蛋白质定向进化技术的发展和应用.ppt
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蛋白质定位方法PPT课件
基因更为灵敏和迅速。Confocal能有效消除同一焦平面上非检测点的 杂散荧光和非焦平面荧光的干扰，使分辨率提高，获得清晰图象，而 且它具有逐层扫描功能，可对组织细胞进行无损伤的系列光学切片。 Confocal的应用更有利于GFP在生物学研究中的应用。
7
原理
应用DNA亚克隆技术，将目的基因与GFP基因 构成融合基因，通过愈伤组织转化法、基因枪、 显微注射、电激转化等方法转化合适的细胞，利 用目的基因的基因表达调控机制，如启动子和信 号序列来控制融合基因的表达，在荧光显微观察 系统下监测融合蛋白在细胞内的存在状态。
蛋白质定位方法之与gfp构建融合基 因，用荧光显微镜观察
姓名：刘怀禹 学号：2013211016
1
导言
真核细胞具有复杂的亚细胞结构， 已发现数十种细胞器，每种细胞器都 有一组特定的蛋白。真核细胞除叶绿 体，线粒体能少量合成蛋白外，绝大 部分蛋白是在胞浆或粗糙内质网合成， 最终运送到不同地点，形成成熟蛋白 并行使功能。转译产物中很大一部分 是以前体蛋白形式存在，往往有蛋白 分子定位信号，可引导蛋白在胞内定 位。蛋白质在细胞内的定位问题，是 细胞生物学研究的中心问题，也是分 子生物学研究的热门话题。目前，这 方面的工作己取得很人进展。细胞器 不同，相应的靶向蛋白的定位过程也 不同。
目的基因
融合基因 gfp
转化
表达
荧光显微观察
8
蛋白质研究
将GFP作为荧光探针，与要研究的蛋白质融合在一起， 进行活细胞内蛋白质的分布与变化研究。此方法在过M类蛋白OsCaM61，含有N一端CaM区域，C端 有异戊二烯化位点。将OsCaM61与GFP融合起来，研究其亚 细胞定位，发现GFP- OsCaM61融合蛋白是膜结合的，而 OsCaM61-GFP却主要在核质。用mevinolin处理细胞，阻止 类异戊二烯合成，引起GFP- OsCaM61运输到核质。前者C 端的异戊二烯化位点是活跃的而后者的位点被掩盖。此蛋 白的异戊二烯化状态对于细胞定位起决定性作用。亚细胞 定位依赖于蛋白的异戊二烯化状态，表明在不同的生理条 件下，这种类CaM可能通过结合到定位于不同细胞成分的 靶子上，起到不同的功能作用(Aiwa Dong et a1.,2002)
7
原理
应用DNA亚克隆技术，将目的基因与GFP基因 构成融合基因，通过愈伤组织转化法、基因枪、 显微注射、电激转化等方法转化合适的细胞，利 用目的基因的基因表达调控机制，如启动子和信 号序列来控制融合基因的表达，在荧光显微观察 系统下监测融合蛋白在细胞内的存在状态。
蛋白质定位方法之与gfp构建融合基 因，用荧光显微镜观察
姓名：刘怀禹 学号：2013211016
1
导言
真核细胞具有复杂的亚细胞结构， 已发现数十种细胞器，每种细胞器都 有一组特定的蛋白。真核细胞除叶绿 体，线粒体能少量合成蛋白外，绝大 部分蛋白是在胞浆或粗糙内质网合成， 最终运送到不同地点，形成成熟蛋白 并行使功能。转译产物中很大一部分 是以前体蛋白形式存在，往往有蛋白 分子定位信号，可引导蛋白在胞内定 位。蛋白质在细胞内的定位问题，是 细胞生物学研究的中心问题，也是分 子生物学研究的热门话题。目前，这 方面的工作己取得很人进展。细胞器 不同，相应的靶向蛋白的定位过程也 不同。
目的基因
融合基因 gfp
转化
表达
荧光显微观察
8
蛋白质研究
将GFP作为荧光探针，与要研究的蛋白质融合在一起， 进行活细胞内蛋白质的分布与变化研究。此方法在过M类蛋白OsCaM61，含有N一端CaM区域，C端 有异戊二烯化位点。将OsCaM61与GFP融合起来，研究其亚 细胞定位，发现GFP- OsCaM61融合蛋白是膜结合的，而 OsCaM61-GFP却主要在核质。用mevinolin处理细胞，阻止 类异戊二烯合成，引起GFP- OsCaM61运输到核质。前者C 端的异戊二烯化位点是活跃的而后者的位点被掩盖。此蛋 白的异戊二烯化状态对于细胞定位起决定性作用。亚细胞 定位依赖于蛋白的异戊二烯化状态，表明在不同的生理条 件下，这种类CaM可能通过结合到定位于不同细胞成分的 靶子上，起到不同的功能作用(Aiwa Dong et a1.,2002)
蛋白质工程的崛起课件一(29张PPT)[可修改版ppt]
![蛋白质工程的崛起课件一(29张PPT)[可修改版ppt]](https://img.taocdn.com/s3/m/5226fade76c66137ef0619a3.png)
• C．蛋白质工程能产生出自然界中不曾存在过 的新型蛋白质分子
• D．蛋白质工程与基因工程密不可分，又被称 为第二代基因工程
• 3以下关于蛋白质工程的说法正确的是 （Ａ ）
