿红细胞放散液。
5、将A型红细胞悬液50ul分别加入1号、4号；将B型红细胞悬液50ul分别加入2号、5号；将O型红细胞悬液50ul分别加入3号6号孔中。
6、37℃孵育15分钟。
7、取出，使用专用离心机离心5分钟（900rpm2分钟，1500 rpm3分钟），取出，判读结果。
结果判定阳性结果：红细胞凝集块位于凝胶表面或凝胶中。
表明被检者血清中含有对应其抗原的抗体或血细胞被致敏。
阴性结果：红细胞完全沉降到凝胶底部，在凝胶管底部形成红细胞扣。
表明血清中无相应抗原免疫的抗体或血细胞没有被致敏。
新生儿溶血病检测操作SOP
新生儿溶血病检测操作SOP一、产前诊断1、夫妇血型检测（微柱凝胶检测法：ABO、Rh（D）血型定型检测卡）1、1 将红细胞稀释至1% 红细胞生理盐水悬液；1、2 撕开微胶卡得封膜，于正定管蓝A、黄B、灰D、Control 微柱管反应腔中加入1% 待检RBC生理盐水悬液各50μl ；于反定管白色A、B、O、自身管分别对应加入1、0% A1、B、O 型试剂红细胞与待检红细胞生理盐水悬液50μ l ，再分别加入待检血浆（血清）50μl ；1、3 将检测卡室温反应≥ 10 min, 取出，置离心机1000r/min 2min，1800r/min 3 min 离心；1、4 取出，判定结果（凝集强度判断详见结果判定示图）。
ABO RhD2、孕妇抗体效价得测定（微柱凝胶检测法：抗人球蛋白检测卡）2、1孕妇IgG（抗A/抗B）效价2、1、1 取待检血清与2-Me（二巯基乙醇）应用液各0、2ml，充分混匀，37℃水浴 2 小时（以充分破坏血清中得IgM 类抗体）。
2、1、2取 4 支干净试管排于试管架上；将第一管加入50微升中与血清与1、6 毫升低离子介质（原液为1:1 稀释，此时稀释倍数为原液得64 倍）。
2、1、3 第2－4 管中分别加入400微升低离子介质；从第一管中吸出400微升得液体加入第二管，混匀，在从第二管吸出400 微升加入第三管混匀，依次倍比稀释。
2、1、 4 取抗人球蛋白检测卡，撕去铝箔，在 4 管中个依次加入倍比稀释好得灭活血清50微升与1％得标准红细胞（或父亲红细胞）低离子介质（LIM）悬液50 微升。
2、1、5 将加好样得检测卡入生科孵育器中孵育15分钟。
2、1、6将孵育好得检测卡放入生科离心机中离心5分钟（1000r/min 2 min ，1800r/min 3 min），（离心必须在加样后30 分钟内进行）2、1、7 取出，判定结果（凝集强度判断详见结果判定示图）临床参考值：孕妇IgG（抗A/抗B）效价≤ 64。
新生儿溶血性疾病产前血型血清学检测标准操作规程
新生儿溶血性疾病产前血型血清学检测标准操作规程一、目的为规范新生儿溶血性疾病（HDN）产前血型血清学检测的技术操作，准确评估胎儿发生HDN 的危险程度，从而辅助临床正确的诊断和治疗。
二、适用范围输血科进行新生儿HDN产前血型血清学检测。
三、原理通过鉴定孕妇及其胎儿父亲的血型，推测胎儿可能的血型，进一步检测孕妇体内是否有针对胎儿红细胞血型抗原的抗体及其效价来评估胎儿发生HDN的危险程度。
四、步骤和方法1、检测孕妇ABO、RhD血型，红细胞不规则抗体及其丈夫ABO、RhD血型。
根据夫妇ABO 血型组合来推测母婴ABO血型是否相合：如果母婴血型配合则不需检测孕妇ABO血型IgG 抗体效价；如果母婴血型不配合（可能不配合）则需检测孕妇可能致敏胎儿红细胞的ABO 血型IgG抗体效价。
2、由于抗-A或者抗-B主要为IgM类，ABO血型不合极少发生胎儿HDN，故除有死胎史或者新生儿黄疸史的孕妇外，不需检测IgG抗-B及抗-A的效价。
3、如果孕妇为RhD阴性，丈夫RhD为阳性，孕妇不规则抗体阴性，建议孕妇以后每个月复检不规则抗体直至分娩。
4、如果孕妇不规则抗体为阳性，则需鉴定其特异性、Ig类型、37℃反应情况及其效价和丈夫红细胞是否表达对应的抗原，来评估抗体引起的HDN危险程度。
5、结果判定：效价>143有临床意义。
五、质量控制1、用于试验的试剂都在有效期内使用。
2、严格试验操作，设置阴、阳对照，结果符合预期才可判定试验结果。
六、注意事项1、HDN产前血型血清学检测结果只能为评估胎儿发生HDN的风险提供依据，并不能确定HDN 。
母婴ABO血型不合且孕妇IgG类ABO血型抗体效价在妊娠期持续升高或者检出了IgG类红细胞不规则抗体都是HDN的风险因素。
