基因组步行法扩增3'及5'侧翼序列
一．原理
基因组步行技术是一种新发展的利用已知序列(cDNA或基因组DNA)从基因组中获得基因的上游(如启动子) 或下游序列的方法。
其原理如下：首先利用不同的具有平末端的 DNA 限制性内切酶消化基因组 DNA，然后将预先设计好的 DNA 接头连接在 DNA 的两端, 这样的一组两端带有接头的 DNA 片段就称为所谓的无载体的 DNA 文库；根据接头和目的基因的序列设计两组引物，以上述的DNA为模板，先以外侧的一组引物进行第一轮 TD-PCR ( touchdownPCR ) 扩增，然后以内侧的一组引物进行巢式 TD-PCR 扩增，扩增产物即为所需的DNA片段。
在接头中，由于2条链中较短的一链的3’末端被
2NH2 封闭，使得引物 AP1 在第一次 PCR 之前没有结合位点，在 PCR 的第一循环过程中只能从 GSP1 延伸，没有 AP1 的延伸产物。
而GSP1 的延伸产物产生了 AP1 的结合位点，在第二循环就开始从两端进行延伸反应。
这样，就减少了非特异性扩增，从而提高了 PCR 的特异性.基因组步行由 2 轮 TD-PCR 反应组成。
在 TD-PCR 的初始循环中，所采用的退火和延伸温度比引物的 Tm 值略高，在这种情况下引物退火的效率会下降，但是特异性将增加；另外，在极少数情况下接头的 2NH2 也会延伸，补平接头，这样也产生了 AP1 的结合位点，从而增加了非特异性扩增，但在高温下，接头的自我退火比引物与接头退火的效率高，就提高了针对于 AP1 的 PCR 抑制效应，减少非特异性扩增。
在随后的循环中，退火和延伸温度比 Tm 值略低，有利于特异性产物的指数增长。
基因组步行技术主要应用于一些只知部分 cDNA 序列的基因的启动子或其他上游调控序列的快速克隆，该技术也可用于确定内元/外元的连接以及从任何序列标签位点(Sequence2tagged site, STS) 或 EST 两端进行扩增获得相应的序列。
尽管一次步行获得的片段长度短于 6 kb，但可通过多次反应获得更长的片段。
该方法对于填补基因组中的一些间隙，特别是当这些缺失的克隆通过常规的筛选文库很难得到时非常有
一、高质量基因组DNA 的提取
1 材料
实验鱼，尾静脉取血100 μl(含抗凝剂)
2 试剂
QIAGEN Genomic 20/G；Tip Holders；Buffer C1；Buffer QBT；Buffer QF 抗凝剂 : 0.48%柠檬酸，1.32%柠檬酸钠，1.47%葡萄糖
3. 方法
1）样品的处理和裂解
(1) 将100μl鱼血用PBS稀释至1ml
(2) 加入1倍体积冰冷的Buffer C1，3倍体积（3ml）的ddH
O 。
2
(3) 翻转数次至悬冷液成半透明
(4) 冰浴10min。
(5) 4℃，1300g离心15min，弃上清液。
(6) 加入250μl冰冷的Buffer C1，750μl冰冷的ddH2O。
(7) 轻弹，溶解沉淀。
(8) 4℃，1300g离心15min，弃上清液（如沉淀不是白色，重复洗涤步骤）。
(9) 加入1ml Buffer G2，最大速漩涡10-30s，充分重悬核酸沉淀物（时间要控
制得很严格）。
(10) 加入25ul QIAGEN Protease，50℃保育30-60min（如有必要可延长保育时间）。
2）DNA的提取
二、基因组步行法扩增5’及3’侧翼序列
1 材料
基因组DNA
2．仪器、用具
离心机、PCR仪
3．试剂
(1) 30μl DraⅠ(10units/μl)
(2) 10ul T4 DNA Ligase (6units/μl)
(3) 10×Ligation Buffer
(4) BD Genome walker Adaptor (25 UM )
(5) Adaptor Primer1 (AP1, 10uM)
(6) Nested Adaptor Primer2 (AP2, 10μM)
(7) 酚
(8) 氯仿
(9) 3M 醋酸钠
(10) 95%乙醇
(11) 80%乙醇
(12) TE: 10 mM Tris, 0.1mM EDTA (10/0.1, ph7.5)
(13) TE: 10 mM Tris, 1mM EDTA (10/1, ph7.5)
4．方法
1）电泳检测基因组DNA质量
取1μl Genomic DNA (0.1μg/μl) 和1 μl Control genomic DNA (0.1 μg/μl)，0.8%凝胶电
泳检测基因组DNA质量。
2）DraⅠ酶切检测Genomic DNA质量
(1) 于0.5ml离心管中加入
(2) 轻轻翻转离心管混匀(不要旋涡)。
(3) 37oC过夜。
(4) 取5μl反应液于0.8%凝胶进行检测，1 μl genomic DNA作对照。
3）基因DNA Dra I 酶切
(1) 于1.5ml离心管中加入以下试剂：
(2) 轻轻摇匀。
(3) 37oC保育2hr。
(4) 低速旋涡5-10s。
(5) 37oC温育过夜(16hr -18hr)。
(6) 取5 μl酶切产物于0.8%凝胶上进行电泳检测。
4）DraⅠ酶切DNA 的纯化
(1)于1.5ml 离心管中加入等体积的(95 μl) 酚。
(2)低速旋涡5-10s。
(3)短暂离心分离水相和有机物。
(4)将上层水相吸至另一新1.5ml 离心管中，弃下层有机物。
(5)加入等体积(95 μl) 氯仿。
(6)低速旋涡5-10s。
(7)短暂离心分离水相有机物。
(8)转移上层水相至另一新1.5ml 离心管中，弃下层有机物。
(9)加入2 倍体积(190 μl) 冰冷的95%乙醇。
(10) 加人1/10 体积(9.5 μl) 3M NaAc (pH4.5)。
(11) 低速旋涡5-10s (轻弹)。
(12) 14000rpm，离心10min。
(13) 倒掉上清，空气干燥沉淀。
(14) 加入20 μl TE (10/0.1 pH7.5)溶解沉淀
(15) 低速旋涡5-10s (轻弹)。
(16) 1 μl纯化产物于0.8%凝胶进行电泳检测。
5）Genomic DNA 与Genomewalker Adaptor 连接
(1)于0.5ml 离心管中加入
(2)16℃过夜
(3) 70℃保育5min
(4) 加入TE 72 μl (TE 10/1 pH7.5)
(5) 轻弹5-10s
6）PCR
(1) 1st PCR
①配制PCR反应液
②反应条件: 94℃25s，72℃3min ×7；94℃25s，67℃3min ×32；67℃7min。
(2) 2nd PCR
1) 取1 μl 1st PCR 产物49 μl ddH2O 中，稀释50 倍
①配制PCR反应液
②反应条件: 94℃25s，72℃3min ×5；94℃25s，67℃3min ×20；67℃7min。
(3) 取5μl 第二轮PCR 产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳分离。
回收纯化电泳片段克隆到pMD-18T载体，进行鉴定和测序。
(4) 获得基因组DNA 5’及3’侧翼序列后，将其与基因组DNA 的核心片断进行拼接。
这就获得了基因组DNA的全序列。
注：基因组步行法扩增5’侧翼序列和3’侧翼序列的方法相一致，只是PCR反应所用的接头引物和基因特异引物不同。
侧翼序列名词解释
侧翼序列名词解释
