大肠菌群的检测
大肠菌群检测(MPN法)
大肠菌群检测(MPN法)大肠菌群检测(MPN法)是一种常用的微生物学技术，可用于检测土壤、水源、食品等中的大肠菌群进行水质和食品安全监测。
本文将介绍大肠菌群及其检测方法-最可能数法(MPN法)。
一、大肠菌群概述大肠菌群是以肠道菌属为主体的一类细菌，包括肠道埃希菌、沙门氏菌、志贺菌、伤寒杆菌等成员，它们可以在人类和动物的肠道中生存并繁殖。
在自然界中，大肠菌群也是广泛存在的微生物家族，如彗星菌、副肠杆菌、耶尔森氏菌等都属于大肠菌群。
1.菌落计数法该方法主要是利用琼脂平板培养皿在水培的条件下，大肠菌群在培养基上经不同时间的生长，形成菌落来进行菌数计数。
缺点是容易受到其他微生物的干扰，只能算出概略的数值，一定误差，没有国家标准。
2. 硝酸德钠试剂法将测样加硝酸德阳试剂进行加热，最终乳黄色的镜检测前进行比色，得出含大肠菌群的细菌群落达标后延迟显色的时间。
该方法已被最可能数(MPN)法所替代。
3. 最可能数法(MPN法)该方法先将测量的样品分别稀释到不同浓度下，再将每一份稀释液添加到以琼脂平板固化培养基为基础的不同培养液中，观察哪一份培养液出现大肠菌群的生长，最后通过MPN表格计算每85ml或100ml的水样中最可能含有的大肠菌群数量，计算公式为：10^x = n / 联合效价（即dilution rate的倒数）其中，x代表最可能数，n代表测量到大肠菌群的样品数。
在实际工作中，MPN法检测显示出了较好的结果，优点是用固定方法，可重复性好，而且可以通过相关将分析获得定量值，便于与相关的标准进行比较。
三、大肠菌群的检测范围1. 水源：大肠菌群检测是办公室里检测饮用水可能携带的最佳方法。
一般情况下，检测过程是检测水中的微生物是否合乎标准。
2.食品：由于食品生产经常存在卫生要求，因此食品也是大肠菌群检测重要的一环。
例如，必须检测火腿或肉类制品中的大肠菌群是否合格以确保食品安全。
3. 其他领域：大肠菌群检测可以用于医学、农业、环境和建筑等领域，如医院污水浑浊度的检测和土壤中大肠菌群的检测。
3.大肠菌群的检测
2010 LST初发酵 BGLB验证
报告
GB4789.3-2010
第一法 大肠菌群MPN计数法
与4789.3-2003相比
l 初发酵培养基不同
原方法：乳糖胆盐肉汤 现方法：月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤
LST肉汤 是国际上通用的培养基。与乳糖胆盐肉汤的作用和意义相同， 但具有更多的优越性，LST中的选择性抑菌剂是月桂基硫酸盐，相对 于胆盐稳定性更好些。 还有就是LST更容易观察。
GB4789.3-2010
第一法 大肠菌群MPN计数法
Img_1039.jpg
GB4789.3-2010
第一法 大肠菌群MPN计数法
Img_1039.jpg
GB4789.3-2010
第一法 大肠菌群MPN计数法
复发酵 惶绿乳糖胆盐（BGLB）
GB4789.3-2010
第一法 大肠菌群MPN计数法
10 倍系列稀释
选择 2~3 个适宜稀释度的样品匀液，接种 VRBA 平板 选 择 适 宜 三 个 连 续 稀 释 度 的 样 品 匀 液， 接 种 LST 肉 汤 管 36℃±1℃ 18h~24h ± 计数1℃典℃型， 和可疑
报告结果
GB4789.3-2010
原方法 乳糖胆盐发酵管
现方法 LST
EC肉汤 EC
EMB 证实培养
报告
报告
GB/T4789.39-2008粪大肠菌群计数