• A、蛋白质工程以基因工程为基础
• B、蛋白质工程就是酶工程的延伸
• C、蛋白质工程就是用蛋白酶对蛋白质进行 改造
• D、蛋白质工程只能生产天然的蛋白质
蛋白质工程的崛起 课件一(29张PPT)
1983年美国科学家Ulmer首 先提出蛋白质工程，它是指 按照特定的需要，对蛋白质 分子设计和改造工程，自此 以后，蛋白质工程迅速发展， 成为生物工程重要组成部分
（一）蛋白质工程崛起的缘由
基因工程的实质：
将一种生物的 基因 转移到另
一种生物体内，后者产生它本不能
练习：
• 1、 蛋白质工程中直接需要进行操作的对 象是（ Ｄ ）
• Ａ．氨基酸结构 B．蛋白质空间结构
C．肽链结构
D．基因结构
• 2、 下列关于蛋白质工程的说法错误的是 （Ｂ ）
• A．蛋白质工程能定向改造蛋白质分子的结构， 使之更加符合人类的需要
• B．蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子 直接进行操作，定向改变分子的结构
讨论：1、怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？ 请把相应的碱基序列写出来。
蛋白质工程的实质 对编码蛋白质的基因进行改造
三、蛋白质工程的进展和前景
蛋白质工程汇集了当代分子生物学等学科的 一些前沿领域的最新成就，它把核酸与蛋白质 结合、蛋白质空间结构与生物功能结合起来研 究。蛋白质工程将蛋白质与酶的研究推进到崭 新的时代，为蛋白质和酶在工业、农业和医药 方面的应用开拓了诱人的前景。蛋白质工程开 创了按照人类意愿改造、创造符合人类需要的 蛋白质的新时期。
• D．蛋白质工程与基因工程密不可分，又被称 为第二代基因工程
• 3以下关于蛋白质工程的说法正确的是 （Ａ ）
• A、蛋白质工程以基因工程为基础
• B、蛋白质工程就是酶工程的延伸
• C、蛋白质工程就是用蛋白酶对蛋白质进行 改造
• D、蛋白质工程只能生产天然的蛋白质
蛋白质工程的崛起 课件一(29张PPT)
1983年美国科学家Ulmer首 先提出蛋白质工程，它是指 按照特定的需要，对蛋白质 分子设计和改造工程，自此 以后，蛋白质工程迅速发展， 成为生物工程重要组成部分
（一）蛋白质工程崛起的缘由
基因工程的实质：
将一种生物的 基因 转移到另
一种生物体内，后者产生它本不能
练习：
• 1、 蛋白质工程中直接需要进行操作的对 象是（ Ｄ ）
• Ａ．氨基酸结构 B．蛋白质空间结构
C．肽链结构
D．基因结构
• 2、 下列关于蛋白质工程的说法错误的是 （Ｂ ）
• A．蛋白质工程能定向改造蛋白质分子的结构， 使之更加符合人类的需要
• B．蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子 直接进行操作，定向改变分子的结构
讨论：1、怎样得出决定这一段肽链的脱氧核苷酸序列？ 请把相应的碱基序列写出来。
蛋白质工程的实质 对编码蛋白质的基因进行改造
三、蛋白质工程的进展和前景
蛋白质工程汇集了当代分子生物学等学科的 一些前沿领域的最新成就，它把核酸与蛋白质 结合、蛋白质空间结构与生物功能结合起来研 究。蛋白质工程将蛋白质与酶的研究推进到崭 新的时代，为蛋白质和酶在工业、农业和医药 方面的应用开拓了诱人的前景。蛋白质工程开 创了按照人类意愿改造、创造符合人类需要的 蛋白质的新时期。
定向进化 蛋白设计
定向进化和蛋白设计是两个相关的领域，它们主要与蛋白质的功能和性能改造有关。
定向进化是一种实验室技术，通过逐代选择和突变蛋白质基因，以改变蛋白质的性质和功能。
这种方法主要基于自然界中存在的多样性，通过模拟进化过程来优化和改良蛋白质的性能。
定向进化的目标是通过改变蛋白质表现型的基因改变，以获得更好的功能特性。
蛋白设计是一种计算机辅助的方法，通过理论模型和计算算法来设计新的蛋白质序列，以实现特定的功能或性能。
蛋白设计的目标是通过改变蛋白质的序列和结构来实现新的功能或改进已知功能。
这两种方法可以互相结合使用，以实现更好的蛋白质设计和优化。
定向进化可以通过实验的方式改变蛋白质的性质，并获得一些变种，然后使用蛋白设计的方法进行计算机分析和优化。
通过这种综合的方法，可以实现对蛋白质的精确控制和改造。
定向进化和蛋白设计在化学、生物学、医药等领域有广泛的应用，可以用于开发新药物、改善酶的性能、研究蛋白质结构和功能等。
这些方法在蛋白质工程和生物技术领域具有重要的意义。
蛋白质分子的定向进化
自由能
氨基酸序列与蛋白质空间结构的关系研究源于美 国生物化学家安芬森（C.Anfinsen）。 1961年，他研究了核糖核酸酶的去折叠和重折叠 过程，发现在相同的环境中去折叠的蛋白质都会 恢复到原来的空间结构，认为蛋白质链会以自由 能最低的方式形成三维结构，由此推测蛋白质的 折叠密码隐藏在氨基酸排序中，即所谓的安芬森 原则：蛋白质一级排序决定三维结构。 因为“对控制蛋白质链折叠原理的研究”，安芬 森获得1972年诺贝尔化学奖。