侧翼序列（Flanking sequence）是指存在于编码区第一个外显子和最末一个外显子的外侧的一段不被翻译的核苷酸序列。
在每个割裂基因中，第一个外显子的上游和最末一个外显子的下游，都有一段不被转录的非编码区，称为侧翼序列，包括启动子、增强子以及终止子等对DNA转录起调控作用的DNA序列。
侧翼序列含有基因调控序列，如5’端含有的启动子、增强子，3’端含有的终止子和多聚腺苷酸信号等，对基因表达起重要的调控作用。
在应用PCR技术分析DNA遗传多态性分析时，侧翼序列常表示目的片段两侧与引物之间的保守序列。
马鹿生长激素基因的克隆与5′侧翼序列分析
生 长激 素 （ ｒｗｔ ｎＩＩＤ ，Ｇ 是 由动物脑 下 ｇｏ ｈ＇ Ｔ Ｏ ｅ Ｈ） ｏＩ 垂体前 叶分 泌 的一 种 多肽 类 激 素 ， １０个基 基 酸 由 ９ 残基组 成 ， 不含 糖 基 ， 子量 约为 ２ ０ ０道尔 顿 分 ２０
已 研 究 动 物 牛 、 、 、 、 、 、 鼠 、 兔 、 和 人 羊 马 猪 鲸 狗 大 家 猴
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１ 材 料 和 方 法
１ １ 材 料 ．
首 先 是 从 大 鼠 和 人 开 始 的 ， 后 已 在 牛 、 、 中 进 随 羊 猪
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2种PCR方法扩增大豆rbcS启动子5_侧翼序列比较
2种PCR方法扩增大豆rbcS启动子5′侧翼序列比较*刘晓庆，丁志鑫，刘 晶，崔喜艳**吉林农业大学生命科学学院，长春130118摘 要：比较了扩增已知序列5′侧翼序列的2种PCR方法。
方法一是反向PCR（IPCR），以大豆基因组酶切后的DNA 片段自身环化产物做模板，用2对特异引物反向扩增大豆rbcS启动子5′侧翼序列。
方法二是热不对称交错PCR （TAIL-PCR），以大豆基因组DNA为模板，用3个巢式特异性引物分别和简并引物组合进行连续的PCR循环。
IPCR 和TAIL-PCR 2种试验方法分别扩增获得438bp和867bp特异产物。
经测序发现：两片段两侧均含有设计的引物，其部分序列均与已知序列相一致，两者也有部分序列完全相同，但TAIL-PCR技术简单，重复性好，能够在短时间内获得目标片段。
试验结果表明：TAIL-PCR技术在克隆侧翼序列时优于IPCR。
关键词：反向PCR；热不对称交错PCR；大豆；rbcS启动子中图分类号：S52；Q78 文献标识码：A文章编号：1000-5684(2011)DOI:网络出版地址：Comparison between Two PCR Techniques for Amplifying the 5′ Flanking Sequence of the rbcS Promoter from Glycine maxLIU Xiao-qing, DING Zhi-xin, LIU Jing, CUI Xi-yanCollege of Life Science, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, ChinaAbstract: The research was conducted to compare two PCR techniques for isolating a target DNA segment flanking the known sequence. Inverse PCR(IPCR), with two pairs of specific primers, was performed using genome DNA as the template digested with Eco RI, followed by self-ligation. TAIL-PCR, with combination of three nested specific primers and an arbitrary degenerated primer, respectively, was performed using the same genome template. 438bp and 867bp of specific fragments were obtained by IPCR and TAIL-PCR, Sequencing results confirmed primers and the known sequence. Comparatively, TAIL-PCR technique is very simple and reproducible and can obtain the target fragment in a shorter time. The results showed that TAIL-PCR is more efficient than IPCR in identifying the flanking sequence.Key words: IPCR; TAIL-PCR; Glycine max; rbcS promoter随着植物基因工程的发展，常需要构建能高水平启动子对外源基因的表达水平影响很大，是基因工程表达载体的重要元件[1]。
三步法扩增高变异区DNA
基金项目 ! 国家自然科学基金重点项目 ! 编号 # " % "& # * * # & ( & & + , . / 0 1 23 6 0 7 . 8 6 9+ : 7 1 8 : 1; . , 8 2 6 0 7 . 8. <= > 7 8 6! 5 . ? # * * # & ( & & 45 # 作者简介 ! 邱 ! 钢! $男 $ 湖北十堰人 $讲师 $ 硕士研究生 $郧阳医学院在职教师 $ 研究方向 #遗传学与发育生物学 (@ ( * " (’" A B 6 7 9 7 , 6 8 ( * * " C D D % #? : . B "(
收稿日期 ! 修回日期 ! ! & & $ ( ( ( )" ! & & $ ( ! & )
$& 彼此间的进化关系 % 而E $ 5 F 片 段序列 的获 取主要
依靠设计适当引物后通过 G 再 经直 = H 扩增 出片段 $ 接测序或克隆后 测 序 而 得 ( 然 而 $ 目的片段的扩增 在E 5 F 序列差异 显 著 的 某 些 物 种 间 难 以 获 得 有 效 原因是引物 与 目 标 序 列 碱 基 配 对 时 差 异 G = H 产物 $
! / 0 2 3 4 5 8 9 + 8 *( 2 + * 2 *$ ! 3 : * +; + < * = > + 5 3 @ 0 -$ # & & % !$ A @ + 0" 67 6$?
