硫酸铜对斑马鱼胚胎发育的影响
斑马鱼的胚胎发育和行为观察
观察
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2024-01-11
• 斑马鱼基本概述 • 斑马鱼胚胎形态学观察 • 斑马鱼胚胎生理学观察 • 斑马鱼行为学观察方法与技术 • 斑马鱼行为学观察实例分析 • 总结与展望
01
斑马鱼基本概述
斑马鱼生物学特性
体型特征
食性
斑马鱼体型修长，侧扁，成鱼体长34厘米，呈纺锤形。体色为银蓝色或 银色，有数条黑色纵纹贯穿全身，形 似斑马线。
原肠胚期
原肠胚期是胚胎发育的重要阶段之一。在这个阶段，胚胎 内部细胞进一步分化形成中胚层，并开始形成消化管、神 经管等器官原基。
孵化期
孵化期是胚胎发育的最后阶段。在孵化前，胚胎内部器官 基本发育成形。随着孵化过程的进行，胚胎逐渐破膜而出 ，成为幼鱼。
02
斑马鱼胚胎形态学观察
受精卵形态与结构特点
受精卵呈圆球形，透 明度高，直径约 1mm。
受精卵表面有一层坚 韧的卵壳，保护胚胎 免受外界损伤。
卵黄囊较大，占据受 精卵的大部分体积， 为胚胎发育提供营养 。
卵裂期及囊胚期发育过程
卵裂期
受精卵经过连续多次快速分裂，形成多细胞胚胎。此阶段细胞数量增加，但胚 胎总体积基本不变。
囊胚期
细胞继续分裂并重新排列，形成囊胚。此时胚胎内部出现空腔，即囊胚腔，细 胞开始分化为内细胞团和外层细胞。
02
攻击性
在争夺领地、配偶或食物等资源时，斑马鱼可能会表现出攻击性。攻击
行为包括追逐、撕咬等，旨在将竞争对手赶出领地或获取所需资源。
03
行为影响因素
领域性和攻击性行为受到多种因素的影响，如个体大小、健康状况、环
境压力等。较大的个体通常更具攻击性，而环境压力可能导致斑马鱼的
硫酸铜对水产植物的影响及对策[最新]
![硫酸铜对水产植物的影响及对策[最新]](https://img.taocdn.com/s3/m/c423b377dcccda38376baf1ffc4ffe473368fd49.png)
硫酸铜对水产动物的影响及对策水产用硫酸铜化学式为CuS04·5H2O，含量96%左右。
它来源广、价格低，能杀死多种细菌、寄生虫、藻类及青苔等水产敌害生物。
其原理是Cu2+使生物体蛋白质变性而死亡。
与双效灵、晶体敌百虫等药物配伍使用具有菌虫双杀的效果。
基于以上原因，不少养殖户把它作为常备药物。
但是，硫酸铜客观上也给使用者带来风险，我市每年都会发生数起因使用硫酸铜造成水产动物死亡的事件，给养殖户造成经济损失、指导者蒙受精神压力。
经现场分析、结合权威报道参考，笔者认为硫酸铜对水产动物主要影响及解决对策有以下几点：一、中毒死亡1. 过量使用例1．1988年6月30日，马桥镇祖师村侯某蟹池泼洒硫酸铜杀青苔，浓度为1毫克/升，用药后，河蟹中毒上岸，死亡10多千克，加水急救后缓解。
由于各养殖品种、同一品种不同生长阶段及不同环境条件下对硫酸铜敏感程度不一，淡水白鲳、鳜鱼等鱼类对硫酸铜不敏感，主养鳜鱼的池塘只要溶氧充足，即使饵料鱼全部中毒死亡，鳜鱼却能安然无恙。
治疗淡水鲳原虫病常用浓度1.5毫克/升，青虾池使用浓度一般在0.3毫克/升以下，而中华鳖稚鳖的安全浓度为94.9毫克/升。