2、传统认为ABO血型系统IgG抗体效价高于64具有临床意义。
随着检测水平得的提高，其作为临床参考意义不大。
3、抗体效价与HDN的发生有一定的相关性，但是抗体效价的高低与HDN的严重程度并不完全一致，可能与IgG抗体亚类不同有关。
输血科新生儿溶血病血型血清学检查标准操作规程
输血科新生儿溶血病血型血清学检查标准操作规程1、目的：规范血液免疫学产前检查操作，确保试验过程及结果的准确性与可靠性。
2、范围：本规程适用于实验室血液免疫学产前检查试验操作。
3、职责：经授权的血型实验室试验人员负责血液免疫学产前检查试验过程及报告的发出。
4、原理孕妇和丈夫ABO血型不合（O/A、O/B、O/AB、A/B、A/AB、B/A、B/AB）时，孕妇体内的IgG抗A（B）可能会引起新生儿溶血病的发生。
本试验通过检测孕妇血清中有无IgG性质的抗A（B）抗体及其效价（应用巯基试剂破坏IgM抗体，检测IgG抗体效价）即可预测ABO系HDN发生的可能性。
应用筛选红细胞可检测孕妇血清中是否存在不规则抗体，如果存在，应用谱细胞进行抗体鉴定，确定抗体的特异性，进一步检测非ABO系新生儿溶血病。
5、所需设备、材料或试剂：37℃恒温水浴箱、细胞洗涤离心机、抗-A抗-B血型定型试剂（单克隆抗体）、抗-D RH血型定型试剂（单克隆抗体）、凝聚胺介质试剂、抗人球蛋白试剂（抗-IgG、C3d）、（A、B、O）型标准红细胞悬液（2—5%）、商品化筛选细胞、谱细胞、2—ME试剂、12×75mm试管、塑料滴管。
6、检测环境条件：温度：18—25℃；湿度：30—70%7、标本要求7.1标本接收在接收标本时，应尽可能的了解、核对、记录患者的相关资料，包括受血者姓名、年龄、性别、临床诊断、输血史、用药史、妊娠史、标本编码等；7.2检验人员收到被检者产前检查申请按照申请单内容在试管上做标记(用记号笔在试管上标明被检者姓名、性别)，保留申请记录。
7.3按照要求进行血液采集。
将采好的血液沿试管壁注入已标识的抗凝试管中，反复颠倒混匀，放入2-8℃冰箱待用。
并填写《外来标本交接记录》及相关记录。
7.4标本的种类与数量：产前检查需送夫妇血样，血样均需抗凝（EDTA抗凝），女（母）5ml，男3ml。
7.5标本的保存与处理：完成所有试验内容后，要仔细核对实验结果，发出实验报告后，将实验所用的标本原始送检管存于2-8℃冰箱内至少7天以便进行查找和核对，之后交由单位相关部门统一处理。
新生儿溶血病检测卡标准操作程序(SOP)
新生儿溶血病检测卡标准操作程序（SOP）一、准备工作（一）微柱凝胶试剂卡的准备：观察外观，如有干胶、杂质、气泡不可使用，之后将卡放置室温（18－25℃）平衡，再用专用离心机离心5分钟。
(二)试剂的制备：6%牛血清白蛋白（盐水稀释）（三）标本采集：采集被检对象静脉血，将该同一人血液分别制备成红细胞标本和血清标本。
（四）红细胞标本的制备：用红细胞稀释液配制红细胞悬液，红细胞最终浓度为0.8%－1％。
（五）血清标本的制备：将被检者静脉血采入含兔脑粉或其它促凝剂的试管中，10分钟后离心，取上清；或者将被检者静脉血采入无抗凝剂试管中，4℃放置12小时，或37℃放置2小时后离心，2000rpm，10分钟，取上清。
该上清不得有絮状物或沉淀。
（六）放散试验：1、充分洗涤红细胞至少三次，取同体积洗涤后的压积血和6%牛血清白蛋白混匀，置于56℃孵育10分钟，期间不断摇动，离心1000rpm，2－3分钟，取上清。
即放散液。
2、充分洗涤红细胞至少三次，用博讯公司生产的酸性放散试剂盒做室温放散。
参见酸性放散试剂盒使用说明书。
二、实验步骤1、取新生儿的红细胞0.8%－1％悬液50ul分别加入卡1中的1－6孔中。
2、使用专用离心机离心5分钟，900rpm 2分钟，1500 rpm 3分钟。
3、取出，判读结果。
4、第二卡1－3孔分别加入50ul新生儿血清，4－6孔分别加入50ul新生儿红细胞放散液。
5、将A型红细胞悬液50ul分别加入1号、4号；将B型红细胞悬液50ul分别加入2号、5号；将O型红细胞悬液50ul分别加入3号6号孔中。
6、37℃孵育15分钟。
7、取出，使用专用离心机离心5分钟（900rpm2分钟，1500 rpm3分钟），取出，判读结果。
结果判定阳性结果：红细胞凝集块位于凝胶表面或凝胶中。
表明被检者血清中含有对应其抗原的抗体或血细胞被致敏。