# + ; ( & # < 4 & F: . B B . 8/ . 3 9 1 B7 8 / 1 S 1 6 / : >. <B . 9 1 : , 9 6 /1 T . 9 , 0 7 . 8 7 S2 7 < < 7 : , 9 0 0 .1 < < 7 : 7 1 8 0 9 B 9 7 < , 7 : U1 T . 9 T 7 8 6 / 1 0 46 D0 D 4C $ S 1 , 1 8 : 1. < 1 8 1 S7 82 7 < < 1 / 1 8 0S 1 : 7 1 S. /D 1 8 , S, S 7 8 1 : 7 < 7 :/ 7 B 1 / S 0 > , SB 6 U 7 8 V 1 / 7 B 1 8 0 6 9/ . : 1 S S6 8 2< 7 8 6 9 C D DS D1 $ 6 8 6 9 S 7 S. < 0 . 0 6 9 / 1 S , 9 0 S2 1 9 6 1 2 ? F 9 0 > . , >, S 7 8 1 S 0 1 2. / S 1 B 7 A 8 1 S 0 1 2G = H: 6 8/ . B 7 8 1 8 0 9 7 8 : / 1 6 S 1G = HS 1 : 7 < 7 : 7 0 4 4 D D8 4 4 $ 7 0 / 1 6 9 9 6 8 8 . 0 1 < < 7 : 7 1 8 0 9 B 9 7 < , 7 : U1 T . 9 T 7 8 1 7 . 8. <E 5 F7 8. , / / 1 S 1 6 / : >. < 1 8 1/ 0 1 ’ % $B K 8 0 > 7 S / 1 S 1 6 / : > W 1 4C 4: 46 D/ D D
分子诊断单选练习题
分子诊断单选练习题一、单选题（共100题，每题1分，共100分）1、下面关于线粒体的描述不正确的是A、是真核细胞重要的细胞器B、线粒体的主要功能是氧化产能C、是细胞的能量工厂D、半寿期是10天左右，其数量和体积保持不变E、线粒体中存在基因，线粒体基因突变会导致疾病的发生正确答案：D2、延伸的温度通常为A、25℃B、72℃C、37℃D、95℃E、55℃正确答案：B3、催化聚合酶链反应的酶是A、DNA连接酶B、反转录酶C、末端转移酶D、碱性磷酸酶E、TaqDNA聚合酶正确答案：E4、不可用于对核苷酸片段突变的检测方法是A、基因测序B、Southern印迹杂交C、Northern印迹杂交D、PCRE、RFLP正确答案：C5、关于P450的说法不正确的是A、具有广泛作用底物的一个酶类B、P450在致癌化合物代谢方面起着重要的作用C、绝大多数化学致癌物包括内源性和外源性都需经过P450的生物转化激活D、在肺癌中研究最多的是CYP1A2这个多态位点E、细胞色素P450超家族有多个亚家族正确答案：D6、下列分子不是细菌感染性疾病分子生物学检验技术的是A、PCR-SSCPB、real-timePCRC、ELISAD、PFGEE、RAPD正确答案：C7、蓝白筛选属于筛选重组DNA克隆方法的哪种？A、PCR分析B、免疫分析C、核酸分子杂交分析D、酶切分析E、插入失活分析正确答案：E8、重组DNA的宿主细胞有原核细胞和真核细胞。
用于制备基因文库的宿主细胞主要是A、哺乳动物细胞B、昆虫细胞C、酵母D、枯草杆菌E、大肠杆菌正确答案：E9、生物素和地辛高被用于DNA和RNA的全程标记的是A、随机引物标记B、DNA缺口平移标记C、全程RNA探针标记D、化学法全程标记E、3’或7’末端标记正确答案：D10、线粒体疾病的遗传特征是A、交叉遗传B、近亲婚配的子女发病率增高C、母系遗传D、女患者的子女约1/2发病E、发病率有明显的性别差异正确答案：C11、基因芯片的临床应用不包括A、疾病的诊断B、药物的筛选C、指导个体用药D、基因突变的检测E、由于蛋白质翻译后修饰改变而引起的疾病的诊断正确答案：E12、编码HIV衣壳蛋白的是A、vif基因B、tat基因C、gag基因D、pol基因E、env基因正确答案：C13、转录依赖扩增体系系统的描述错误的是A、以RNA为模板B、首先由靶RNA合成DNA拷贝C、再由DNA转炉生成大量D、产物为DNAE、为等温扩增正确答案：D14、以mRNA为模板合成cDNA的酶是A、DNA酶B、Taq DNA 聚合酶C、限制性内切酶D、RNA酶E、逆转录酶正确答案：E15、下列不能确定属于基因表达时间特异性的是，一个基因在A、胚胎发育过程不表达，在出生后表达B、胚胎发育过程表达，在出生后不表达C、分化的骨骼肌细胞不表达，在未分化的骨骼肌细胞表达D、分化的骨骼肌细胞表达，在未分化的骨骼肌细胞不表达E、分化的骨骼肌细胞表达，在未分化的心肌细胞不表达正确答案：E16、组织DNA提取中，苯酚-氯仿抽提离心分三层，DNA位于A、上层B、中间层C、下层D、中间层和下层E、上下层均有正确答案：A17、对人体危害较大且会污染环境的是A、多探针检测B、化学发光检测C、酶促显色检测D、荧光检测E、放射性标记探针检测正确答案：E18、人类可遗传的变异中最简单、最常见的一种是A、RFLPB、VNTRC、SNPD、STRE、CNV正确答案：C19、能够同时分离千种以上蛋白质的技术是A、2-DEB、ICATC、TOFD、MSE、LCM正确答案：A20、在分子生物学领域，分子克隆主要是指A、DNA的大量复制B、DNA的大量转录C、DNA的大量剪切D、RNA的大量反转录E、RNA的大量剪切正确答案：A21、顺式作用元件是指A、基因的5’、3’侧翼序列B、基因的5’侧翼序列C、具有转录调节功能的特异DNA序列D、基因5’、3’侧翼序列以外的序列E、基因的3’侧翼序列正确答案：C22、反式作用因子是指A、对自身基因具有激活功能的调节蛋白B、对另一基因具有激活功能的调节蛋白C、具有抑制功能的调节蛋白D、具有激活功能的调节蛋白E、对另一基因具有功能的调节蛋白正确答案：E23、SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳的原理不正确的是A、SDS是一种阴离子去垢剂B、SDS可以与蛋白质的疏水部分相结合，从而使蛋白质获得负电荷C、SDS-PAGE时蛋白质的迁移率与分子大小相关D、SDS-PAGE使具有不同等电点的蛋白质得以分离E、SDS与蛋白质结合后可以屏蔽天然蛋白质的电荷正确答案：D24、著名的Phl染色体发生的易位是A、t(9:22)(q34:q11)B、t(5:11)(q34:q22)C、t(5:22)(q34:q11)D、t(9:21)(q33:q11)E、t(9:22)(q11:q34)正确答案：A25、PCR技术的发明者是A、KrebsB、HensenetC、MullisD、SouthernE、Northern正确答案：C26、限制性核酸内切酶反应影响因素不包括A、DNA的纯度和结构B、反应缓冲液的pH和离子强度C、酶切时间D、酶的用量E、酶切温度一般为25℃正确答案：E27、DNA自动化测序技术中，不正确的荧光标记方法A、用荧光染料标记引物5'端B、用荧光染料标记引物3'-OHC、用荧光染料标记终止物D、使用一种或四种不同荧光染料标记E、使荧光染料标记的核苷酸掺入到新合成的DNA链中正确答案：B28、关于DHPLC技术的描述不正确的是A、可实现高通量检测B、自动化程度高C、灵敏度特异性高D、是分析异质性突变的首选方法E、是分析突变的金标准正确答案：E29、以下为比较Ct法的相对定量的描述，不正确的是A、实验条件不需要严格优化B、不需要再对管家基因和目的基因做标准曲线C、使机体的不同组织，以及不同实验处理组之间的基因表达变化具有可比性D、运用了数学公式来计算相对量E、没有考虑PCR扩增效率对定量结果的影响正确答案：A30、聚合酶链式反应是一种A、体外特异转录RNA的过程B、体外翻译蛋白质的过程C、体外特异性转录DNA的过程D、体外特异复制DNA的过程E、体内特异复制DNA的过程正确答案：D31、下列关于病毒基因组描述不正确的是A、基因组可以由DNA或RNA组成B、有重叠基因C、基因组大部分是用来编码蛋白质的D、有高度重复序列E、相关基因往往丛集形成一个功能单位正确答案：D32、当SDS