一些养殖户不了解这些特殊性，用药过量导致中毒死亡。
例2．2000年7月21日下午5时，斜桥镇灯杆村王某8亩河沟用硫酸铜治中华鳋病和鲢出血病，浓度为0.8毫克/升，22日上午7时，鲢、鲤、鲫、草相继浮出水面，呈严重缺氧状，呼吸节律变快，部分鱼有抽搐现象，鳃片上蒙有一层很淡的氧化膜，鳃丝扭曲。
所幸发现及时，大量进排水稀释，死鱼30千克左右。
硫酸铜毒性受水温、溶氧、pH值、县（悬）浮有机物等因子综合影响。
国内学者曾对白鲢做过试验：水温 16℃--30℃之间，温度每升高5℃，硫酸铜毒性就增强0.85—0.95倍。
对体重12克的鳙鱼试验，温度从22.9℃升至26.7℃，硫酸铜安全浓度从0.71毫克/升降至0.5毫克/升，Ca2+与水体中的游离氨结合生成Cu(NH3)²，毒性增强 1—1.4倍。
硫酸铜对水产动物的毒性研究现状
硫酸铜对水产动物的毒性研究现状作者：暂无来源：《渔业致富指南》 2020年第21期罗云云邓岳松水产常用的五水硫酸铜（CuSO4·5H2O）又名蓝矾、胆矾，呈透明蓝色结晶或粉末，无臭，具金属味，在空气中易风化，可溶于水和甘油，水溶液呈弱酸性。
在水产养殖中，硫酸铜常用来治疗鱼类寄生虫病以及控制或杀灭蓝绿藻等有害藻类的爆发，在生产中，由于硫酸铜的大量使用或滥用，在水环境中或者动物体内富集，一方面会造成水产养殖动物的中毒死亡，另一方面对食品安全造成严重威胁。
因此，科学合理使用硫酸铜不仅能提高水产养殖户的生产效益，促进鱼业健康发展，同时对生态环境保护、食品安全等都具有重大的意义。
本文就近年来有关硫酸铜对水产养殖动物的毒性研究做综述，旨在为水产从业者科学地使用硫酸铜提供理论参考。
1.硫酸铜在水产养殖上的应用硫酸铜作为杀虫剂在水产养殖上得到广泛的应用。
硫酸铜的杀虫作用原理是，一方面是铜离子能够与蛋白结合使其沉淀、变性，另一方面铜离子能破坏寄生虫体内的氧化还原酶系统（如巯基酶）的活性，阻碍虫体的代谢，从而对寄生虫起到杀灭作用；此外铜离子等重金属离子对青泥苔，蓝藻，细菌和真菌等有害生物也具有较强的杀灭作用。
硫酸亚铁具有收敛效应，可以增强铜离子的杀虫作用，因此生产生产上硫酸铜常与硫酸亚铁按重量比5:2比例配制使用，硫酸铜和硫酸亚铁合剂简称铜铁合剂，常以0.5-1.0g/m3浓度全池泼洒，用以治疗治疗水产养殖动物车轮虫、指环虫、斜管虫、杯体虫、波豆虫、锚头蚤、中华蚤、纤毛虫、鞭毛虫等寄生虫病。
2.硫酸铜对水产动物的毒性作用Cu2+对的水产动物的毒性作用包括急性毒性和慢性毒性作用，会对水产动物的组织器官、免疫系统、胚胎发育等造成一系列的损伤。
2.1对组织器官的损伤鳃是鱼类的呼吸器官，Cu2+对鱼类的毒性首先是离子通过鳃的表面组织或体表其它部位进入鳃和体内，从而对鳃或体表造成损伤。
郭海山等（1990）研究表明，当草鱼在硫酸铜浓度为0.7mg/L（铜离子0.28mg/L）水体中经过49天的饲养后，硫酸铜首先引起草鱼鳃小片毛细血管扩张，充血，上皮细胞炎性水肿，甚至脱落，坏死。
研究斑马鱼的胚胎发育及其关键期发育
研究斑马鱼的胚胎发育及其关键期发育斑马鱼作为实验室中常用的模式生物之一，其相对简单的生殖和发育过程使得它成为了人们研究胚胎发育的重要对象之一。