交错延伸PCR
交错延伸(stagger extension process, StEP)PCR是在PCR 反应中把常规的退火 和延伸合并为一步， 缩短其反应时间，从 而只能合成出非常短 的新生链，经变性的 新生链再作为引物与 体系内同时存在的不 同模板退火而继续延 伸。此过程反复进行， 直到产生完整的基因 长度。
E（Glu）G(Gly)
Carlsberg型 S(Ser)
A(Ala)
噬菌体展示技术(Phage Display)
原理：噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目 的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置， 在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下， 使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代 噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。被展示的多肽或 蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶 分子的识别和结合。肽库与固相上的靶蛋白分子经过一定 时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体 或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感 染宿主细胞后经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过3轮～5 轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体 得到高度富集。所得的噬菌体制剂可用来做进一步富集有 期望结合特性的目标噬菌体。
蛋白定向进化及应用进展
蛋白定向进化及应用进展袁 宁,胡又佳,朱春宝(上海医药工业研究院,上海200437)摘 要:目的作为对自然进化的体外模拟,定向进化是改进蛋白功能与活性的有效手段。
定向进化的成功与否取决于突变体库的多样性以及筛选方法的效率。
目前已发展出多种创造和筛选突变体的策略及手段,并将定向进化的对象从蛋白延伸到有机体,使定向进化在许多领域得到了广泛的应用。
关键词:定向进化;DNA 改组;全基因组改组;高通量筛选中图分类号:TQ931 文献标识码:A 文章编号:1005 1678(2008)01 0065 04Progress in directed evolution of protein and its applicationYUAN Ning,HU You jia,ZHU C hun bao(Shanghai Institute o f Pharmaceutical Industry ,Shanghai 200437,China)收稿日期:2007 05 22作者简介:袁宁(1977 ),男,江苏南京人,博士研究生,主要从事微生物与生化药学研究;朱春宝,通信作者,研究员,博士生导师,Tel:021 ******** 323,E mail:zhucb@ 。
随着现代生物科技的突飞猛进,以蛋白质为核心的产品或技术在科研、工农业生产、医药卫生、环保等领域中正发挥着越来越重要的作用。
为了使蛋白质产品能够更好地满足需求,人们一方面在不断发掘新的活性蛋白质,另一方面也开始将目光投向对现有蛋白质的改造。
在自然界,生命的进化和新功能的获得需要通过突变、重组和适者生存等过程来实现,而在实验室中进行的蛋白质改造正是对这一过程的模仿:首先创造突变文库,然后采用选择或筛选的方法从中挑选出满足特定要求的突变体。
由于目的蛋白质的特性是预先设定好的,因此这一改造过程被称为 定向进化(directed evolution) 。
按照创造突变的方式,定向进化可采取随机、半理性和理性等策略来进行。
生物人教版(2019)选择性必修3 3.4蛋白质工程的原理和应用(共41张ppt)
血红蛋白的三维结构模型
蛋白质分子的三 维晶体结构模型
基因的定点突变技术
比较
基因定点诱变
基因突变
相 发生的过程
同
点
结果
DNA复制过程中 产生新基因，从而产生新性状
不
场所
同
手段
点
方向
生物体外
PCR技术 定向改造
生物体内 物理化学方法 不定向性
5.蛋白质工程与基因工程的区别与联系
蛋白质工程
基因工程
起点 预期的蛋白质功能