单体浓度>1mmol/L时，它与大多数蛋白子平均结合比为A、0.14gSDS/1g蛋白质B、0.54gSDS/1g蛋白质C、1.4gSDS/1g蛋白质D、2.4gSDS/1g蛋白质E、3.4gSDS/1g蛋白质正确答案：C33、第二代测序技术一般不用到A、双脱氧链终止法B、文库接头C、高通量的并行PCRD、高通量的并行测序反应E、高性能计算机对测序数据进行拼接和分析正确答案：A34、以下不是原癌基因的特点的是A、广泛存在于生物界，是细胞生长必不可少的B、在进化过程中，基因序列呈高度保守性C、对正常细胞不仅无害，而且是细胞发育、组织再生、创伤愈合等所必需D、在某些因素的作用下会形成能够致瘤的癌基因E、通过表达产物DNA来实现功能正确答案：E35、下列不属于基因突变的类型是A、错义突变B、同义突变C、无义突变D、等位基因E、插入正确答案：D36、清蛋白由肝脏细胞表达产生，心肌细胞不表达，称为基因表达的A、个体特异性B、阶段特异性C、细胞（或组织）特异性D、种间特异性E、时间特异性正确答案：C37、能够导致遗传病发生的结构基因突变的类型通常不包括A、缺失和重排B、移码突变C、无义突变D、错义突全E、同义突变正确答案：C38、下列有关重组DNA技术的叙述，正确的是A、重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶和运载体B、所有的限制酶都只能识别一种特定的核苷酸序列C、选细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌繁殖快D、只要目的基因进入了受体细胞就能成功实现表达E、重组DNA 技术不需要限制酶正确答案：B39、HBV耐药性的检测在临床上主要是针对A、HBV DNA聚合酶S基因的检测B、HBV DNA聚合酶P基因的检测C、HBV DNA聚合酶C基因的检测D、HBV DNA聚合酶前C基因的检测E、HBV DNA聚合酶X基因的检测正确答案：B40、细胞周期运行的动力主要来自A、CDKB、CDKIC、CDK2D、CDK4E、CDK3正确答案：A41、下列方法中不属于RNA诊断的是A、Northern blotB、RNA斑点杂交C、基因芯片D、mRNA差异显示PCR技术E、逆转录PCR正确答案：C42、基因诊断间接方法不包括A、基于SNP的单倍i分析B、Southern blotC、基于STR的微卫星分析D、PCR-RFLPE、RFLP连锁分析正确答案：B43、以下不是DNA提取原则的是A、保证核酸一级结构完整性B、保留所有核酸分子C、核算样品中不应该存在有机溶剂和过高浓度的金属离子D、蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降到最低E、排除RNA分子的污染与干扰正确答案：B44、实时荧光PCR中，GC含量在20％-80％（45％-55％最佳），单链引物的最适长度为A、35-50bpB、15-20bpC、55-70bpD、5-20bpE、70-90bp正确答案：B45、用于蛋白质检测的标本长期保存于A、－20℃B、4℃C、室温D、－70℃E、8℃正确答案：D46、关于线粒体DNA基因描述正确的是A、结构基因编码mtDNA复制所需要的酶、调控蛋白、NADH氧化还原酶、ATP酶等B、重链有编码功能，轻链无编码功能C、含22个结构基因D、含tRNA基因，可转录20种tRNA，以满足线粒体内蛋白质翻译的需要E、含rRNA基因，编码 2种rRNA，即 12S rRNA 和 18S rRNA正确答案：D47、5'-末端的DNA探针标记主要依靠的酶是A、T4多聚核苷酸激酶B、末端转移酶C、AKPD、DNApolIE、DNApol正确答案：A48、由于突变使编码密码子形成终止密码子，此突变为A、错义突变B、移码突变C、终止密码突变D、无义突变E、同义突变正确答案：D49、目前最常用的TB分子检测方法是A、PCRB、real-time PCRC、SDAD、LPAE、DNA chip正确答案：B50、HIV-1中最易发生变异的基因是A、tatB、polC、nefD、gagE、env正确答案：E51、关于基因组印记说法不正确的是：A、是哺乳动物在长期进化过程中形成的自我监视机制B、控制某一表型的一对等位基因由于亲缘不同而呈差异性表达C、基因组印记的丢失被认为与肿瘤的易感性有关D、常发生于哺乳动物某些组织和细胞中E、与自身性差别有一定的关联正确答案：E52、细菌感染分子生物学检验的检验对象是A、测定血清中病原体蛋白含量B、镜检病原体形态C、测定血清中病原体蛋白含量D、测定血清中抗原体E、测定样本中核酸含量正确答案：E53、一种标记核酸与另一种核酸单链进行配对形成异源核酸分子的双链，这一过程称A、杂交B、复性C、探针D、复杂性E、变性正确答案：A54、真核生物的RNA聚合酶包括A、IFB、σ因子C、snRNPD、ρ因子E、TFII正确答案：E55、双杂交探针技术对信号的检测是在哪个阶段进行？A、预变性B、延伸C、变性D、末次延伸E、退火正确答案：E56、当标本核酸量非常低难以扩增时，可采用的PCR技术是A、逆转录PCRB、转录介导扩增C、原位PCRD、巢式PCRE、荧光PCR正确答案：D57、导致纯DNA的A260/A280 比值升高的是A、蛋白质B、酚C、氯仿D、RNAE、乙醇正确答案：D58、重组DNA的基本构建过程是将A、任意两段DNA接在一起B、外源DNA接入人体DNAC、目的基因接人适当载体D、目的基因接入哺乳类DNAE、外源基因接人宿主基因正确答案：C59、Sanger双脱氧链终止法使用的链终止物是A、dNTPB、α-35S-dNTPC、ddNTPD、α-32P-dNTPE、NTP正确答案：C60、在对目的基因和载体DNA进行同聚物加尾时，需采用A、反转录酶B、多聚核苷酸激酶C、引物酶D、RNA聚合酶E、末端转移酶正确答案：E61、新一代测序技术中的寡连测序需要A、DNA聚合酶(DNA polymerase)B、ATP硫酸化酶(ATP sulfurylase)C、荧光素酶(luciferase)D、三磷酸腺苷双磷酸酶(apyrase)E、DNA连接酶(DNA ligase)正确答案：E62、关于NC膜下列描述不正确的是A、能吸附单链DNAB、能吸附单链RNAC、依赖于高盐浓度结合靶分子D、易脆E、对小分子DNA片段（<200bp）结合力强正确答案：E63、下列关于Taq