斑马鱼的生殖过程非常规律，整个胚胎发育周期为24小时左右，孵化出的幼鱼期只有3天时间，因此研究斑马鱼胚胎发育的关键期是极为重要的。
1.斑马鱼的繁殖周期按照斑马鱼的繁殖周期，胚胎发育可分为四个阶段：受精卵期、原肠胚期、中胚层期和胚胎期。
在受精卵期，由于胚胎的细胞数量较少，细胞分化还未开始，因此对于实验研究比较有利。
而原肠胚期则是胚胎细胞分化的关键时期，不同类型的细胞开始出现，胚胎的体轴形成也在这一时期完成。
中胚层期则是各个器官的形成时期，器官原基逐渐形成并开始发育。
胚胎期则是细胞分化和器官形成的阶段，各种器官开始具备其特定的功能。
2.斑马鱼的胚胎发育与研究方法在研究斑马鱼的胚胎发育过程中，有两种经典的实验方法：一种是观察胚胎的形态，另一种则是分子遗传学方法。
观察胚胎形态的方法包括显微镜观察、形态学分析、各种染色法和微剖检查等。
分子遗传学方法则包括DNA微注射、利用Tol2系统进行基因转染、利用Morphant植入进行基因敲除和利用各种转录因子进行基因表达调控等。
这些方法能够全面深入地研究斑马鱼发育过程中的各个细节，为发育生物学研究提供了成熟的基础。
3.斑马鱼的胚胎发育关键期胚胎发育关键期即是指在这些时期，斑马鱼胚胎发育过程中出现了大量的关键分化事件，从而对胚胎发育产生了决定性的影响。
比如，在受精卵期，精卵和精子合并形成的原始受精卵很快分裂成数千个相同大小的细胞，进入囊胚阶段，随后囊胚开始对细胞进行分化。
在这个时期，实验研究可以利用形态和分子生物技术，来全面了解斑马鱼胚胎发育基本的细胞分化过程。
原肠胚期则是一个重要的发育关键期，这时各个器官开始发育，形成胃肠道和脊髓，并且产生了一些重要的基因表达调控。
中胚层期和胚胎期是一个比较综合和复杂的发育时期，不同器官之间紧密联系和相互影响，分化程度和细胞命运已经初步确定，此时的特定基因已经被表达并进入各个器官的形态调控中。
斑马鱼模型在药物筛选和毒理学研究中的应用
斑马鱼模型在药物筛选和毒理学研究中的应用斑马鱼是一种普遍存在于淡水水域的小型鱼类，因其身上的黑白相间斑纹而得名。
近年来，斑马鱼模型在生命科学领域中得到广泛应用。
其中，其在药物筛选和毒理学研究中的应用备受关注和重视。
一、斑马鱼模型在药物筛选中的应用斑马鱼种群繁殖速度快、生命周期短，而其胚胎发育过程也非常短暂。
这些特点使得斑马鱼成为一种非常理想的药物筛选模型。
在药物筛选过程中，科学家常常会将化合物加入到斑马鱼的培养基中，然后观察其对斑马鱼发育和生长的影响。
斑马鱼的胚胎发育是一种非常重要的药物筛选指标。
在斑马鱼的胚胎发育过程中，可以通过观察斑马鱼的胚胎发育情况来判断一种化合物对斑马鱼的毒性，以及其对斑马鱼的发育是否有影响。
这种方法被称为斑马鱼毒性筛选法，已成为一种非常流行的毒理学研究手段。
斑马鱼模型在药物筛选和毒理学研究中的应用也促进了“三Rs”原则的实施。
即，减少动物实验、替代动物试验和改善动物试验条件。
斑马鱼模型的使用可以大大减少对实验动物的使用量，从而降低了实验过程中对动物的伤害和死亡率。
二、斑马鱼模型在毒理学研究中的应用斑马鱼模型在毒理学研究中的应用非常广泛，其毒性检测大多数都是通过斑马鱼生长、鉴别、生殖和神经发育等方面的影响来评估的。
1. 斑马鱼模型在生殖毒性检测中的应用斑马鱼的繁殖速度快，产卵量也比较大，因此非常适合用于生殖毒性实验。