为什么说蛋白质工程是第二代基因工程? 因为对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，必须通 过改造或合成基因实现。
一、蛋白质工程崛起的缘由
1.理论和技术条件:分子生物学、晶体学以及计算机技术 的迅猛发展,为蛋白质工程的崛起奠定了基础
2.基因工程的实质：将一种生物的基因转移到另一种生物 体内,后者可以产生它本不能产生的蛋白质,进而表现出新 的性状。 3.崛起的缘由
结果
可生产自然界不存在的蛋白 质
只能生产自然界已存在的蛋 白质
蛋白质工程
基因工程
原理 中心法则的逆转
基因重组
①蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基 因工程,对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质必须通过基 联系 因修饰或基因合成来实现,蛋白质工程离不开基因工程 ②基因工程中所用的某些酶也需要通过蛋白质工程进行修 饰或改造,以提高其功能
6、“二看法”判断基因工程和蛋白质工程
旁栏思考题 你知道人类蛋白质组计划吗？它与蛋白质工程有什么关系？ 我国科学家承担了什么任务？ 人类蛋白质组计划是继人类基因组计划之后，生命科学乃 至自然科学领域重大的国际合作科研项目。2001年，国际 人类蛋白质组组织宣布成立。2003年，该组织正式提出启 动两项重大国际合作项目：一项是由中国科学家牵头执行 的“人类肝脏蛋白质组计划”；另一项是由美国科学家牵 头执行的“人类血浆蛋白质组计划”；由此拉开了人类蛋 白质组计划的帷幕。
蛋白质定向进化技术
蛋白质定向进化技术
DE始于上世纪70年代，最早的一个例子是进化一 DE始于上世纪70年代，最早的一个例子是进化一 个来源于大肠杆菌的 E b g A蛋白， 这个酶几乎 A蛋白， 不具备 β-半乳糖苷酶的活性。通过以乳糖为单一 碳源的平板上筛选 L a c- 缺失的大肠菌株 ，野生 c型的 E b g A就进化成为了具有 β- 半乳糖苷酶活 A就进化成为了具有 性的酶。
蛋白质定向进化技术 （DE technology of Protein）
108032008105--108032008120 108032008105--108032008120
蛋白质定向进化技术
★定义（definition） 定义（definition） ★原理（theory） 原理（theory） ★显著特征（marked features） 显著特征（mar法（methods） ★筛选方法（screening technique） 选方法（ technique） ★应用及展望（application and prospects） 应用及展望（application prospects）
蛋白质定向进化技术
频率太高，产生的绝大多数酶将失去活性；太低 ， 野生型的背景太高，样品的多样性则较少。对于 每一 D N A序列来说，合理的碱基突变数是 1-3 。 A序列来说，合理的碱基突变数是 理想的碱基置换率和易错P R的最佳条件则依赖 理想的碱基置换率和易错P C R的最佳条件则依赖 于随机突变的目标 D N A片段的长度。 A片段的长度。
蛋白质定向进化技术
当 D N A s h u f f l i n g用来重组一套进化上相 g用来重组一套进化上相 关的基因时 ，又被称为 f ami l y s h u f f l i n g 。 N I 等用 family shuffling对同源性为 7 8 . 5 ％ shuffling对同源性为 -9 6 ％ 4种白蚁的 3 O--3 O 倍。
蛋白质定向进化技术222剖析PPT28页
蛋白质定向进化技术222剖析
1、战鼓一响，法律无声。——英国 2、任何法律的根本；不，不成文法本 身就是 讲道理 ……法 律，也 ----即 明示道 理。— —爱·科 克
3、法律是最保险的头盔。——爱·科 克 4、一个国家如果纲纪不正，其国风一 定颓败 。—— 塞内加 5、法律不能使人人平等，但是在法律 面前人 人是平 等的。 ——波 洛克
谢谢你的阅读❖ 知识就是财富❖ 丰富你的人生71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
1、战鼓一响，法律无声。——英国 2、任何法律的根本；不，不成文法本 身就是 讲道理 ……法 律，也 ----即 明示道 理。— —爱·科 克
3、法律是最保险的头盔。——爱·科 克 4、一个国家如果纲纪不正，其国风一 定颓败 。—— 塞内加 5、法律不能使人人平等，但是在法律 面前人 人是平 等的。 ——波 洛克
谢谢你的阅读❖ 知识就是财富❖ 丰富你的人生71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