DNA聚合酶的描述，错误的是A、以dNTPs为原料B、催化形成3'，5'-磷酸二酯键C、使DNA链沿5'→3'方向延伸D、不具有3'→5'-磷酸二酯键E、扩增的DNA片段越长，碱基错配率越低正确答案：E64、关于定量PCR的描述，不正确的是A、可以定量或半定量检测PCR产物的方法B、定量PCR主要进行基因表达的分析和病原体的核酸检测C、水解探针技术中TaqMan探针的位置位于两条引物之间D、分子信标在自由状态下为发夹结构，荧光信号极低E、定量PCR在封闭状态下进行，有效避免了产物的实验室污染正确答案：A65、遗传物质的突变不会导致下列哪些遗传事件A、遗传(基因）多态性B、新性状或表型的产生C、SNPD、遗传病E、等位基因正确答案：E66、目前的DNA自动化测序技术可以一次读取的序列长度约A、50bpB、100bpC、500bpD、1000bpE、2000bp正确答案：D67、引起镰状细胞贫血的珠蛋白基因突变类型是A、移码突变B、整码突变C、无义突变D、错义突变E、终止密码突变正确答案：D68、重组DNA导入宿主细胞的方法不包括A、Cacl2转化法B、电穿孔法C、磷酸钙共沉淀法D、噬菌体的转染E、显微光照法正确答案：E69、DNA探针A、一般由17～50个核苷酸组成B、长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链RNA片段C、易降解，标记方法复杂D、仅长6个核苷酸E、几千碱基对正确答案：B70、相对于第二代测序技术，第一代测序技术不具有的优点是A、一次运行可产生海量的高质量数据B、模板不需要克隆C、较长的测序读长D、高通量E、并行正确答案：C71、与RNA聚合酶相识别和结合的DNA片段是A、增强子B、衰减子C、沉默子D、操纵子E、启动子正确答案：E72、线粒体基因组编码几种rRNAA、22种B、20种C、18种D、3种E、2种正确答案：E73、基因表达包括①复制②转录③逆转录④翻译A、①+②+④B、②+④C、③+④D、①+②E、①+③正确答案：B74、关于非放射性探针标记，下列描述不正确的是A、对人体危害小B、酶促显色检测最常使用的酶是碱基磷酸酶和辣根过氧化物酶C、目前应用的非放射性标志物都是抗原D、可长时间使用E、灵敏度不如放射性探针正确答案：C75、体细胞中染色体数目为47，称为A、单体型B、三体型C、超二倍体D、三倍体E、单倍体正确答案：B76、PCR反应过程中，退火温度通常比引物的Tm值A、低5℃B、低15℃C、高5℃D、高15℃E、相等正确答案：A77、以下在基因工程中不能用作克隆载体的DNA是A、细菌基因组DNAB、噬菌体DNAC、质粒DNAD、腺病毒DNAE、逆转录病毒DNA正确答案：A78、关于肿瘤分子诊断的说法正确的是A、肿瘤分子诊断就是利用分子生物学原理和技术建立的肿瘤诊断方法B、肿瘤分子诊断的研究成果仅用于临床肿瘤的诊断C、肿瘤分子诊断的含义主要表现在虽然检测对象众多，但大多数标志物是特异性的肿瘤标志物D、肿瘤分子诊断的核心是基于细胞水平瞻分子诊断技术E、肿瘤的分子诊断中根据目的、对象、类型的不同要釆取相似的诊断策略与方法正确答案：A79、扩增片段长度可到5kb以上的技术是A、PCRB、逆转录PCRC、多重PCRD、长片段PCRE、转录依赖扩增系统正确答案：D80、大部分Ⅱ类限制性核酸内切酶识别序列的特点是A、回文结构B、锌指结构C、超螺旋结构D、α螺旋结构E、串联重复序列正确答案：A81、人类基因组的组织特点描述不正确的是A、基因组含重复序列B、每个结构基因都有单独的调控序列C、基因组中各个基因的大小和内部组织的差异不大D、功能相关的基因常散在分布于不同的染色体上E、大部分为非编码序列正确答案：C82、关于Western印迹以下说法正确的是A、检测的灵敏性为0.1~1ngB、缺点是不能对转移到固相膜上的蛋白质进行连续分析C、固相膜保存时间短D、是由凝胶电泳和固相免疫组成的E、需要对靶蛋白进行放射性核素标记正确答案：D83、Southern印迹杂交检测的物质是A、RNAB、DNAC、蛋白质D、脂肪E、糖正确答案：B84、线粒体基因组的起始密码子是A、AUGB、AUAC、AGAD、AGGE、UGA正确答案：B85、DNA自动化测序技术一般用不到的技术是A、Sanger的双脱氧链终止法B、Maxam和Gilbert的化学降解法C、荧光标记技术D、PCR技术E、电泳技术正确答案：B86、下列关于细菌感染性疾病的分子生物学检验说法错误的是A、可以检测不能或不易培养、生长缓慢的病原菌B、可以实现对感染细菌的广谱快速检测C、可以对细菌进行基因分型D、可以检测病原菌耐药基因E、其检验技术都是PCR及其衍生技术正确答案：E87、使用飞行时间质谱质量分析器的是A、ICATB、PMFC、MDLCD、MALDI-TOF-MSE、ESI-MS正确答案：D88、下列对于转座因子含义叙述不正确的是A、转座因子是DNA重组的一种形式B、可在质粒与染色体之间移动的DNA片段C、转座子是转座因子的一个类型D、可移动的基因成分E、能在一个DNA分子内部或两个DNA分子之间移动发DNA片段正确答案：A89、SDS-PAGE电泳消除或掩盖了不同种类蛋白质间的A、分子大小差异B、电荷差异C、疏水性差异D、氢键差异E、离子键差异正确答案：B90、目前测序读长最大的测序反应是A、寡连测序B、边合成边测序C、双脱氧终止法D、焦磷酸测序E、化学裂解法正确答案：C91、决定PCR反应特异性的是A、模板B、dNTPC、引物D、缓冲液E、Taq DNA 聚合酶正确答案：C92、真核基因调控中最重要的环节是A、基因重排B、基因转录C、DNA的甲基化与去甲基化D、mRNA的半衰期E、翻译速度正确答案：B93、结构基因突变不包括A、基因点突变B、基因扩增C、基因缺失D、基因重排E、基因表达异常正确答案：E94、下列属子单基因遗传病的是A、精神与神经疾病B、冠心病C、原发性高血压D、糖尿病E、珠蛋白生成障碍性贫血正确答案：E95、目前，＜1kb的目的DNA片段常直接克隆到该质粒后测序A、M13mp质粒B、细菌质粒C、载体有酵母人工染色体(YAC)D、细菌人工染色体(BAC)E、穿梭质粒正确答案：B96、PCR的退火温度一般为A、94-95℃B、72℃左右C、75-80℃D、55℃左右E、25℃正确答案：D97、关于抑癌基因的说法正确的是A、正常情况下促进细胞增殖、抑制细胞分化B、呈隐性作用方式C、抑癌基因又称为肿瘤分化抑制基因D、可以使细胞丧失生长控制和正性调控功能E、是一类可编码对肿瘤形成起促进作用的蛋白质的基因正确答案：B98、SDS是一种阴离子表面活性剂，其可断开蛋白质分子内和分子间的A、氢键B、离子键C、二硫键D、酯键E、疏水键正确答案：A99、作为芯片固相载体的材料，下列描述正确是A、这些载体材料不需要处理，其表面存在活性基团（如羟基或氨基）B、不使用硝酸纤维膜、尼龙膜及聚丙烯膜等模性材料C、只要有玻片、硅片等实性材料D、可以直接固定已经合成的寡核苷酸探针E、不需要对戒指表面进行化学预处理—活化正确答案：C100、关于DNA芯片描述不正确的是A、探针为已知序列B、有序地高密度地固定于支持物上C、理论基础是和核酸杂交D、可研究基因序列E、不能研究基因功能正确答案：E。
染色体步移试剂盒说明书
DNA Walking步移法加速试剂盒（扩增未知侧翼序列的最佳方法）| [<<][>>]品！科研人员已经发展了几种无需建立cDNA库或筛选克隆的PCR技术方法，用于获取与已知序列相连的未知序列。
这些PCR方法包括反向PCR (IPCR)，连接介导PCR (LM-PCR)和随机引物PCR (RP-PCR)。
虽然这些方法有一定的效果并被不断改进，但是仍然受制于繁琐的酶切，适配体连接 (adaptorligation)和纯化步骤。
而且，RP-PCR的随机引物经常会因为非特异性退火而产生多余产物。
DNA步移法加速试剂盒通过应用专利的ACP（复性控制引物）技术，提高了小片断寡聚核苷酸的特异性，可以克服现有基因步移法的缺点。
DNA步移法加速试剂盒由PCR酶混合物与用于捕获未知目标序列的高特异DNA Walking ACP (DW-ACP)引物组成。
据此优化的PCR反应条件（以下称为DW ACP-PCR技术）可以获取长达3kb的未知侧翼序列。
一种全新的扩增未知目标序列的快速PCR方法。
试剂盒由PCR Master Mix和专为高特异度捕捉未知靶点的独特DNA步移退火控制引物(DW-ACPs)组成。