生殖毒性测试是检测化学物质对生殖能力和生殖组织的影响的实验。
该实验可以观察斑马鱼繁殖场景是否正常，如是否输卵管或睾丸出现异常等。
2. 斑马鱼模型在鉴别毒性提示中的应用鉴别毒性提示是指生物体在受到某些毒性物质作用后，出现一些生理或行为异常的现象。
通过观察斑马鱼是否出现尾部畸形、脊柱曲度等症状，可以知道这种化学物质是否有鉴别毒性提示。
3. 斑马鱼模型在神经毒性检测中的应用斑马鱼在神经系统研究中也起着重要作用。
斑马鱼胚胎发育过程中，神经系统的形成是非常显著的。
因此，斑马鱼胚胎对于神经毒性物质的敏感度很高。
糙米发酵滤液的护肤功效研究-_斑马鱼实验
糙米发酵滤液的护肤功效研究—斑马鱼实验文/王志华 陈雪平 任姝静 陆震 刘 卫 王玉玲关键词：糙米发酵滤液、斑马鱼、保湿、美白、舒缓、修复与样品(5g/L)的混合液，于28±1 ℃恒温箱中培养3h后对鱼胚胎进行显微镜拍照后用Image J测量尾部面积并进行计算和统计分析。
鱼胚胎尾巴面积缩小抑制率计算公式为：抑制率=其中：T—样品处理组鱼胚胎尾巴面积的平均值 C—空白对照组鱼胚胎尾巴面积的平均值 M—模型对照组鱼胚胎尾巴面积的平均值2.2美白功效评价模型人类皮肤变黑的主要原因是酪氨酸酶促进黑色素合成，而斑马鱼具有和人类相同的黑色素调控机制，皮肤结构也与人类高度相似，且斑马鱼在胚胎阶段是透明的，色素细胞易于观察[11]，方便于显微镜下拍照，用分析软件定量读取黑色素含量水平，可比较鱼胚胎黑色素变化水平，因此，斑马鱼技术可有效地评价护肤品的美白功效。
实验参照T/SHRH 036-2021化妆品黑色素抑制—斑马鱼胚胎测试方法。
将96尾8h大斑马鱼胚胎分别置于96孔板中，每孔含1尾鱼胚胎，随机平均分为4组，设置为空白对照组、100%黑色素抑制组、阳性对照组和样品处理组，分别加入0.2mL鱼胚胎培养液、0.2mL 浓度为1.5mg/mL的苯硫脲溶液（完全抑制黑色素生成，用作100%美白效果对标数据）、0.2mL浓度为2.5g/ L的曲酸溶液 和0.2mL 浓度为5g/L的样品溶液，于28±1 ℃恒温箱中培养48h后对鱼胚胎进行显微镜拍照，用Image J测量鱼胚胎透光率作为色素信号强度并进行计算统计分析。
斑马鱼黑色素抑制率计算公式为：抑制率=其中：T—样品处理组鱼胚胎黑色素信号强度平均值 C—空白对照组鱼胚胎黑色素信号强度平均值 P—100%黑色素抑制组黑色素信号强度平均值2.3舒缓功效评价模型（中性粒细胞）斑马鱼胚胎的中性粒细胞和人体中性粒细胞在形态、生化和生理功能上高度相似。
受到外界刺激后，免疫反应的发生将导致中性粒细胞致免疫细胞的迁移和聚集，而中性粒细胞是在损伤或病菌入侵部位第一批出现的白细胞，作用是清除感染或有害物质[12][13]，因此，应用硫酸铜诱导斑马鱼胚胎侧线区域神经丘细胞损伤而引起中性粒细胞聚集的模型[14]进行测试，比较受试物处理组和模型对照组的鱼胚胎侧线区域中性粒细胞的数量变化，可作为评价原料、配方或产品舒缓功效的一种有效手段。
Cu 2+和Cd 2+对斑马鱼胚胎早期发育的联合毒性