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谢谢你的观看
定点突变 (Site-specific mutagenesis)
易错PCR (Error-prone PCR)
DNA重排(改组) (DNA shuffling)
23
定向进化技术的发展
定点突变（site-specific mutagenesis或site-directed mutagenesis）
无数的研究工作已经表明， 酶分子内某些氨基酸残基的微小 改变可使酶的催化能力和立体选 择性产生很大的改善。
2019-10-9
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13
遗憾的是，由于技术的限制，酶 分子中氨基酸残基与它的空间结构以 及结构—功能之间相互关系等信息严 重匮乏，加上这些关系又非常复杂， 迄今为止，人们对它们的理解和认识 仍然非常肤浅
2019-10-9
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11
从目前的情况来看，具有新功 能和特性的酶可以通过从大量未知 的自然种系中寻找以及对现有的天 然酶进行改造，其中对于在自然进 化过程中没有经过特性和功能选择 的酶而言，对现有的天然酶进行改 造比大量筛选可能更加合适。
2019-10-9
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12
对酶进行改造的理论基础:
2019-10-9
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3
酶的工业应用:
利用酶作为催化剂进行生物催化 与生物转化，已成为生产精细化学品、 手性药物、食品添加剂等的重要工具, 获得了广泛应用。
2019-10-9
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4
天然酶的局限:
随着酶催化应用范围的不断扩大 和研究的逐步深入，研究者已经越来 越发现，现有的天然酶的催化特性常 常不能很好地满足酶学研究和工业化 应用的要求。
65.5
2注01：9-1T0-m9为蛋白质的总体结构50%发生谢变谢性你的的温观看度，用以表征蛋白质的热稳定性。 31
易错PCR（error-prone PCR，简称EP-PCR）
利用PCR过程中出现的碱基错配对特定基因进行 随机诱变的技术称为易错PCR（error-prone PCR， 简称EP-PCR）。
随机引 导重组 (RPR)
2019-10-9
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36
交叉延伸程序
（Staggered extension process，StEP）
交叉延伸程序（Staggered extension process，
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7
天然酶的进化过程:
在自然进化过程中，进化保证 了酶对环境任何改变的适应能力， 但是自然进化既没有特定的方向， 也没有特定的目标，它是在整个生 物的繁殖和生存过程中自发进行.
2019-10-9
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8
酶的进化主要不是表现为某 个酶分子的活力和稳定性的不断 提高，而是在于生物整体的适应 能力、调控能力的增强，因此， 通常只要求酶在生物体内对特定 的生物学功能有专一性。
3 9 21 54 97 142 164 目
野生 Ile Ile Thr Cys Cys Thr Leu 0
100 41.9
假野生 Ile Ile Thr Thr Ala Thr Leu 0
100 41.9
A Cys Ile Thr Thr Cys Thr Leu 1
96 46.7
B Ile Cys Thr Thr Ala Thr Cys 1
与DNA shuffling相比，RPR具有以下优点：
a．用单链DNA为模板．对模板量要求少，大大降 低了亲本组分， 便利筛选
b．克服了DNA shuffling中片段重新组装前必须彻底 去除DNase I的缺点
c．片段组装体系与片段合成体系缓冲系统可兼容， 组装前无需纯化操作
2019d便-10．-9利随了机小引肽发的D改NA造合成谢不谢你受的观模看 板DNA长度的限制， 35
的DNA shuffling 技术 过渡模板随机嵌合生长(RACHITT)：与DNA
shuffling 概念上明显不同的、改进的基因家族重组 技术.