此最优化的PCR条件，称为 DW ACP-PCR TM 技术，可以获取长达3kb的未知侧区。
此试剂盒是直接扩增未知序列的革命性方法。
"Nature 'Product focus-Transgeni cs' September 7, 2006"!特点：*最简单此方法无须建库，无须酶切，无须固定，也无须复杂PCR*最快捷你的目标产物可在一天内获得，此方法超越其他现有方法*最可靠只获取目标产物应用范围：●基因组步移- 启动子区域的克隆或者测序- 基因结构(外显子/内含子结合区) - 已知序列上下游侧翼的扩增- cDNA步移- 裂隙填补(Gap Filling)- 序列标签位点(STSs)和表达序列标记(EST)的双向测序●转基因位点检测- 在转基因生物如转基因植物，动物，昆虫，鱼和细菌中发现转基因或T-DN A的位置或导向- 直接扩增并分离出具有转基因或T-DNA的侧翼区域的DNA片断●缺失/插入/突变体的检测- 检测基因组DNA或cDNA的缺失，插入，或者突变体- 剪切分析●测序- BAC / PAC DNA的末端测序或者步移- BACs或者基因组DNA的直接测序- 基因组DNA，cDNA或质粒DNA (BAC, PAC, YAC)的测序- 无须亚克隆或者鸟枪克隆即可对BA C或PAC克隆测序- 长链DNA的快速测序- 基因组测序计划*基因组步移-启动子区域的克隆或者测序-基因结构(外显子/内含子结合区) -裂隙填补(Gap Filling)客户列表中国科学院上海生命科学研究院中国科学院动物所中国农业科学院中国热带农业科学院云南大学云南农业大学中国农业大学浙江大学南京农业大学西南农业大学......DNA WALKING REFERRENCE1. Characterization of Mutations in AlHK1 Gene from Alternaria l ongipes: Implication of Limited Function of Two-Component Histid ine Kinase on Conferring Dicarbo ximide Resistance. J. Microbiol. Biotechnol. (2008), 18(1), 15–222. 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体外pcr上下游引物作用原理
体外pcr上下游引物作用原理体外PCR（聚合酶链反应）是一种常用的DNA扩增技术，可以在体外快速复制特定的DNA片段。
而PCR的成功与否，很大程度上取决于上下游引物的设计与选择。
本文将介绍体外PCR上下游引物的作用原理。
上下游引物即PCR反应中的两个引物，分别位于待扩增DNA片段的5'端和3'端。
它们的作用是在PCR反应中定向引导DNA的扩增。
上游引物与待扩增DNA片段的3'端互补，而下游引物与待扩增DNA片段的5'端互补。
上下游引物的设计需要考虑以下几个方面：1. 引物长度：引物的长度通常在18-30个碱基对之间。
引物过短可能导致特异性降低，引物过长则可能导致扩增效率降低。
2. 引物序列：引物的序列应该与待扩增DNA片段的特定区域互补，以确保引物与目标序列能够特异性结合。
为了提高特异性，可以使用引物设计软件进行引物序列的分析和优化。
3. 温度：引物的设计还需要考虑PCR反应的温度条件。
引物的熔解温度（Tm）应该相似，确保它们在PCR反应的温度范围内能够特异性结合于待扩增DNA片段。
上游引物与下游引物的作用原理如下：1. 上游引物：上游引物位于待扩增DNA片段的5'端，它的作用是引导DNA聚合酶从待扩增DNA片段的3'端向5'端合成新的DNA 链。
上游引物与待扩增DNA片段的3'端互补，通过特异性结合，DNA聚合酶能够在上游引物的引导下在待扩增DNA片段上合成新的DNA链。
2. 下游引物：下游引物位于待扩增DNA片段的3'端，它的作用是引导DNA聚合酶从上游引物合成的新DNA链的5'端向3'端合成第二条新的DNA链。
下游引物与待扩增DNA片段的5'端互补，通过特异性结合，DNA聚合酶能够在下游引物的引导下在待扩增DNA片段上合成另一条新的DNA链。
通过上下游引物的作用，PCR反应可以在体外快速复制特定的DNA片段。
分子生物学
1. 全世界第一例基因治疗成功的疾病是A. β地中海贫血B. 血友病C.重症联合免疫缺陷症D. 高胆固醇血症E. 糖尿病2. 理论上讲，基因治疗最理想的策略是A.基因置换B. 基因替代C. 基因失活D. 免疫调节E. 导入“自杀基因”3. 目前基因治疗所采用的方法中，最常用的是A. 基因置换B.基因替代C. 基因失活D. 免疫调节E. 导入“自杀基因”4. 利用反义核酸阻断基因异常表达的基因治疗方法是A. 基因置换B. 基因替代C. 基因矫正D.基因失活E. 免疫调节5. 将白细胞介素-2基因导入肿瘤病人体内，提高病人IL-2的表达水平，进行抗肿瘤辅助治疗。
这种基因治疗方法是A. 基因置换B. 基因替代C. 基因矫正D. 基因失活E.免疫调节6. 下列哪种方法不是目前基因治疗所采用的方法A.基因缺失B. 基因置换C. 基因替代D. 基因失活E. 免疫调节7. 基因治疗的基本程序中不包括A. 选择治疗基因B. 选择载体C. 选择靶细胞D.将载体直接注射体内E. 将治疗基因导入靶细胞8. 下列哪种方法不属于非病毒介导基因转移的物理方法A. 电穿孔法B.脂质体法C. DNA直接注射法D. 显微注射法E. 基因枪技术9. 下列哪种方法属于非病毒介导基因转移的化学方法A. 电穿孔法B. 基因枪技术C. DNA直接注射法D. 显微注射E. DEAE-葡聚糖法10. 将外源治疗性基因导入哺乳动物细胞的方法不包括A. 显微注射法B. 电穿孔法C. 脂质体法D. CaCl2法E. 病毒介导的基因转移11. 目前在基因治疗的临床实施中，最常使用的载体是A.逆转录病毒载体B. pBR322C. λ噬菌体D. pUC18E. YAC12. 逆转录病毒载体的特点中不包括A. 容量约10kbB. 有潜在危险性C. 基因转移效率较高D. 只感染分裂状态的细胞E.感染细胞后产生高滴度病毒13. 腺病毒载体的特点中不包括A. 所获病毒滴度高B. 外源基因可瞬时高表达C.外源基因长期稳定表达D. 基因组结构复杂E. 能感染分裂或非分裂状态的细胞14. 腺相关病毒载体的特点中不包括A. 容量相对小B. 优先整合于宿主染色体19q位点上C. 外源基因稳定表达D. 安全性好E.只感染分裂状态的细胞15. 单纯疱疹病毒载体的特点中不包括A.容量小于10kbB. 可感染神经细胞C. 外源基因不能长期表达D. 载体的毒副作用大E. 基因组结构复杂16. 在基因治疗时，目前哪一种细胞不能作为靶细胞A. 淋巴细胞B. 肿瘤细胞C.生殖细胞D. 肝细胞E. 造血细胞17. HIV感染的靶细胞是A. 红细胞B. B淋巴细胞C. CD4+T细胞D. CD8+T细胞E. 神经细胞18. 恶性肿瘤的基因治疗方案中，目的基因导入体内最常用的给药途径是A.瘤内注射B. 静脉注射C. 皮下注射D. 肌肉注射E. 骨髓移植19. 目前临床基因治疗方案中，针对的疾病最多的是A.癌症B. 单基因遗传病C. 心血管疾病D. 糖尿病E. 艾滋病20. 目前下列哪类疾病基因治疗效果最确切A.单基因遗传病B. 多基因遗传病C. 恶性肿瘤D. 感染性疾病E. 心血管疾病1．一个操纵子通常含有A．一个启动序列和一个编码基因B．一个启动序列和数个编码基因C．