ｄ ｖ ｌｐｍｅ ｔｔｘｃ ｔ ｅ ｈｎｑｕ ｅ ｅｏ ｎ ｏ ｉｉｙ ｔｃ ｉ ｅ． Ｔｈ ｏ ｅ ｒ ｓ ｎ ｅ ｃ ｖｅ ｆｔ ｗｏ ｈｅ ｖ ｔｌ ｏ ｄ ｂｅ ｅｆｃ ｉｅｙ ｃ ａ ａ ｔｒｚ ｄ ｙ ｔ ｅ Ｌｏ ｉ ａ ｄ ｅ ｄ ｓ —ｅ ｐｏ ｓ ａｒ ｓ ｏ ｈｅ ｔ ａ ｙ ｍｅａ ｓ ｃ ｕｌ ｆｅ ｔｖ ｌ ｈ ｒ ｃｅ ｉｅ ｂ ｈ ｇｔ ｎ Ｗ ｅｂ ｌｆ ｃｉｎｓｏ ｈ ｔ ｏ ｉｉｙ ｎ ｐｏｎｔ ｆ２４ ｈ ｅｈａ ａｅ ａ ｈ ａ ｃ ｉ ｉ ｉｉｎ ｒ ｔ ． Ｔｈ ｍｅ ａ ｅｈ ｌ ｏ ｅ ｒ ｔｏ ｉｕｌ ｕｎ ｔｏ ｎ ｔ ｅ ｗｏ ｔ ｘｃ ｔ ｅ ｄ ｉ ｓ ｏ ｌｔ ｌｒ ｔ ｎｄ ７２ ｈ ｔｈ ｎｈ ｂｔｏ ａ ｅ ｅ ｄｉｎ ｌ ｔａ ｃ ｎｃ ｎｔａｉ ｎ
和 （ Ａ） 独 立 作 用 （Ａ ２种 模 型 ， ７ Ｃ 与 Ｉ） 对 ２ｈ孵 化 抑 制 率 的 无 观 测 效 应 浓 度 （ Ｏ Ｃ） 比混 合 物 的联 合 毒性 作 用 进行 了 预 测 ， Ｎ Ｅ 配 通 过 混 合 物试 验 观 测数 据 的 ９ ％ 置 信 区 间 与 Ｃ 模 型 和 Ｉ ５ Ａ Ａ模 型 预 测 的 剂 量 一效 应 曲 线 进 行 比较 分 析 表 明 ， ２种 模 型 都 可 以有 效 预测 斑 马 鱼胚 胎 孵 化 的 联 合 毒 性 ． 关 键 词 ：重 金 属 ； 合 毒 性 ；斑 马 鱼 胚 胎 ； 度 加 和 ； 立 作 用 联 浓 独
Ａｃｄ ｍｙｏ ｎ ｉ ｎ ｎａ Ｓ ｉｎ ｅ ，Ｂ ｉ ｎ １０ １ ａ ｅ ｆＥ ｖｒ ｍｅ ｔｌ ｃｅ ｃ ｓ ｅｊ ｇ ０ ０ ２，Ｃ ｉａ ｏ ｉ ｈｎ
Ａｂｓｒ ｃ ：Ｔｈ ｏｘｃｔｅ ｆｔ ｅ ｖ ｔ ｌ ａ ｄ Ｃｄ ｔａ ｔ ｅ ｔ ｉ ｉｉｓｏ ｗｏ ｈ ａ ｙ ｍｅ ａｓ Ｃｕ ｎ ｔ ｍｂｒｏ ｄｅ ｅｏ ｍ ｅ ｒ ｅｔｒ ｎ ｄ ｕｓｎ ｈ ｅ ｒ ｆｓ ｍｂ ｏ ｅ ｒｙ ｏｅ ｙ ｖ ｌ ｐ ｎｔｗｅ ｅ ｄ ｅ ｍｉ ｅ ｉ ｇ ｔ ｅ ｚ ｂ ａｉｈ ｅ ｒ ａ ｌ ｙ
重金属铜对动物的急性毒性试验
重金属铜对动物的急性毒性试验郑行泉【摘要】选取斑马鱼作为试验对象,研究重金属铜对动物的急性毒性影响,得出24 h、48 h的半数致死浓度.结果表明:重金属铜对斑马鱼24 h的LD50为0.2536mg/L,95％的可信限为0.1927～0.3336 mg/L,48 h的LD50为0.1035 mg/L,95％的可信限为0.08824～0.1214 mg/L.【期刊名称】《福建畜牧兽医》【年(卷),期】2018(040)005【总页数】3页(P14-16)【关键词】重金属铜;斑马鱼;急性毒性【作者】郑行泉【作者单位】福建省福州市马尾区畜牧站福州 350015【正文语种】中文铜是动物体内不可缺少的元素，尤其在体内酶促链中作用更为明显，是许多酶类（如赖氨酰氧化酶、超氧化物歧化酶和细胞色素C氧化酶等）的主要构成成分，在机体造血、新陈代谢、生长繁殖、生产性能和增强机体抵抗力等方面具有不可替代的作用。
但过量的铜会在体内富集，对蛋白质和酶会产生毒害作用[1]。
铜已逐渐成为环境的主要污染物之一，农业、水产养殖业上铜的大量使用[2]，导致铜离子的污染日趋严重，通过调查得知鱼塘中淤泥所含的重金属含量严重超标[3]，在中国也存在着农药滥用的现象，而农药中也含有重金属铜[4]。