2019-10-9
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24
定点突变
定点突变（site-specific mutagenesis或sitedirected mutagenesis）是指在目的DNA片断（例如： 一个基因）的指定位点上引入特定的碱基对变化的 技术。
单一基因 或
相关DNA 序列或家族
DNase I随机片段化
重 复
阳性突变重组子
片段组装和基因重组
筛选
阴性突变重组子
2019-10-9
图1 DNA重谢排谢的你原 的观理看及简要步骤
34
阳性突变表型
阴性突变表型
随机引导重组(RPR)
体外随机引导重组是以单链DNA为模板，配合 一套随机引物，产生互补于模板不同位置的短DNA 片段库(由于碱基错配，这些短DNA 片段也含有少 量的点突变)，然后进行类似于DNA shuffle Ile Cys Thr Ala Cys Leu 1
0
52.9
D Cys Cys Thr Thr Cys Thr Cys 2
95 57.6
E Ile Cys Cys Thr Ala Cys Cys 2
0
58.9
F Cys Cys Cys Thr Cys Cys Cys 3
0
2019-10-9
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9
应用过程对酶的要求
在酶催化过程的研究和应用过程
中，人们总是期望酶的活力和稳定性 越高越好，并具备良好的催化性能： 能在非水溶剂、极端温度和pH等特 殊条件下催化反应，尤其重要的是能 接受自然界中不存在的各种底物。
2019-10-9
谢谢你的观看
10
正是由于天然酶的性质与 实际应用过程中人们对酶的期 望之间的巨大差距，使对天然 酶在分子水平上进行改造显得 十分重要和迫切。
蛋白质定向进化技术的发展和应用 ——构建新蛋白质(酶)的一种途径
2019-10-9
谢谢你的观看
1
生物体系之所以能够相对独 立地存在于自然界中，并维持其 独立性和生命的延续性，都是因 为生物体内的一系列酶在发挥着 作用。
2019-10-9
谢谢你的观看
2
酶保证了生物体内组成生命活动 的大量生化反应得以按照预定的方向 有序、精确而顺利地进行，几乎所有 生物的生理现象都与酶的作用紧密相 关，可以这样说，没有酶的存在，就 没有生物体的一切生命活动。
为了降低PCR中DNA复制的精确度，最常用的
方法是在Taq DNA聚合酶催化的PCR反应体系中加
入一定量的Mn2+（替代天然的辅助因子Mg2+），并
同时使反应体系中各种dNTP的比例失衡（通常是将
其中的一种dNTP降至5%~10%）。这样，由于Taq
DNA聚合酶缺乏校对活性，其错配率会大大增加，
通常可以达到每千碱基对1个突变左右。另外，还可
2019-10-9
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14
如何利用相对简单的方法 以达到对天然酶的改造或构建 新的非天然酶就显得非常有研 究意义和应用前景。
2019-10-9
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15
解决办法:蛋白质定向进化
20世纪80年代末，在PCR技术出现的
初期，就有人着手利用Error-prone PCR
技术改造蛋白质。
1994年，美国科学家Stemmer 开创了
易错PCR技术(error prone PCR) DNA改组(DNA shuflling)：由美国Stemmer 于1994
年首次提出 一项体外重组技术 随机引导重组(RPR) 1998 年,Arnold 提出了一种有
效的新方法 交错延伸技术(StEP)：由Zhao 等 提出, 是一种简化
20
定向进化技术( directed evolution) 的原理
Susanne Brakmann and Kai Johnsson (eds)
Directed Molecular Evolution of Proteins
Wiley-VCH,2002, ISBN 3-527-30423-1
2019-10-9
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17
定向进化技术的作用
使发生在自然界中漫长的进化过
程能在实验室中得以模拟，使人类可
以按照自己的意愿和需要改造酶分子
，甚至设计出自然界中原来并不存在
的全新酶分子(全新蛋白质)。
2019-10-9
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18
与自然进化相比，酶分子的 定向进化过程完全是在人为控制 下进行的，使酶分子朝向人们期 望的特定目标进化。
此后，研究者又设计出很多方法以提高定 点突变的频率，其中比较常用的Kunkel提出 的一种配合该技术的诱变体产量富集法。
2019-10-9
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27
Kunkel的诱变体产量富集法