与4789.3-2003不同
l 操作步骤不同 l 初发酵培养基不同
与FDA BAM的不同
l 试样量50g(ml) →25g(ml) l LST培养温度35℃±1℃ → 36℃±1℃ l EC培养温度45.5℃±0.2℃（一般食品）和
大肠菌群检测操作规范培训
大肠菌群检测操作规范培训一、引言大肠菌群是指肠道内的一类细菌，包括大肠埃希菌、变形杆菌、埃斯特菌、摩根氏菌等，是人体健康的重要指标之一。
大肠菌群检测是一种常见的临床检验项目，可以用于判断肠道菌群的平衡状况，对于排查肠道疾病、调节肠道菌群平衡等具有重要的临床意义。
本文旨在对大肠菌群检测相关的操作规范进行培训，以确保检测结果的准确性和可靠性。
二、前期准备1. 实验室环境准备：（1）实验室应当保持清洁整洁，操作台面应当有足够的空间进行操作。
（2）实验室空气应当流通良好，保持适宜的温度和湿度。
（3）实验室内应当配备必要的实验仪器和设备，如PCR仪、离心机、冰箱、显微镜等。
（4）实验室内应当配备必要的耗材和试剂，如离心管、移液器、试剂盒等。
2. 人员准备：（1）参与大肠菌群检测的工作人员应当接受相关的培训，了解操作规范和实验流程。
（2）工作人员应当穿着符合卫生要求的工作服和手套，避免交叉感染。
三、操作规范培训1. 样本采集：（1）样本采集应当在临床医生指导下进行，严格按照采集标本的要求进行操作。
（2）采集的样本应当尽快送交实验室进行检测，避免样本长时间保存导致细菌数量的改变。
2. 样本处理：（1）收到样本后，应当立即进行处理，避免样本受到外界污染。
（2）样本应当在无菌条件下进行离心、抽提DNA等处理工作，避免外来细菌的干扰。
3. PCR扩增：（1）PCR扩增是大肠菌群检测的关键步骤，应当严格按照PCR扩增试剂盒说明书进行操作。
（2）PCR扩增反应体系应当准确配制，避免试剂用量不足或过量导致扩增失败或者非特异性扩增。
4. 扩增产物检测：（1）扩增产物检测应当使用准确的方法，如琼脂糖凝胶电泳或者实时荧光定量PCR。
（2）扩增产物的检测结果应当与正对照和负对照比较，确保结果的准确性。
5. 数据分析：（1）检测结果应当由专门的人员进行数据分析，避免结果的误解和错误解读。
（2）对于阳性结果的样本，应当进行多次重复检测以确认结果的可靠性。
大肠菌群检测(平板计数法)
平板菌落数的选择
选择菌落数在15-150之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。 典型菌落为紫红色，菌落周围有胆盐与酸形成的沉淀环，菌落直径为0.5mm或更大。
什么样的菌落必须要做证实试验
一是非典型菌落，如在颜色、直径与典型菌落不符合的菌落。 另一种情况是被检样品中含有乳糖以外的其他糖类，如牛奶、饮料等样品。本
36℃±1 ℃ 18h ~24h
挑选10个菌落分别 接种到BGLB
VRBA琼脂
配方(g/L): 蛋白胨:7.0; 酵母粉:3.0;乳糖:10.0;3号胆盐:1.5;中性红:0.03;结晶紫:0.002;氯化 钠:5.0; 琼脂:15.0;pH 7.4±0.1,25℃ 其中蛋白胨提供氮源；酵母粉提供生长促进因子和Ｂ族维生素；乳糖提供碳源， 大肠菌群发酵乳糖，产生酸性物质；３号胆盐是一种抑菌剂，主要是抑制革兰氏 阳性菌；结晶紫也是一种抑菌剂，主要是抑制革兰氏阳性菌和一部分革兰氏阴性 菌；中性红是一种指示剂，在酸性条件显红色，碱性条件下显无色。氯化钠维持 细菌生长时的渗透压。琼脂是一种凝固剂。
10倍系列稀释