采用实验室含水硫酸铜，按水生动物急性毒性试验的要求分组设计不同浓度组，对斑马鱼进行24 h、48 h急性毒性试验。
对所提出的问题加以证明，以了解重金属铜对动物和环境的影响。
1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 试剂实验室硫酸铜CuSO4·5H2O，分子量为249.68。
1.1.2 试验仪器 1 000 mL大烧杯2个，500 mL中烧杯2个，同型塑料小桶容量为3 500 mL 40个，温度计1根，电子天平1台，注射器3个，大水箱2个。
1.1.3 试验动物健康试验用斑马鱼，购自福州某花鸟市场。
挑选长度一致的斑马鱼，雌雄不限。
规格要求为健康，判断标准为体形正常、鳞片完整，各鱼鳍舒展无缺陷，行动活泼，食欲好，大小基本一致。
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中国海洋大学实验报告
年月日姓名：专业年级：同组者：
课程：发育生物学实验题目：硫酸铜对斑马鱼胚胎发育的影响
一．【实验目的】
1、锻炼独立开展科学实验、分析和解决实际问题的能力；
2、加深环境对动物受精及早期发育影响的理解
二.【实验原理】
重金属污染是近年渔业环境污染的公害之一。
随着工农业的发展，浓度严重超标的一些重金属离子被排入水体而造成污染，对鱼类有毒害作用。
目前水体中的重金属主要有Cd、Cu、Pb、Zn等。
其中Cu离子就具有较强的毒性，可以和蛋白质中游离的羧基形成不溶性的盐，使蛋白质变性，因此常被用作杀菌剂。
斑马鱼（Danio rerio）是常见的暖水性（21~32℃）观赏鱼，鲤科,个体小（4~5㎝），常年产卵，鱼卵易收集，性成熟周期短且胚胎透明，便于观察药物对其体内器官的影响。
雌性斑马鱼可产卵200枚，胚胎在24小时内就可发育成形，繁殖水温24℃时，受精卵经2~3天孵出仔鱼；水温28℃时，受精卵经36小时孵出仔鱼，这使得生物学家可以在同一代鱼身上进行不同的实验，进而研究病理演化过程并找到病因。
由于斑马鱼基因与人类基因的相似度达到87%，这意味着在其身上做药物实验所得到的结果在多数情况下也适用于人体，因此它受到生物学家的重视。
在斑马鱼的整个生活周期中，胚胎期和仔稚幼鱼早期发育阶段对重金属污染最为敏感。
据报道，波罗的海春天产卵的鲱鱼，在10 ppb 的Cu2+，水的盐度为5.7条件下即对它的受精和发育有影响。
30 ppb的Cu2+引起大西洋鲱鱼（Clupea harengus）卵的死亡，而35 ppb 的Cu2+也使太平洋鲱鱼（C.pallasi）的胚胎发生大量死亡[1]。
吴玉霖等1990年依据不同金属对褐牙鲆胚胎的滞育、致畸、成活率及孵化率的综合影响指际，得出5种金属对褐牙鲆胚胎的毒性大小顺序为：Cu2+>Zn2+>Cd2+>Pb2+>Cr3+,对仔鱼的毒性大小顺序为Cu2+>Cd2+>Zn2+>Pb2+>Cr3+ [2]。
三.【实验步骤】
1、实验材料
斑马鱼囊胚、CuSO4为分析纯，充分曝气的去离子水、24孔细胞培养板、恒温培养箱、用充分曝气的蒸馏水配置成浓度为5 mg/L 的CuSO4母液，用时稀释。
.