Kunkel提出的这种方法用具dut和ung基因缺陷的 大肠杆菌制备M13载体。dut基因编码催化dUTP 分 解的dUTPase，该基因缺陷会使细胞中dUTP含量升 高，导致复制时少量dUTP代替dTTP掺入DNA。ung 基因编码尿嘧啶DNA糖基化酶，该基因缺失后，不 能除去掺入DNA的dUTP。因此，利用dut – ung –菌 株制备的M13载体中，大约1%的T被U取代。以这 样制备的M13(+)链为模板进行寡核苷酸介导的定点 突变，然后将得到的双链DNA转化到dut+ ung+菌株 中，最初的含UU的模板会被降解，而突变链则因不 含U被复制。这样，带有定点突变基因的噬菌体比 例可显著提高。
2019-10-9
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21
定向进 化过程 的原理
2019-10-9
谢aries)
2019-10-9
定向的 (Directed)
定点突变 (Site-specific mutagenesis)
易错PCR (Error-prone PCR)
DNA重排(改组) (DNA shuffling)
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定向进化技术的发展
定点突变（site-specific mutagenesis或site-directed mutagenesis）
无数的研究工作已经表明， 酶分子内某些氨基酸残基的微小 改变可使酶的催化能力和立体选 择性产生很大的改善。
2019-10-9
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遗憾的是，由于技术的限制，酶 分子中氨基酸残基与它的空间结构以 及结构—功能之间相互关系等信息严 重匮乏，加上这些关系又非常复杂， 迄今为止，人们对它们的理解和认识 仍然非常肤浅
2019-10-9
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从目前的情况来看，具有新功 能和特性的酶可以通过从大量未知 的自然种系中寻找以及对现有的天 然酶进行改造，其中对于在自然进 化过程中没有经过特性和功能选择 的酶而言，对现有的天然酶进行改 造比大量筛选可能更加合适。
2019-10-9
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对酶进行改造的理论基础:
2019-10-9
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酶的工业应用:
利用酶作为催化剂进行生物催化 与生物转化，已成为生产精细化学品、 手性药物、食品添加剂等的重要工具, 获得了广泛应用。
2019-10-9
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天然酶的局限:
随着酶催化应用范围的不断扩大 和研究的逐步深入，研究者已经越来 越发现，现有的天然酶的催化特性常 常不能很好地满足酶学研究和工业化 应用的要求。
65.5
2注01：9-1T0-m9为蛋白质的总体结构50%发生谢变谢性你的的温观看度，用以表征蛋白质的热稳定性。 31
易错PCR（error-prone PCR，简称EP-PCR）
利用PCR过程中出现的碱基错配对特定基因进行 随机诱变的技术称为易错PCR（error-prone PCR， 简称EP-PCR）。
随机引 导重组 (RPR)
2019-10-9
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交叉延伸程序
（Staggered extension process，StEP）
交叉延伸程序（Staggered extension process，
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天然酶的进化过程:
在自然进化过程中，进化保证 了酶对环境任何改变的适应能力， 但是自然进化既没有特定的方向， 也没有特定的目标，它是在整个生 物的繁殖和生存过程中自发进行.
2019-10-9
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酶的进化主要不是表现为某 个酶分子的活力和稳定性的不断 提高，而是在于生物整体的适应 能力、调控能力的增强，因此， 通常只要求酶在生物体内对特定 的生物学功能有专一性。
3 9 21 54 97 142 164 目
野生 Ile Ile Thr Cys Cys Thr Leu 0
100 41.9
假野生 Ile Ile Thr Thr Ala Thr Leu 0
100 41.9
A Cys Ile Thr Thr Cys Thr Leu 1
96 46.7
B Ile Cys Thr Thr Ala Thr Cys 1
与DNA shuffling相比，RPR具有以下优点：
a．用单链DNA为模板．对模板量要求少，大大降 低了亲本组分， 便利筛选
b．克服了DNA shuffling中片段重新组装前必须彻底 去除DNase I的缺点
c．片段组装体系与片段合成体系缓冲系统可兼容， 组装前无需纯化操作
2019d便-10．-9利随了机小引肽发的D改NA造合成谢不谢你受的观模看 板DNA长度的限制， 35
的DNA shuffling 技术 过渡模板随机嵌合生长(RACHITT)：与DNA
shuffling 概念上明显不同的、改进的基因家族重组 技术.