数个启动序列和一个编码基因D．数个启动序列和数个编码基因E两个启动序列和数个编码基因2．有关操纵子学说的论述，正确的是A．操纵子调控系统是真核生物基因调控的主要方式B．操纵子调控系统是原核生物基因调控的主要方式C．操纵子调控系统由调节基因、操纵基因、启动子和结构基因组成D．诱导物与阻遏蛋白结合启动转录E．诱导物与启动子结合而启动转录3．转录因子是A．调节DNA结合活性的小分子代谢效应物B．调节转录延伸速度的蛋白质C．调节转录起始速度的蛋白质D．调节转录产物分解速度的蛋白质E．促进转录产物加工的蛋白质4．阻遏蛋白（阻抑蛋白）识别操纵子中的A．启动基因B．结构基因C．操纵基因D．内含子E．调节基因5．在下列哪种情况下，乳糖操纵子的转录活性最高A．高乳糖，低葡萄糖B．高乳糖，高葡萄糖C．低乳糖，低葡萄糖D．低乳糖，高葡萄糖E．不一定6．顺式作用元件是指A．基因的5ˊ侧翼序列B．基因的3ˊ侧翼序列C．基因的5ˊ和3ˊ侧翼序列D．基因的5ˊ和3ˊ侧翼序列以外的序列E．具有转录调节功能的特异DNA序列7．反式作用因子是指A．具有激活功能的调节蛋白B．具有抑制功能的调节蛋白C．对自身基因具有激活功能的调节蛋白D．对另一基因具有激活功能的调节蛋白E．对另一基因有调节功能的蛋白质因子8．下列关于限制性内切酶的叙述哪一项是错误的A．它能识别DNA特定的碱基顺序，并在特定的位点切断DNAB．切割点附近的碱基顺序一般呈回文结构C．它能专一性降解经甲基化修饰的DNAD．是重组DNA的重要工具酶E．主要从细菌中获得9．基因工程中，不常用到的酶是A．限制性核酸内切酶B．DNA聚合酶C．DNA解链酶D．DNA连接酶E．反转录酶10下列哪项不能作为表达载体导入真核细胞的方法?A．磷酸钙转染B．电穿孔C．脂质体转染D．氯化钙转染E．显微注射11．重组体的筛选方法有A．抗药标志筛选B．标记补救C．分子杂交D．免疫化学E．酶联免疫检测12．cDNA是指A．在体内合成的与病毒DNA或RNA互补的DNAB．在体外经反转录合成的与DNA互补的DNAC．在体外经转录合成的与DNA 互补的RNAD．在体外经反转录合成的与RNA互补的DNAE．在体内经转录合成的与DNA 互补的RNA13．建cDNA文库时，首先需分离细胞的A．染色体DNAB．B．线粒体DNAC．C．总mRNAD．D．tRNAE．E．rRNA1．F因子从一个细胞转移至另一个细胞的基因转移过程称为：A．转化B．转导C．转染D．转座E．接合2．通过自动获取或人为地供给外源DNA使受体细胞获得新的遗传表型，称为：A．转化B．转导C．转染D．转座E．接合3．溶原菌是指：? A．整合了噬菌体基因组的细菌? B．整合了质粒基因组的细菌? C．含有独立噬菌体基因组的细菌???? D．含有独立质粒基因组的细菌? E．含有独立噬菌体和质粒基因组的细菌4．由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为：A．转化B．转导C．转染D．转座E．接合5．由整合酶催化、在两个DNA序列的特异位点间发生的整合称为：A．位点特异的重组B．同源重组C．基本重组D．随机重组E．人工重组6．发生在同源序列间的重组称为：A．位点特异的重组? B．非位点特异的重组? C．基本重组? D．随机重组? E．人工重组7．限制性核酸内切酶切割DNA后产生：?A．5? 磷酸基和3? 羟基基团的末端? B．3? 磷酸基和5? 羟基基团的末端? C．5? 磷酸基和3? 磷酸基团韵末端? D．5? 羟基和3? 羟基基团的末端? E．以上都不是8．可识别并切割特异DNA序列的称：? A．限制性核酸外切酶?? B．限制性核酸内切酶?C．非限制性核酸外切酶? D．非限制性核酸内切酶? E．DNA酶9．限制酶的识别顺序通常是：A．聚腺苷酸?B．聚胞苷酸C．RNA聚合酶附着点D．回文对称序列E．甲基化“帽”结构10．限制酶：? A．从噬菌体中提取而得B．可将单链DNA任意切开? C．可将双链DNA任意切开? D．可将双链DNA特异切开? E．不受DNA甲基化影响．11．限制酶的作用特性不包括：? A．在对称序列处切开DNA? B．同时切开双链DNA? C．DNA两链的切点常在同一位点? D．酶切后的DNA片段多具有粘性互补末端? E．酶辨认的碱基一般为4—6个12．限制酶的特点不包括：? A．只识别一种核苷酸序列? B．其识别不受DNA来源的限制? C．不同生物的DNA经相同限制酶切割后产生相同末端? D．对双链和单链DNA同样切割? E．同一限制酶在一DNA分子上可有数个切点?13．关于限制酶的叙述错误的是：? A．能识别DNA特定的碱基顺序并在特定的位点切开DNA? B．切割点附近的碱基顺序一般呈回文结构? C．它能专一降解经甲基化修饰的DNA? D．是重组DNA的主要工具酶? E．主要从细菌中获得14．在重组DNA技术中催化形成重组DNA分子的是DNA的：A．聚合酶B．解链酶C．连接酶? D．拓扑酶? E．内切酶15．在重组DNA技术领域所说的分子克隆是指：? A．建立单克隆抗体? B．建立多克隆抗体? C．构建重组DNA分子? D．无性繁殖DNA-? E．有性繁殖DNA16．无性繁殖依赖DNA载体的最基本性质是：? A．青霉素抗性? B．卡那霉素抗性? C．自我复制能力???? D．自我转录能力? E．自我表达能力17．重组DNA技术领域常用的质粒DNA是：A．细菌染色体DNA的一部分? B．细菌染色体外的独立遗传单位? C．病毒基因组DNA的一部分? D．真核细胞染色体DNA的一部分? E．真核细胞染色体外的独立遗传单位18．pBR322是：? A．天然的酵母质粒? B．经人工改造的酵母质粒? C．天然的大肠杆菌质粒? D．经人工改造的大肠杆菌质粒? E．经人工改造的噬菌体19．基因工程的操作程序可简单地概括为：? A．载体和目的基因的分离、提纯与鉴定? B．分、切、接、转、筛? C．将重组体导人宿主细胞，筛出含目的基因的阳性株? D．将载体和目的基因接合成重组体? E．限制酶的应用20．基因工程的基本过程不包括：? A．载体和目的基因的分离? B．限制酶的切割? C．DNA重组体的形成及转化? D．重组体的筛选与鉴定? E．重组体的序列分析21．理想的基因工程载体应：? A．分子尽可能大? B．有适宜的限制酶切割位点? C．含有多个耐药性基因? D．不易在宿主细胞间转移E．能整合于宿主细胞DNA，并随其复制22．下列哪一种物质不能作为基因（克隆）载体：? A．质粒??? B．λ噬菌体? C．M13噬菌体? D．病毒RNAE．逆转录病毒DNA23．用于转化哺乳类动物细胞的常用载体是：? A．质粒?? B．λ噬菌体? C．M13噬菌体? D．逆转录病毒DNA? E．大肠杆菌基因组24．关于建立cDNA文库的叙述，错误的是：A．从特定组织中提出mRNAB．将特定细胞的DNA用限制酶切割后，克隆到噬菌体或质粒中C．用逆转录酶合成mRNA的对应单股DNAD．用DNA聚合酶，以单股DNA为模板合成双链DNAE．加SAM，以使新生的DNA双链甲基化25．cDNA文库包括该种生物：A．某些蛋白质的结构基因B．所有蛋白质的结构基因C．所有结构基因D．结构基因与不表达的调控区E．内含子和调控区26．某限制性内切核酸酶切割5? …GGGGGG?? AATTCC…3? 序列后产生：A．5? 突出末端? B．3? 突出末端C．5? 及3? 突出末端D．5? 或3? 突出末端E．平头末端27．