2、实验方法
1）硫酸铜浓度梯度的设定
经查阅文献，确定斑马鱼胚胎发育从受精到孵化出幼鱼过程中的CuSO4半致死浓度和安全浓度范围，设定5个浓度梯度和和1个对照组。
研究表明，Cu2+对大银鱼受精卵的安全浓度为0.00112 mg/L[3]，对鮸状黄姑鱼仔鱼的安全浓度为0.006mg/L[4]，所以设定对照组CuSO4的浓度梯度分别为0（空白对照），0.001 mg/L，0.01 mg/L，0.1 mg/L，1.0 mg/L，2.0 mg/L。
每个浓度组设定4个平行组。
使用暴晒后的
2）胚胎的挑选与培养管理
在显微镜下选取正常发育至囊胚时期（产卵2-3 h）的斑马鱼胚胎，按2-3个/ml的密度移入24孔细胞培养板的各培养孔内，每个培养板的第一列4个孔加入2 ml 标准稀释水作为空白对照，其余20个孔加入2 ml 重金属溶液，加盖以免溶液蒸发，置于25 ℃恒温培养箱中培养。
每12 h 换水一次，每次所换水中CuSO4溶液与最初浓度保持一致，每次换水量为原水量的1/2。
3、观察、记录
每隔12 h在显微镜下观察各组胚胎整体发育情况并拍照片记录。
鱼卵孵化后统计胚胎孵化率和仔鱼畸形率。
如果胚胎出现S型弯曲，萎缩，缺少头部，未形成体节以及出现增生或者分叉，心跳缓慢，心包囊肿等则认为胚胎发育畸形，对于初孵仔鱼，若出现活力弱，运动失调，鳍褶出现残缺，身体成深褐色，并在12 h 内死亡，则认为胚胎受到重金属的危害。
用观察心跳、身体运动及外物刺激有无反应来判断胚胎和仔鱼的死亡,死亡的胚胎和仔鱼立即从培养溶液中去除。
4、计算及数据分析
死亡率（%）=死亡的胚胎数/受精卵总数×100%
各实验组相关指标以3个平行组的平均数来代表，使用SPSS 13.0软件进行实验组间以及与对照组间的差异性分析，以P<0.05表示有显著差异，P<0.01表示有极显著差异。
四.【实验结果】
对照组第1组第2组
第3组第4组第5组36 h 发育情况：
对照组第1组第2组
第3组第4组第5组 58 h发育情况：
对照组第1组第2组
第3组第4组第5组
五.【讨论】
从上述实验结果来看，对照组和第5组死亡率最高，其中对照组胚胎的死亡可能是因为水质败坏，在显微镜下可明显观察到许多原生动物游动，并噬咬胚胎，同时还会消耗水中氧气，造成水体缺氧，胚胎发育异常。
第五组死亡率最高，这在预料之中，这一组CuSO4浓度最高，对胚胎的正常发育产生严重影响，比如胚胎死亡，发育畸形，仔鱼孵出后反应迟钝，动作缓慢，很快死亡。
从实验数据来看，刚开始随着Cu2+浓度的升高，胚胎死亡率出现降低的趋势，这可能是因为水中原生动物以及致病微生物的生长因此受到抑制，对胚胎的发育影响作用减小，而低浓度的Cu2+ 对斑马鱼胚胎毒害作用不明显。
从第三组之后，随着Cu2+浓度进一步升高和实验时间的延长，其对胚胎的毒害作用逐渐显著，因此死亡率升高。
同时，存在系统误差，比如因为分子之间会有间隙，在配置各浓度梯度的溶液时，把母液和自来水分开量取会导致混合后溶液体积有所改变致使浓度梯度不精确。
另外，重金属离子对斑马鱼胚胎发育的影响，与发育时间有关。
在本次试验中，实验用卵是发育至50%下包期间的鱼卵，对重金属离子的毒性作用十分敏感。
发育后期的鱼卵的耐受性应该会有所增加。
六、【参考文献】
[1] 李永祺，丁美丽.海洋污染生物学.北京：海洋出版社，1991:372-373.
[2] 吴鼎勋，洪万树.四种重金属对黄姑鱼胚胎和仔鱼的毒性[J].台湾海峡，1999，18（2）:186-190.
[3] 李国基等.金属离子对牙鲆仔鱼的毒性作用[J].海洋学报，1996（6）：34-39.
[4] 雷衍之.养殖水环境化学.北京：中国农业出版社，2004：257-258.。