阴性结果：红细胞完全沉降到凝胶底部，在凝胶管底部形成红细胞扣。
表明血清中无相应抗原免疫的抗体或血细胞没有被致敏。
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新生儿溶血病检测操作规程
1 原理
新生儿溶血病一般特指母婴血型不合而引起的胎儿或新生儿免疫性溶血性疾病
（HDN,可由多种原因引起。
临床常见的是ABO Rh等血型系统。
胎儿和新生儿红细胞被来自母亲的IgG 抗体所包被，并在婴儿的网状内皮系统内受到免疫性破坏。
2 试剂和材料
2.1 母亲血样3-5ml ,患儿抗凝血3-5ml
2.2抗人球蛋白试剂（包括广谱、IgG、C3）、2-Me应用液、抗-A、抗-B、抗-D、抗
-C、抗-c、抗七血清试剂
2.35%A1、B、O型标准红细胞悬液
3 方法
主要以三项试验为主①患儿直接抗人球蛋白试验②患儿游离抗体试验③吸收放散试
验
3.1ABO新生儿溶血病检测
ABO新生儿溶血病主要是由于胎儿红细胞A或B抗原与来自母体的抗A或抗B抗体
反应的结果。
以母亲为0型，胎儿为A型或B型的发病率为最高。
3.1.1母、子（父）红细胞ABO血型鉴定（参照ABO血型鉴定）
3.1.2 子红细胞试验
3.1.2.1 子红细胞直接抗人球蛋白试验
RBC生理盐水洗3遍，配成5%RB悬液，取小试管加1滴2-5%子RBC加多特异性
抗球蛋白 1 滴，混匀离心看结果。
3.1.2.2 子红细胞抗体放散试验：取经盐水洗涤的患儿压积RBC0.5-1ml, 加等量盐水于试管中，56 C水浴，不断振摇10分钟，然后置于56 C温水离心管内，立即以1300g离心5分钟，吸取上清液备用。
取3只试管，标记Ac、Be、Oc,将放散液分为3份分别加入3个小试管中，分别加2-5%A B、O细胞1滴，37C水浴1小时（加PEG缩短至5分钟），取出后用生理盐水洗涤3遍，倒尽盐水，各加抗多特异性抗球蛋白1-2 滴，混匀离心看结果。
3.1.2.3 子血清中游中游离抗体检查
取3支小试管标明Ac、Be、Oc,每管加患儿血清2-4滴，分别加入2-5%A B、O指示红细胞盐水悬液 1 滴，混匀后离心，看结果。
如有凝集，说明有相应盐水抗体，不凝集将试管放入37C水浴1小时（加PEG5分钟）后，用生理盐水洗3遍，吸尽盐水后，每管加多特异性抗球蛋白 1 滴，离心看结果。
3.1.2.4 母血清作产前检测
血清中IgG抗A抗B效价测定及血清抗体筛选。
详见产前检测。
3.2Rh 新生儿溶血病检测
Rh血型系统的HDN是由于母婴Rh血型不合造成的，母亲的Rh免疫抗体作用于胎儿及婴儿，引起贫血和高胆红素血症，以D抗原不合为最多见，一般母亲曾有输血或
妊娠史。
3.2.1母、子、父作ABO Rh血型鉴定（参照ABC血型鉴定及Rh血型鉴定）。
母亲一般为Rh阴性，患儿为Rh阳性。
3.2.2 子红细胞试验
3.2.2.1 子红细胞直接抗人球蛋白试验（同）。
3.2.2.2 子红细胞抗体释放试验：直抗阳性者做此试验。
用三氯甲烷/ 三氯乙烯放散
法，洗涤压积红细胞后，加等量盐水或AB型血清，再加2体积三氯甲烷/三氯乙烯
等量混合液，用玻璃纸压住管口，颠倒混合1分钟，以3000〜5000转/分离心3〜5分钟，吸取上层樱红色液体放入另一试管，并将此含放散液试管置37C水浴5~10分
钟，除尽三氯甲烷/三氯乙烯，用标准细胞鉴定抗体，方法同热放散抗体法。
322.3子血清游离抗体检测（同）。
3.224母血清ABO以外抗体检测：用配组细胞及丈夫或子细胞与母血清在盐水中看是否有凝集，再做酶法或抗人球法，阳性者作抗体鉴定及测抗体效价。
4结果判定
4.1ABOHDN吉果判定
根据患儿三项试验结果按下表作结果判断：
母亲为O型，子为A型或B型，子红细胞直抗阳性或（和）游离抗体阳性，母亲IgG
抗体抗A或抗B效价高者可疑为ABC新生儿溶血病。
4.2 RhHDN吉果判定
母亲为Rh阴性、子为Rh阳性，子红细胞直抗阳性及抗体释放试验阳性即可判定为Rh血型HDN游离抗体试验有时可表现为阴性。
3项试验均阴性则可否定为Rh血型HDN其他血型HDN可根据检测结果直接报。
5支持性文件
《全国临床检验技术操作规程》
6相关表单
WXXZ/QR/1202-035-D0《血型研究室试验记录》
WXXZ/QR/LAB1401-001-D《《检验报告单》。