选择2~3个适宜稀释度的样液，接种VRBA平板
36℃±1℃
18~24h
计数典型和可疑菌落
注：VRBA(结晶紫中性红胆盐 琼脂)又称为：VRB或VRBL
BGh
报告结果
平板计数法操作
菌落数在15-150之 间的平板,计数典型
和可疑菌落
典型菌落为紫红色周围有 红色胆盐沉淀环，0.5mm
来大肠菌群的定义是发酵乳糖，但由于样品含有的其他糖类混入了培养基，使 得不能分解乳糖但能分解其他糖类的细菌也能够长出红色菌落，所以需要进行 证实实验。
结果报告
经最后证实为大肠菌群阳性的BGLB管的百分比乘以计数的平板菌落数，再乘 以稀释倍数，即为每g (mL)样品中大肠菌群数 。
大肠菌群测定注意事项
大肠菌群测定注意事项
1. 食物摄入：在进行大肠菌群测定前一天晚餐后，避免进食含有大量膳食纤维的食物，如豆类、水果、粗粮等，以免影响测定结果。
2. 药物使用：避免在测定前一周内使用抗生素、肠道清洁剂、益生菌等药物，这些药物可能会对大肠菌群的组成产生干扰。
3. 采样方法：在测定当天，使用专业的采样器具，如棉签或者便盆收集新鲜的大便样本。
避免将尿液、纸巾等杂质掺入样本中。
4. 保存条件：将采样后的样本尽快送至实验室进行检测，如无条件送达实验室，可将样本存放在4的冰箱中，并在24小时内送达实验室。
5. 个人卫生：在采样前，应保持个人卫生，特别是双手的清洁。
最好在采集大便样本前进行手部消毒。
6. 忌充气：在采集大便样本时，避免充气，以免影响大肠菌群的结构和数量。
7. 避免受到环境因素的干扰：在采样过程中，避免接触宠物、花草等可能带有大肠菌群的微生物的环境。
8. 参考值的解读：不同实验室可能有不同的参考值范围，请在报告解读时参考
具体实验室给出的参考范围。
检测大肠菌群的方法
检测大肠菌群的方法
大肠菌群的检测方法可以包括以下几个方面：
1. 培养方法：可以采用传统的培养方法，将样本在含有特定培养基的培养皿上进行培养，并在适当条件下培养出大肠菌群。
然后通过形态特征、生理特性以及生物化学反应等来鉴定大肠菌群。
2. 分子生物学方法：包括PCR、实时荧光PCR、测序等技术。
通过特定引物扩增大肠菌群的特异基因片段，比如16S rRNA基因或者其他特定的核酸片段，然后通过序列比对和进化关系分析来确定大肠菌群的存在和数量。
3. 免疫学方法：可以使用特异性抗体进行检测，如免疫荧光染色、酶联免疫吸附试验（ELISA）等方法，通过检测特定抗原的存在来判断大肠菌群的存在。
4. 生化方法：通过检测样品中特定的代谢产物来间接判断大肠菌群的存在，比如检测大肠菌产生的气体（如氢气、二氧化碳等）、产酸性物质等。
这些方法可以根据具体的需求和实验条件选择合适的方法进行大肠菌群的检测。
大肠菌群检测标准
大肠菌群检测通常涉及对肠道微生物的定量或定性分析，以评估肠道健康状况。
这样的检测可能包括对大肠菌群中特定菌种或总体微生物的检测。
标准的具体内容可能因实验室、地区和具体检测方法而异，但以下是一些可能涉及的一般标准或步骤：
1. **样本采集：** 样本通常是从粪便中采集的，因为大肠菌群主要存在于肠道中。
采集的样本需要在合适的条件下保存，并迅速送到实验室进行处理。
2. **DNA提取：** 大肠菌群检测通常通过提取粪便样本中的微生物DNA来进行。
这可以使用特定的DNA提取方法完成。
3. **PCR扩增：** 通过聚合酶链反应（PCR）扩增从样本中提取的微生物DNA。
这可能包括使用特定引物来选择性地扩增大肠菌群的DNA片段。