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定点突变
定点突变（site-specific mutagenesis或sitedirected mutagenesis）是指在目的DNA片断（例如： 一个基因）的指定位点上引入特定的碱基对变化的 技术。
单一基因 或
相关DNA 序列或家族
DNase I随机片段化
重 复
阳性突变重组子
片段组装和基因重组
筛选
阴性突变重组子
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图1 DNA重谢排谢的你原 的观理看及简要步骤
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阳性突变表型
阴性突变表型
随机引导重组(RPR)
体外随机引导重组是以单链DNA为模板，配合 一套随机引物，产生互补于模板不同位置的短DNA 片段库(由于碱基错配，这些短DNA 片段也含有少 量的点突变)，然后进行类似于DNA shuffle Ile Cys Thr Ala Cys Leu 1
0
52.9
D Cys Cys Thr Thr Cys Thr Cys 2
95 57.6
E Ile Cys Cys Thr Ala Cys Cys 2
0
58.9
F Cys Cys Cys Thr Cys Cys Cys 3
0
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应用过程对酶的要求
在酶催化过程的研究和应用过程
中，人们总是期望酶的活力和稳定性 越高越好，并具备良好的催化性能： 能在非水溶剂、极端温度和pH等特 殊条件下催化反应，尤其重要的是能 接受自然界中不存在的各种底物。
2019-10-9
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正是由于天然酶的性质与 实际应用过程中人们对酶的期 望之间的巨大差距，使对天然 酶在分子水平上进行改造显得 十分重要和迫切。
蛋白质定向进化技术的发展和应用 ——构建新蛋白质(酶)的一种途径
2019-10-9
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生物体系之所以能够相对独 立地存在于自然界中，并维持其 独立性和生命的延续性，都是因 为生物体内的一系列酶在发挥着 作用。
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酶保证了生物体内组成生命活动 的大量生化反应得以按照预定的方向 有序、精确而顺利地进行，几乎所有 生物的生理现象都与酶的作用紧密相 关，可以这样说，没有酶的存在，就 没有生物体的一切生命活动。
为了降低PCR中DNA复制的精确度，最常用的
方法是在Taq DNA聚合酶催化的PCR反应体系中加
入一定量的Mn2+（替代天然的辅助因子Mg2+），并
同时使反应体系中各种dNTP的比例失衡（通常是将
其中的一种dNTP降至5%~10%）。这样，由于Taq
DNA聚合酶缺乏校对活性，其错配率会大大增加，
通常可以达到每千碱基对1个突变左右。另外，还可
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如何利用相对简单的方法 以达到对天然酶的改造或构建 新的非天然酶就显得非常有研 究意义和应用前景。
2019-10-9
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解决办法:蛋白质定向进化
20世纪80年代末，在PCR技术出现的
初期，就有人着手利用Error-prone PCR
技术改造蛋白质。
1994年，美国科学家Stemmer 开创了
易错PCR技术(error prone PCR) DNA改组(DNA shuflling)：由美国Stemmer 于1994
年首次提出 一项体外重组技术 随机引导重组(RPR) 1998 年,Arnold 提出了一种有
效的新方法 交错延伸技术(StEP)：由Zhao 等 提出, 是一种简化
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定向进化技术( directed evolution) 的原理
Susanne Brakmann and Kai Johnsson (eds)
Directed Molecular Evolution of Proteins
Wiley-VCH,2002, ISBN 3-527-30423-1
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定向进化技术的作用
使发生在自然界中漫长的进化过
程能在实验室中得以模拟，使人类可
以按照自己的意愿和需要改造酶分子
，甚至设计出自然界中原来并不存在
的全新酶分子(全新蛋白质)。
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与自然进化相比，酶分子的 定向进化过程完全是在人为控制 下进行的，使酶分子朝向人们期 望的特定目标进化。
此后，研究者又设计出很多方法以提高定 点突变的频率，其中比较常用的Kunkel提出 的一种配合该技术的诱变体产量富集法。
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Kunkel的诱变体产量富集法
Kunkel提出的这种方法用具dut和ung基因缺陷的 大肠杆菌制备M13载体。dut基因编码催化dUTP 分 解的dUTPase，该基因缺陷会使细胞中dUTP含量升 高，导致复制时少量dUTP代替dTTP掺入DNA。ung 基因编码尿嘧啶DNA糖基化酶，该基因缺失后，不 能除去掺入DNA的dUTP。因此，利用dut – ung –菌 株制备的M13载体中，大约1%的T被U取代。以这 样制备的M13(+)链为模板进行寡核苷酸介导的定点 突变，然后将得到的双链DNA转化到dut+ ung+菌株 中，最初的含UU的模板会被降解，而突变链则因不 含U被复制。这样，带有定点突变基因的噬菌体比 例可显著提高。
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定向进 化过程 的原理
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谢aries)
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定向的 (Directed)