目的基因与载体连接不涉及：A．限制酶B．单链核酸酶C．末端脱氧核苷酸转移酶D．DNA连接酶E．核酸外切酶28．理想的宿主细胞不应有下列哪种特点：A．易接纳重组子B．对载体的复制扩增无严格限制C．不存在特异的限制酶体系以降解外源DNAD．不对外源DNA进行修饰? E．含有载体的筛选标记基因29．基因工程中不需要：? A．限制酶??? B．基因载体? C．DNA连接酶? D．末端脱氧核苷酸转移酶? E．核酶30．重组噬菌体DNA转入宿主细胞的过程属于：? A．转化? B．转导? C．转位? D．转染? E．转录??31．有关重组体转化及表达的叙述，错误的是：? A．宿主细胞经CaCl2处理后对重组体的通透性增加B．电击法也可增加宿主细胞的通透性? C．噬菌体为载体的重组体必须以体外包装的方式转化宿主细胞? D．真核基因难于在原核细胞中表达E．转化生殖细胞可采用直接导入的方法32．连接目的基因与载体不能采用：? A．粘端连接? B．平端连接? C．尾接法? D．人工连接器? E．非共价键连接33．直接针对目的DNA进行筛选的方法是：A．青霉素抗药性B．氨卞青霉素抗药性C．分子杂交D．分子筛E．电泳34．“克隆”某一目的DNA的过程不包括：? A．基因载体的选择与构建? B．外源基因与载体的拼接? C．重组DNA分子导入受体细胞?? ? D．筛选并无性繁殖含重组分子的受体细胞??? E．表达目的基因编码的蛋白质35．表达人类蛋白质的最理想的细胞体系是：A．E．coli表达体系B．原核表达体系C．酵母表达体系D．昆虫表达体系E．哺乳类细胞表达体系36．不能用作克隆载体的DNA是：A．质粒DNAB．噬菌体DNAC．细菌基因组DNAD．腺病毒DNAE．逆转录病毒DNA37．克隆的真核黄素基因组DNA可在多种系统表达，例外的是：A．E．coli表达体系B．酵母表达体系? C．昆虫表达体系? D．COS细胞表达体系? E．CHO细胞表达体系38．原核生物的粘端连接方式不涉及；A．质粒B．限制性核酸内切酶C．核酸外切酶D．退火E．DNA连接酶。
水牛促卵泡素受体(FSHR)基因启动子克隆、生物信息学分析及转录活性检测
水牛促卵泡素受体(FSHR)基因启动子克隆、生物信息学分析及转录活性检测朱鹏;庞春英;邓廷贤;段安琴;陆杏蓉;陈明棠;杨炳壮;梁贤威【摘要】试验旨在对广西本地水牛FSHR基因5'侧翼序列进行克隆、生物信息学分析及其转录活性检测.根据GenBank已公布的黄牛FSHR 5'侧翼序列,本试验设计引物,以广西本地水牛血液基因组为模板扩增FSHR基因5'侧翼序列并进行生物信息学分析.结果显示本试验成功克隆了广西本地沼泽型水牛FSHR 5'侧翼序列及部分CDS区序列,共2 979 bp,同源性比对分析结果表明其与河流型水牛、黄牛、绵羊、山羊、猪和人的同源性分别为100％、99％、93％、92％、91％和75％.对其5'侧翼2 000 bp序列进行启动子预测及转录因子结合位点预测,结果显示在其翻译起始位点上游-147 bp附近存在TATA box,启动子区存在GATAs、FOXO1、FOXO3、Nobox、STAT1、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B、STAT6和YY1等反式作用元件结合位点,其中GATAs家族基因在FSHR启动子区存在多个结合位点,且同一位点又存在多个GATAs家族基因结合的情况.水牛FSHR启动子能启动EGFP在HEK 293T细胞系中的表达,但表达非常微弱;也能启动EGFP在CHO细胞系中表达,且与CMV启动EGFP在CHO细胞系中的强度相似,结果表明水牛FSHR是个强启动子.总之,本研究成功克隆了沼泽型水牛FSHR基因启动子,分析了其启动子序列特征并成功验证其组织特异性的转录活性,为后期水牛繁殖性能分子机理阐明及基于卵巢特异性表达外源基因的转基因水牛奠定了基础.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2015(042)011【总页数】10页(P2833-2842)【关键词】水牛;FSHR;克隆;生物信息学分析;转录活性【作者】朱鹏;庞春英;邓廷贤;段安琴;陆杏蓉;陈明棠;杨炳壮;梁贤威【作者单位】中国农业科学院广西水牛研究所,广西水牛遗传繁育重点实验室,南宁530001;中国农业科学院广西水牛研究所,广西水牛遗传繁育重点实验室,南宁530001;中国农业科学院广西水牛研究所,广西水牛遗传繁育重点实验室,南宁530001;中国农业科学院广西水牛研究所,广西水牛遗传繁育重点实验室,南宁530001;中国农业科学院广西水牛研究所,广西水牛遗传繁育重点实验室,南宁530001;中国农业科学院广西水牛研究所,广西水牛遗传繁育重点实验室,南宁530001;中国农业科学院广西水牛研究所,广西水牛遗传繁育重点实验室,南宁530001;中国农业科学院广西水牛研究所,广西水牛遗传繁育重点实验室,南宁530001【正文语种】中文【中图分类】Q78水牛具有适应性强、耐高温高湿、耐粗饲、抗病力强、使用年限长、静默发情、繁殖力低和产奶量低等生物学特点［1－3］，非常适合于中国南方农村饲养，据FAO 2013年数据统计显示，2011年底中国水牛存栏量达2 338．2万头，仅次于印度11 291．6万头和巴基斯坦3 172．6万头，位居世界第三，在中国畜牧业产业中占有重要地位。
基因组步移技术概述
基因组步移技术概述高俊平(山东省潍坊科技学院贾思勰农学院潍坊262700)摘要基因组步移技术是一种常用的克隆已知片段旁侧序列的技术。
本文介绍了近年来出现的几种主流基因组步移技术，以期为相关研究提供方法借鉴。
关键词基因组步移基因组酶切连接PCＲ基因组步移(genomic walking)是指从第一个重组克隆插入片段的一端分离出一个片段作为探针，从文库中筛选第二个重组克隆，该克隆含有与探针相重叠的序列。
从第二个重组克隆再分离出末端小片段作为探针筛选第三个重组克隆，如此重复，得到一个相邻的片段。
它是一种重要的分子生物学研究技术，可以有效克隆已知片段侧翼的未知序列。
迄今为止，基因组步移主要有两种方法:一是结合基因组文库的基因组步移技术，此方法适于长距离步移，可以获得某一特定染色体较长连续区段的重叠基因组克隆群;另一个是以聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCＲ)扩增为主要手段的基因组步移技术，该方法产生的步移距离相对较短，但是操作简单，尤其适合于寻求已知片段旁侧的未知序列。
1基于基因组文库的基因组步移技术基因组文库是指生物体的全部DNA经过合适的核酸内切酶消化或机械切割以后，克隆到合适的载体分子中，所有这些插入了基因组DNA片段的载体分子的集合体，就包含了这个生物体的整个基因组信息，也就成为了此生物体的基因组文库。
它是基因组学研究的重要技术平台，目前构建基因组文库的方法主要有两种:物理剪切法和限制性内切酶法［1］。
以基因组文库为基础进行基因组步移的步骤大体如下:①用与目的基因连锁的分子标记为探针筛选整个基因组文库，鉴定出分子标记所在的大片段克隆;②再以该克隆为基因组步移的起点，用外侧克隆末端作为探针筛选基因组文库，分离新的重叠克隆(阳性克隆);③多次重复上述步骤，逐渐逼近目的基因，构建目的基因区域的重叠群;④通过亚克隆文库获得含有目的基因的小片段克隆，并对其进行遗传转化和功能互补验证，从而最终确定目的基因的核酸序列。