4. **测序：** 扩增后的DNA片段可能会被测序，以确定其中包含的微生物的种类和数量。
高通量测序技术如16S rRNA基因测序通常用于这一步骤。
5. **数据分析：** 对测序数据进行分析，以识别并定量大肠菌群的不同成分。
这可能包括构建微生物组的组成和多样性图谱。
在具体的实验室和医学实践中，可能有特定的标准和指南，这些标准和指南通常由专业组织或卫生机构发布。
例如，美国微生物学学会（ASM）和世界卫生组织（WHO）可能提供有关微生物学检测的指南。
因此，在进行大肠菌群检测时，最好遵循特定实验室或国家/地区的相关标准。
大肠菌群的检测原理和方法
大肠菌群的检测原理和方法宝子们，今天咱们来唠唠大肠菌群的检测呀。
先说说检测原理哈。
大肠菌群呢，它是一群在一定条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。
这就像是给它们定了个小特征标签。
咱们利用这个特性来检测它们呢。
比如说在含有乳糖的培养基里，如果有大肠菌群，它们就会分解乳糖，让培养基的酸碱度发生变化，还可能产生气体。
就好像大肠菌群是一群小馋猫，看到乳糖这个美食就忍不住动手脚啦，然后我们就可以通过观察这些变化来判断有没有大肠菌群存在。
那检测方法呢？有好几种哦。
一种是多管发酵法。
咱先把样品接种到乳糖胆盐发酵管里，这就像是给大肠菌群安排了个小房间，看看它们会不会在这个房间里搞出动静来。
如果发酵管里有气体产生，而且培养液变浑浊了，那可能就有大肠菌群在里面嗨呢。
然后再把这些有反应的发酵管里的菌液接种到伊红美蓝琼脂平板上。
在这个平板上，大肠菌群会长出有特征的菌落哦，比如是紫黑色、有金属光泽的菌落。
这就像大肠菌群在平板上给自己盖了个独特的小房子，咱们一眼就能把它们认出来啦。
还有一种是滤膜法。
这个方法就像是给样品里的菌来个大筛选。
把样品通过滤膜过滤，大肠菌群就被截留在滤膜上啦。
然后把滤膜放到含有特定培养基的平皿里培养。
如果有大肠菌群，它们就在滤膜上慢慢长大，形成菌落。
这种方法就像是从一群小伙伴里把大肠菌群这个小群体给挑出来一样。
另外呢，还有平板计数法。
就是把样品直接接种到平板培养基上，然后数长出来的符合大肠菌群特征的菌落个数。
就像数星星一样，一个一个把大肠菌群的菌落数清楚。
检测大肠菌群可重要啦，因为它能反映出环境或者食品的卫生状况呢。
要是大肠菌群超标，那可就说明这个东西不太干净啦，可能会影响咱们的健康。
所以这些检测方法就像是一个个小卫士，帮我们把好健康的关哦。
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我国的国家标准对绝大多数食品都制订了
菌落总数和大肠菌群的指标，并对其数量做了
详细的规定，菌落总数和大肠菌群是食品中安
全性指标，是影响产品质量问题的常见指标，常常受到生产企业和消费者的高度关注，菌落总
数的报告单位是cfu/g（ml），大肠菌群的报告单
位是mpn/100g（ml），那么cfu，mpn是什么含义呢，有的食品微生物检测中菌落总数结果很高
但大肠菌群很低，有关企业对此不太理解，现在将做一下解释说明。
1菌落总数（cfu）
菌落总数是用来判定食品在被加工过程中
被污染的程度及卫生质量的重要指标，食品的
生产加工过程中，卫生质量的高低首先决定食
品原料的来源，原料的卫生与否，是否被污染过，这是根本原因，其次是环境卫生水平的高低，再次就是加工人员和加工工具的卫生状况，要保证食品卫生安全就必须保证所加工的原料
来源，环境，加工工具和人员符合卫生标准，但是如何判定食品生产加工过程中是否符合卫生
要求，以便对被检产品做出一个科学的评价，菌落总数的多少在一定程度上反映出卫生质量的
优劣，也可以用这一方法观察出食品中细菌的
繁殖动态，以便于对被检样品进行卫生评价时
提供科学依据。
菌落总数中的菌落英文意思是（colony），定
义为细菌和其他几种微生物在固体培养基上生
长繁殖而形成的能被肉眼所识别的生长物，它
是由数以万计的相同细菌聚集而成的，故又有
细菌集落之称。
各种细菌的菌落各自具有一定
的特征，按其特征的不同可以在某种程度上鉴
别某种细菌，为卫生检验提供依据，菌落总数是指在被检样品的单位重量（g），体积（ml）或表面积（clni）内所含能于某种固体培养基上在一定
条件下培养后所生成的细菌集落的总数。
其培
养的原理是以检样在被稀释到一定体积后，吸
取一定量的检样，检样中的细菌细胞和培养基
混合后，每个细菌细胞都形成一个肉眼可见的
菌落的假设为基础的，由于检验中采用的是
37℃有氧条件下培养，因而并不能测出每克或
每毫升样品内的实际活菌数，其中的微嗜氧菌，厌氧菌，冷营养菌在此条件下都不能生长，有特殊营养要求的一些细菌的生长也受到了限制，
因此培养的只是一群能在普通营养琼脂中发育
中发育的嗜中温的需氧兼性厌氧的细菌总数，
只有具备每种细菌生长要求的特定的环境条
件，才能将所有细菌全部培养出来，因此要的到
全部的菌落总数应将检样接种到不同的培养基
上，但国家的食品卫生标准对食品中的菌落总
数的规定并不需要接种不同的非选择性培养
基，原因就是标准所规定的数值全部是在37℃
有氧条件下测定得出的。
Cfu是colong forming units的英文缩写，
意思是菌落形成单位数，鉴于食品检样的细菌
细胞是以单个，成双或链状，葡萄状或成堆的形
式存在，因而在营养琼脂出现的菌落可以来源
一个细胞群，也可以是一个单个细胞，因此平板
计数不报告活菌个数，而是以单位重量，体积或
表面积内形成单位数（cfu）报告，cfu/g（ml）表示每克或每毫升样品中含有多少个菌落形成单
位。
2大肠菌群（mpn）
大肠菌群是根据卫生学方面的要求提出的
由于大肠菌群的细菌是动物及人类肠道内常居
微生物，自然界的大肠菌均来自粪便的污染，之
所以对产品卫生状况以大肠菌群来判定依据是
当大肠菌群严重污染时，肠道内致病菌污染的
机会增加，必须看做对人和动物具有潜在的危
险性，所以检验大肠菌群作为判断食品产品是
否被粪便污染的重要指标，由于大肠菌群在微
生物学中的生化特性和血清学方面并非完全一
致，因此为了规范统一定义为一群需氧兼性厌
氧37℃能够发酵乳糖产酸产气革兰氏染色阴
性的无芽孢杆菌，大肠菌群的高低反映加工过
程中粪便污染的程度，是评价产品及食品卫生
质量的重要指标，目前以被世界广泛应用于食
品卫生工作中。
Gb4789.3-2003《大肠菌群的测定》是采用
三个稀释度九管法根据证实为大肠菌群阳性的
发酵管数，查表检索报告每100ml样品中大肠
菌群的最可能数，稀释度的选择是根据对样品
中细菌总数的估算，它是根据样品中大肠菌群
在不同浓度试管中的反应分布情况。
MPN是英
文most probable number的缩写，是对样品中
活菌密度的估计，是一个最可能数，以mpn/
100m（lg）表示，大肠菌群（mpn）越大表示污染越严重，说明产品卫生质量越差。
总之，微生物检验中，由于培养的时间，培
养基，环境温度不同，产生的结果多种多样，大肠菌群是菌落总数所检细菌中的一小类细菌，出现菌落总数很高但大肠菌群数很低的检测结果是很正常的现象。